缺氧條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬和凋亡的影響

馬 迅 李鴻木# 王略力 陶 俊 林喜鋒 華 平 熊利華*

缺氧條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬和凋亡的影響

馬 迅1李鴻木1#王略力2陶 俊1林喜鋒1華 平1熊利華1*

目的探索缺氧狀況下MSC對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)以及對(duì)早期凋亡率的影響。方法構(gòu)建HCAEC與MSC間接共培養(yǎng)模型，實(shí)驗(yàn)分組：共培養(yǎng)組：MSC與HCAEC共培養(yǎng)；單獨(dú)培養(yǎng)組：HCAEC單獨(dú)培養(yǎng)；對(duì)照組：HCAEC使用與共培養(yǎng)組相同的培養(yǎng)基進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)。上述各組分別予常氧（5%CO2，95%空氣）和缺氧（1%O2，5%CO2，94%N2）培養(yǎng)24 h，Western blotting檢測(cè)各組HCAEC細(xì)胞LC3蛋白和Beclin?1蛋白的表達(dá)量，RT?qPCR檢測(cè)各組HCAEC細(xì)胞LC3基因和Beclin?1基因的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HCAEC細(xì)胞早期凋亡率。結(jié)果共培養(yǎng)組與單獨(dú)培養(yǎng)組相比、以及缺氧組與常氧組相比，LC3蛋白和Beclin?1蛋白表達(dá)量均有升高（P＜0.05）。各組間LC3基因和Beclin?1基因的表達(dá)水平?jīng)]有檢測(cè)到明顯差異（P＞0.05）。缺氧組中共培養(yǎng)組的早期凋亡率為（8.86%±1.48%），明顯低于單獨(dú)培養(yǎng)組（15.23%±2.56%）和對(duì)照組（14.49%±3.31%）（P＜0.05）。結(jié)論MSC可以誘導(dǎo)HCAEC產(chǎn)生自噬，并在缺氧狀況下改善HCAEC的生存狀況，減少早期凋亡率。

缺氧；冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；共培養(yǎng)；自噬；凋亡

0 前言

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow?derived mes?enchymal stem cells，BMMSCs）是一群來(lái)源于骨髓組織、具有多項(xiàng)分化能力的非造血多能干細(xì)胞。此類細(xì)胞在經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)和擴(kuò)增后仍保留分化的潛能。近年來(lái)關(guān)于MSC生物治療效應(yīng)的研究十分火熱，基于MSC低免疫原性、多分化性、體外易培養(yǎng)擴(kuò)增及獨(dú)特的歸巢功能等多方面的特點(diǎn)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在應(yīng)用于多種疾病的治療［1-4］、促進(jìn)機(jī)體自我修復(fù)等有良好前景和巨大的潛力。有報(bào)道稱MSC對(duì)于心血管系統(tǒng)亦有類似的治療作用［5］，機(jī)制包括自噬、凋亡、免疫、抑制遷移與侵襲能力等多個(gè)方面。

自噬（autophagy）是細(xì)胞在一般條件和應(yīng)激條件，特別是營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下通過(guò)降解和更新細(xì)胞組件維持細(xì)胞生存的分解代謝過(guò)程。自噬也是某些惡性腫瘤細(xì)胞的生存機(jī)制之一。自噬一般分為三種，分別為巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaper?one?mediated autophagy）、其中巨自噬是細(xì)胞自噬的主要表現(xiàn)形式。Ashford等在1962年的一次肝灌流實(shí)驗(yàn)中首次觀察到自噬現(xiàn)象［6］。在自噬過(guò)程中，自噬體膜形成的初期通過(guò)ATG4（autophagy?related gene4）蛋白切割在胞漿中形成微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3?I），后者在自噬體膜上與Atg3與Atg7活性位點(diǎn)形成硫酯鍵，進(jìn)一步與磷脂結(jié)合形成LC3?PE，即自噬體膜上的LC3?Ⅱ［7］。LC3?Ⅱ與自噬體的形成有著緊密的聯(lián)系，有人發(fā)現(xiàn)去除LC3?Ⅱ會(huì)造成自噬體結(jié)構(gòu)的異常，影響自噬的發(fā)生［8］。因此LC3?II被普遍認(rèn)為是自噬體的標(biāo)記物。自噬相關(guān)蛋白6（ATG 6，或Beclin?1）是核心的自噬調(diào)節(jié)蛋白，該蛋白的上調(diào)總體反映了自噬活動(dòng)度的上升。

