晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的變化

胡夢(mèng)蝶 周立艷 王曉藝 王 維 任 萌 嚴(yán) 勵(lì)

晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的變化

胡夢(mèng)蝶 周立艷 王曉藝 王 維 任 萌 嚴(yán) 勵(lì)*

目的探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）在晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞與正常皮膚成纖維細(xì)胞中表達(dá)譜的差異。方法利用lncRNA芯片技術(shù)檢測(cè)AGEs誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞與正常皮膚成纖維細(xì)胞中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的變化，經(jīng)過(guò)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，篩選出差異表達(dá)lncRNA。結(jié)果與正常培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞相比較，24 h AGEs誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞中差異表達(dá)的lncRNA有3421條，其中1079條表達(dá)上調(diào)，2342條表達(dá)下調(diào)，差異表達(dá)達(dá)10倍以上的lncRNA有448條，其中208條表達(dá)上調(diào)，240條表達(dá)下調(diào)。結(jié)論與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比較，AGEs誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞的lncRNA的表達(dá)譜發(fā)生了顯著的變化，提示lncRNA可能參與了糖尿病皮膚病變的發(fā)生、發(fā)展。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA；晚期糖基化終末產(chǎn)物；皮膚成纖維細(xì)胞；糖尿病皮膚病變；糖尿病足

糖尿病皮膚病變是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，糖尿病患者的皮膚極易損傷，而且損傷后往往遷延不愈，形成慢性難愈性潰瘍。糖尿病足潰瘍是糖尿病皮膚病變的主要表現(xiàn)，也是導(dǎo)致糖尿病病人截肢的重要原因，給患者和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)［1，2］。作為構(gòu)成皮膚真皮層的主要細(xì)胞，皮膚成纖維細(xì)胞在創(chuàng)面愈合、組織重塑等方面發(fā)揮了重要的作用［3］。研究表明，葡萄糖和血漿中蛋白質(zhì)通過(guò)非酶糖基化反應(yīng)，形成晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGEs），其可通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和分泌能力，增加成纖維細(xì)胞的凋亡、自噬［4，5］，從而延緩傷口的愈合［6］。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt的RNA。lncRNA不具有蛋白編碼能力，但可在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)［7］。研究表明，lncRNA廣泛參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8］。近年來(lái)的研究表明，lncRNA參與調(diào)控胰島β細(xì)胞的分化和成熟［9］，并且其異常表達(dá)與糖尿病心肌?。?0］、糖尿病視網(wǎng)膜病變［11］和糖尿病腎?。?2］等多種糖尿病并發(fā)癥相關(guān)。目前尚未見(jiàn)到lncRNA在糖尿病皮膚病變中的相關(guān)報(bào)道。本研究以AGEs模擬糖尿病環(huán)境，利用lncRNA芯片比較AGEs作用下的皮膚成纖維細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜的變化，為探討lncRNA在糖尿病皮膚病變中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠皮膚成纖維細(xì)胞株（CRL?1213）購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（American type culture col?lection，ATCC）；胎牛血清購(gòu)于Corning公司；DMEM培養(yǎng)基，Trizol試劑購(gòu)于Invitrogen公司；AGE?BSA購(gòu)于Merck Millipore公司；Rat LncRNA V2.0 Microar?ray為Arraystar公司產(chǎn)品；mRNA?ONLYTMEukaryot?ic mRNA Isolation Kit購(gòu)自Epicentre公司；RNeasy Mini Kit購(gòu)自QiAGEsn公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于含5%CO2的37℃恒溫箱中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞以3× 105個(gè)/孔接種于六孔板中，貼壁后待細(xì)胞融合達(dá)60～70%時(shí)加入AGE?BSA（終濃度為200 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，對(duì)照組以200 μg/mL BSA培養(yǎng)24 h，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各設(shè)3個(gè)平行。

1.2.2 細(xì)胞總RNA的提取及檢測(cè)按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，使用Nanodrop?1000紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA在230 nm、260 nm和280 nm的吸光度值，評(píng)估RNA量和質(zhì)量，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)變性凝膠電泳評(píng)估RNA完整性。

1.2.3 RNA標(biāo)記和芯片雜交根據(jù)Agilent One?Color Microarray?Based Gene Expression Analysis（Agilent Technology）實(shí)驗(yàn)方案執(zhí)行。使用mRNA?ONLYTMEukaryotic mRNA Isolation Kit從總RNA中移除rRNA后，得到mRNA；設(shè)計(jì)隨機(jī)引物使樣品放大并轉(zhuǎn)錄成帶熒光的cRNA；通過(guò)RNeasy Mini Kit純化標(biāo)記的cRNAs，并用NanoDrop ND?1000檢測(cè)濃度和活性；利用雜交試劑盒將標(biāo)記好的探針與芯片進(jìn)行雜交；雜交后進(jìn)行芯片洗滌、固定。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析使用Agilent DNA Microarray Scanner對(duì)雜交后的芯片進(jìn)行掃描得到圖像，使用Agilent Feature Extraction v11.0.1.1軟件對(duì)芯片圖讀值并獲得原始數(shù)據(jù)。使用GeneSpring GX v12.1軟件對(duì)獲得的基因芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，篩選高質(zhì)量探針（某探針在6個(gè)樣品中至少有1個(gè)被標(biāo)記為Present或Marginal）進(jìn)行進(jìn)一步分析。同一lncRNA或mRNA在兩組之間表達(dá)差異超過(guò)2倍，并且經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)P值小于0.05被認(rèn)定存在差異表達(dá)，根據(jù)差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行GO和KEGG Pathway分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芯片雜交結(jié)果

芯片數(shù)據(jù)篩選結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，24 h AGEs誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞中有3421條lncRNA