缺血缺氧是許多嚴(yán)重心血管疾病中常見(jiàn)的病理現(xiàn)象，亦存在于外科手術(shù)，特別是心臟外科體外循環(huán)手術(shù)中。持續(xù)的缺氧可以造成血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡，血管活性下降。Xu等［9］在研究中發(fā)現(xiàn)缺氧可以誘導(dǎo)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAEC）間充質(zhì)化（endothelial?mesenchymal transition，EndMT），后者則被發(fā)現(xiàn)與心臟纖維化有著明顯關(guān)系［10］。近年來(lái)利用MSC進(jìn)行血管性疾病的生物治療的研究得到了廣泛的重視，而MSC改善缺氧性心血管疾病的機(jī)制尚未完全清楚。本實(shí)驗(yàn)觀察了MSC對(duì)缺氧性血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬以及凋亡的影響，并檢測(cè)了自噬相關(guān)基因的表達(dá)量，和相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化，初步探索缺氧狀況下MSC對(duì)心血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)以及對(duì)早期凋亡率的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑來(lái)源

胎牛血清（Fetal Bovine Serum，Gibco，美國(guó)，澳洲血源），低糖DMEM（Hyclone），內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基EGM?2（endothelial growth medium，LONZA），人LC3A/B，Beclin?1單克隆抗體（Cell Signaling Tech?nology，美國(guó)），鼠抗人CD34，CD105，CD29，HLA?DR流式抗體（BD Pharmingen），Annexin V FITC/PI凋亡試劑盒（eBioscience），Promega GoScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Promega SYBR Green熒光定量PCR試劑盒，引物由上海捷瑞生物有限公司合成。

1.2 人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)

HCAECs（Human Coronary Artery Endothelial Cells）購(gòu)自美國(guó)cell application公司的凍存細(xì)胞株（由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院劉世明教授贈(zèng)送），細(xì)胞接種于EGM?2培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加了氫化可的松（Hydrocortisone）0.04 mg/mL，人表皮生長(zhǎng)因子（human epidermal growth factor，hEGF）0.1 mg/mL，R3胰島素樣生長(zhǎng)因子?1（R3?Insulin?like Growth Factor?1，R3?IGF?1），抗壞血酸（Ascor?bic Acid）0.1 mg/mL，人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子β（uman Fibroblast Growth Factor?Beta，hFGF?β）0.4 mg/mL，肝素（Heparin）0.1 mg/mL，青霉素-G（Peni?cillin?G，PG）100 U/mL，鏈霉素（streptomycin）100 U/mL。胎牛血清濃度為10%。細(xì)胞于復(fù)蘇后24 h內(nèi)貼壁生長(zhǎng)，鏡下觀察細(xì)胞大致呈橢圓形，胞質(zhì)透明，核深染，細(xì)胞間形態(tài)基本一致，各個(gè)細(xì)胞方向不一致，呈鵝卵石狀排列（圖1），當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%～90%密度時(shí)，用0.25%胰酶（0.25%trypsin?EDTA solution，GIBCO，USA）消化（1～2 m）后1∶2傳代，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代后2～3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞再次生長(zhǎng)至80%～90%密度后重復(fù)以上步驟。取3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

hBMMSC來(lái)自中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生物治療中心，從健康的志愿者（18～28歲）體內(nèi)依照標(biāo)準(zhǔn)步驟提?。?1］。流式細(xì)胞術(shù)鑒定CD34，HLA?DR，CD105和CD29表面抗原的表達(dá)以鑒定MSCs。BMMSC接種于低糖DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加了人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子β（Human Fibroblast Growth factor?Beta，hFGF?β）0.05 mg/mL。胎牛血清濃度為10%。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，鋪滿瓶底（細(xì)胞融合90%左右）時(shí)，用0.25%胰酶（0.25% trypsin?EDTA solution，GIBCO，USA）消化（2～3 m）后1：2傳代，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代后2～3天更換一次培養(yǎng)基，直至貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔的底面，再重復(fù)以上操作。取3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 HCAEC/MSC共培養(yǎng)體系的建立

使用Corning costar cell culture transwell inserts（膜孔徑0.4 μm，膜面積4.67 cm2，小室外徑24 mm2）建立HCAECs和MSCs共培養(yǎng)體系，6孔板及tran?swell小室接種前置于37℃培養(yǎng)箱中1 h以上。HCAEC先接種至下層6孔板內(nèi)，加EGM?2完全培養(yǎng)基2.6 mL。過(guò)夜，鏡下觀察細(xì)胞貼壁后，置入transwell小室，將BMMSC接種于上層小室內(nèi)，加入L?DMEM完全培養(yǎng)基1.5 mL。兩種細(xì)胞無(wú)法通過(guò)孔徑0.4 μm的transwell insert膜，但是兩室培養(yǎng)液可通過(guò)該膜交通。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件與分組

正常培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在37℃，95%空氣，5%CO2的普通培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行。缺氧培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在37℃，1%O2，5%CO2，94%N2的缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行。

根據(jù)缺氧/常氧、單獨(dú)/共培養(yǎng)將實(shí)驗(yàn)條件分為6組：

常氧單獨(dú)培養(yǎng)組：HCAEC+EGM

常氧共培養(yǎng)組：HCAEC/BMMSC共培養(yǎng)+EGM/ LG?DEME

常氧對(duì)照組：HCAEC+EGM/LG?DEME

缺氧單獨(dú)培養(yǎng)組：HCAEC+EGM（hypoxia）

缺氧共培養(yǎng)組：HCAEC/BMMSC共培養(yǎng)+EGM/ LG?DMEM（hypoxia）

缺氧對(duì)照組：HCAEC+EGM/LG?DEME（hypoxia）

1.6 RT?qPCR檢測(cè)LC3和Beclin?1的表達(dá)

上述各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同處理以后，提取細(xì)胞的總RNA，使用熒光分光光度計(jì)Nano drop 3300測(cè)定濃度，A260/A280控制在1.9～2.1之間。取8 μg總RNA，按照Promega GoScript（Promega，美國(guó)）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行cDNA的合成。PCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性70℃5 min，退火25℃5 min，延伸42℃60 min，失活MLV 70℃15 min。得到的cDNA產(chǎn)物于-20℃保存。使用Promega公司的RT?PCR試劑盒，應(yīng)用SYBR Green染料法，取2 μL反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行RT?PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，45個(gè)循環(huán)。熔解曲線：95℃5 s，65℃1 min，97℃30 s。數(shù)據(jù)運(yùn)用Excel，應(yīng)用2-ΔΔCt方法相對(duì)定量mRNA的表達(dá)量，各組目的基因經(jīng)過(guò)與內(nèi)參基因比較后，再分別與常氧單獨(dú)培養(yǎng)組基因表達(dá)量比較。

圖1 HCAECs復(fù)蘇后第二天（40×）

表1 引物序列

1.7 western blot檢測(cè)各組LC3和Beclin?1蛋白的表達(dá)情況

上述各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)對(duì)應(yīng)處理后，棄去培養(yǎng)基經(jīng)預(yù)冷PBS洗滌后加入胰酶（trypsin，0.25%）消化后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中離心，棄上清后PBS洗滌，再次離心，棄上清，按照1×106細(xì)胞加入100 μL裂解液，冰上裂解40 min，離心后取上清為細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整各組上樣量為15 μg，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，條件：75 V 20 min，100 V 50 min。轉(zhuǎn)膜條件：0.1 A 250 W，300 V，90 min。轉(zhuǎn)膜后，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，兔抗人LC3A/B抗體（1∶1000）、BECLIN?1抗體（1∶1000）（Cell Signaling Technology，美國(guó)），4℃孵育過(guò)夜；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（1∶3000）（Cell Signaling Technology，美國(guó)）孵育1 h。PBST洗膜后，用Fluor ChemQ成像系統(tǒng)顯示相應(yīng)蛋白條帶，照相。利用ImageJ圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值后SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞早期凋亡情況

細(xì)胞經(jīng)過(guò)上述各組處理后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞早期凋亡情況。檢測(cè)當(dāng)日消化細(xì)胞，收集于離心管中1000 r/min離心5 min，棄上清，加入4℃預(yù)冷PBS 2 mL重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至流式專用玻璃管內(nèi)離心1000 r/min 5 min，棄上清。加入試劑盒專用Binding buffer（BD Biosciences）400 μL重懸細(xì)胞，將細(xì)胞分成兩管，其中一管不加任何試劑作為空白對(duì)照。加入Annexin V FITC（eBioscience，美國(guó)）5 μL，避光室溫孵育15 min，加入PI（Propidium lodide，碘化丙錠，eBIoscience）10 μL，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析（BD FACSVerse流式檢測(cè)儀，BD Biosciences，美國(guó)）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 20.0軟件處理，數(shù)據(jù)以mean±SD表示，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，之后根據(jù)數(shù)據(jù)類型采用ANOVA分析或獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為各組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

細(xì)胞傳代后24 h內(nèi)貼壁，鏡下觀察胞體較大，呈長(zhǎng)梭形，胞核色深（圖2），后貼壁細(xì)胞逐漸增多，3～4 d形成集落，彼此相連，表現(xiàn)出方向一致性，呈旋渦狀、輻射狀、網(wǎng)狀排列。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞CD34，HLA?DR為陰性，而CD105和CD29為陽(yáng)性（表達(dá)率分別為81.69%和99.96%），可以表明該細(xì)胞為MSCs（圖3）。

圖2 傳代后第一天的MSC（40×）

2.2 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞LC3蛋白和Beclin?1蛋白的表達(dá)量

我們利用Western blot檢測(cè)了經(jīng)過(guò)各組處理后細(xì)胞的LC3蛋白（圖4）與Beclin?1蛋白（圖5）含量，結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組與單獨(dú)培養(yǎng)組相比、以及缺氧組與常氧組相比，兩種蛋白表達(dá)量均有升高（P＜0.05），這兩種處理均誘導(dǎo)了HCAEC自噬的發(fā)生。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果

圖4 各組LC3蛋白表達(dá)量比較（LC3?II/內(nèi)參蛋白）

圖5 各組Beclin?1蛋白表達(dá)量

2.3 RT?qPCR檢測(cè)各組HCAEC細(xì)胞LC3基因和Beclin?1基因的表達(dá)水平

利用RT?qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞LC3、Beclin?1基因mRNA表達(dá)情況（圖6、7），結(jié)果提示共培養(yǎng)組LC3、Beclin?1基因mRNA表達(dá)量與正常培養(yǎng)組對(duì)比未見(jiàn)明顯變化，這表明MSC并未在mRNA水平上影響HCAEC的自噬基因表達(dá)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞早期凋亡情況

對(duì)比可發(fā)現(xiàn)缺氧組（D、E、F）與常氧組（A、B、C）相比早期凋亡率明顯上升，缺氧組中共培養(yǎng)組（F）的早期凋亡率為（8.86%±1.48%），明顯低于單獨(dú)培養(yǎng)組（D）（15.23%±2.56%）和對(duì)照組（E）（14.49%±3.31%）（P＜0.05），而D和E之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

圖6 各組Beclin?1基因表達(dá)情況

圖7 各組LC3基因表達(dá)情況

圖8 各組細(xì)胞早期凋亡情況

3 討論

心血管疾?。ㄈ绻谛牟。┛梢栽斐刹煌潭鹊慕M織、器官的缺氧，特別是需要進(jìn)行心臟外科體外循環(huán)手術(shù)的病人從發(fā)病、手術(shù)、到術(shù)后整個(gè)過(guò)程中都會(huì)經(jīng)歷冠脈血管缺氧的過(guò)程，已有文獻(xiàn)表明血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞活性下降，內(nèi)皮功能障礙，從而影響冠脈供血心肌的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，加上冠心病需冠脈搭橋的病人通常心肌對(duì)于缺血缺氧等應(yīng)激情況的抗打擊能力相當(dāng)薄弱，越來(lái)越多的人開(kāi)始關(guān)注缺氧導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷以及帶來(lái)的一系列后果。

有研究表明BMMSC存在較高的免疫抑制能力［12］。BMMSC在被移植到心臟表面時(shí)可能以旁分泌的形式釋放或誘導(dǎo)釋放抗炎、組織修復(fù)、血管生成等相關(guān)的因子，包括TIMP1、IGF1、VCAM1、SDF1A、HIF1A和MMP2［13］。因此，心功能的改善可能與MSC的免疫抑制及抗炎作用有關(guān)。但是，MSC對(duì)于心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用并不只有免疫調(diào)節(jié)功能。

本次結(jié)果顯示，缺氧培養(yǎng)和BMMSC與HCAEC共培養(yǎng)可以使HCAEC的LC3蛋白和Beclin?1蛋白表達(dá)量上調(diào)，二者共同作用的結(jié)果則是使兩種蛋白的表達(dá)量進(jìn)一步上調(diào)。在正常對(duì)照組與缺氧單獨(dú)培養(yǎng)組的對(duì)比中，我們可以發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)自噬的同時(shí)HCAECs的早期凋亡率上升，而在共培養(yǎng)組與單獨(dú)培養(yǎng)組，特別是缺氧條件下的共培養(yǎng)組與單獨(dú)培養(yǎng)組的對(duì)比中，自噬的上調(diào)的同時(shí)HCAECs的早期凋亡率明顯下降，這可能表明BMMSC誘導(dǎo)的自噬與缺氧誘導(dǎo)的自噬對(duì)于改善HCAECs缺氧微環(huán)境的效應(yīng)有所不同。但同時(shí)亦有文獻(xiàn)表明，抑制Beclin?1的表達(dá)可以避免過(guò)度的自噬對(duì)于心肌細(xì)胞的損害［14］，因此我們猜測(cè)這可能是由于BMMSC對(duì)于不同種細(xì)胞的影響的差異，亦或是BMMSC在不同的應(yīng)激情況和水平下具有不同的效應(yīng)。Beclin?1蛋白可能受到多種因素的調(diào)控，包括miRNA，磷酸化/去磷酸化，蘇素化/去蘇素化，乙?；?去乙?；头核鼗到獾牡鞍捉到庹{(diào)節(jié)［15］。因此對(duì)于缺氧誘導(dǎo)自噬與BMMSC誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生不同效應(yīng)的原因，我們猜測(cè)可能是由于這兩者誘導(dǎo)的自噬過(guò)程中存在的調(diào)控方式有差異。RT?qPCR的結(jié)果則表明這兩者對(duì)于自噬的調(diào)控并非在于基因轉(zhuǎn)錄的層面，而是在于蛋白水平的變化。由于Beclin?1?PI3K III復(fù)合體在早期自噬體形成時(shí)參與募集下游相關(guān)蛋白，因此Beclin?1蛋白與LC3蛋白的表達(dá)量上調(diào)可能存在一定的聯(lián)系。

BNIP3作為凋亡相關(guān)Bcl?2蛋白家族的成員之一，是屬于僅含有BH?3結(jié)構(gòu)域的BH3?only亞族。缺氧時(shí)可檢測(cè)到Bnip3蛋白的上調(diào)［16，17］。許多研究亦表明Bnip3蛋白可以誘導(dǎo)多種不同細(xì)胞的自噬上調(diào)，包括心血管系統(tǒng)的細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道Bnip3蛋白過(guò)表達(dá)顯著地誘導(dǎo)HL?1心肌細(xì)胞［17］和成人心肌細(xì)胞自噬的發(fā)生。而顯性抑制（突變無(wú)功能）的Bnip3蛋白的過(guò)表達(dá)則減少了模擬I/R的HL?1細(xì)胞的自噬水平，說(shuō)明了Bnip3在這一類缺血缺氧過(guò)程中的自噬的誘導(dǎo)過(guò)程中有著重要的作用［18］。Zhang等人則發(fā)現(xiàn)缺氧過(guò)程中自噬的誘導(dǎo)需要通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor?1，HIF?1）介導(dǎo)Bnip3的生成［19］。該研究還表明，HIF?1在調(diào)節(jié)Bnip3生成的同時(shí)還通過(guò)ATG5和Bcelin?1負(fù)性調(diào)節(jié)缺氧狀況下細(xì)胞線粒體的質(zhì)量，誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生［19］。他們推斷Bnip3可能通過(guò)誘導(dǎo)線粒體的損傷、線粒體自噬的發(fā)生從而去除受損的細(xì)胞器。Arad等人的研究則表明了Bnip3的siRNA表達(dá)減少了缺氧誘導(dǎo)自噬的水平［20］。然而，Papandreau等人在研究中卻發(fā)現(xiàn)，在癌細(xì)胞系中缺氧誘導(dǎo)的自噬卻并不依賴于Bnip3的表達(dá)，而是與AMPK的（Adenosine 5′?monophos?phate?activated protein kinase，AMP依賴性蛋白激酶）激活有關(guān)［21］。Bnip3與缺氧誘導(dǎo)自噬到底存在怎樣的關(guān)系，這有待更多的后續(xù)研究來(lái)揭示。

Beclin?1蛋白是Bcl?2同源的僅含有BH?3結(jié)構(gòu)域的蛋白，最初是存在于細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體以及核周膜上［22］。Beclin?1蛋白作為自噬途徑之一的PI3K III復(fù)合物中的一員，參與了自噬體的形成和介導(dǎo)下游自噬相關(guān)蛋白在吞噬泡（phago?hore）膜上聚集［23］，因此在自噬過(guò)程中占有核心的地位。多項(xiàng)研究表明，自噬過(guò)程中Beclin?1蛋白的表達(dá)受到包括NFKB（Nuclear factor kB，核因子kB），E2F轉(zhuǎn)錄因子和miRNA在內(nèi)的多種因素調(diào)控［24，25］。另外，Wang等人在多種細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)ERK（extracellular）信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)Beclin?1的活性參與了自噬的誘導(dǎo)。在MSC誘導(dǎo)自噬的機(jī)制研究方面，Shin等首次在一個(gè)阿爾茲海默?。ˋD）模型中發(fā)現(xiàn)了MSC通過(guò)正性調(diào)節(jié)Beclin?1蛋白表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞自噬水平［26］，但并沒(méi)有明確指出該種調(diào)節(jié)與任何自噬調(diào)節(jié)信號(hào)通路存在關(guān)聯(lián)。碰巧的是，Sanchez等人在發(fā)現(xiàn)MSC對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生存起到一個(gè)提供細(xì)胞外基質(zhì)支撐的作用的同時(shí)，亦發(fā)現(xiàn)MSC通過(guò)增強(qiáng)包括Beclin?1在內(nèi)的自噬關(guān)鍵調(diào)控蛋白的表達(dá)來(lái)維持癌細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)缺乏情況下的生存［27］。由此看來(lái)，Beclin?1蛋白的上調(diào)可能是MSC通過(guò)自噬（準(zhǔn)確來(lái)說(shuō)是通過(guò)自噬體的形成）改善細(xì)胞生存的一個(gè)重要手段。

綜上所述，BMMSC可誘導(dǎo)HCAECs產(chǎn)生自噬效應(yīng)，使LC3蛋白及Beclin?1蛋白表達(dá)量上調(diào)，并在缺氧條件下可改善HCAECs的早期凋亡率，但其機(jī)制并不十分明確，需要進(jìn)一步增加檢測(cè)手段以及上下游蛋白、基因的變化情況，運(yùn)用各種檢測(cè)手段更加直觀地觀察自噬/自噬流的變化趨勢(shì)。BMMSC誘導(dǎo)自噬與應(yīng)激條件下誘導(dǎo)自噬對(duì)HCAECs產(chǎn)生的效應(yīng)不同，其中究竟存在何種分子機(jī)制的差異，有待于進(jìn)一步深入研究，為MSC應(yīng)用于改善心血管疾病預(yù)后提供理論支持。

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Effect of bone marrow?derived mesenchymal stem cells on autophagy and apoptosis of human coronary artery endothelial cells under hypoxia condition

MA Xun1，LI Hongmu1，WANG Lueli2， TAO Jun1，LIN Xifeng1，HUA Ping1，XIONG Lihua1.1Department of Cardiac Surgery，Sun Yat?sen Memori?al Hospital，Sun Yat?Sen University，Guangzhou 510120，China；2Department of Cardiacvascular Surgery，Yan An Hospital，Kunming 650051，China.Corresponding author：XIONG Lihua，lihuax211@126.com

ObjectiveTo investigate whether mesenchymal stem cells lead to induction of autophagy and change at early apoptotic rate under hypoxia condition on coronary artery endothelial cells. MethodsWe constructed the co?culture model of HCAECs（human coronary artery endothelial cells）and hBMMSCs（human bone marrow?derived mesenchymal stem cells）.In experiment group，HCAEC co?cultured with MSC，HCAEC cultured alone in blank group.And in control group，HCAEC cultured alone using same medium with experiment group.Each group separately cultured 24 h under nomoxia（5%CO2，95%air）and hypoxia（1%O2，5%CO2，94%N2）condition.The HCAEC′s expression of LC3 and Beclin?1 at mRNA and protein level was detected by Real?Time PCR and Western blotting，respectively.Flow cytometry was used to detect early apoptotic rate.ResultsThe protein expression of LC3 and Beclin?1 in co?culture groups and hypoxia groups significantly higher than separate culture groups and nomoxia groups respectively（P＜0.05），while mRNA expression of LC3 and Beclin?1 in each group shows no difference（P＞0.05）.The early apoptotic rate of co?culture group under hypoxia was 8.86%±1.48%，which was significantly lower than those in separate culture group under hypoxia and con?trol group under hypoxia（15.23%±2.56%and 14.49%±3.31%，P＜0.05）.ConclusionMSC induces autophagy in HCAEC，along with decrease of early apoptosis rate of HCAEC under hypoxia condition.

bone marrow?derived mesenchymal stem cells；autophagy；hypoxia；human coronary artery endothelial cells；co?culture；apoptosis

R681.5

A

10.3969/j.issn.1009?976X.2017.02.002

2017?02?18）

廣東省自然科學(xué)基金（06021339）

1510120廣州中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院心臟外科；2650051昆明昆明市延安醫(yī)院心臟大血管外科#共同第一作者

*通訊作者：熊利華，E?mail：lihuax211@126.com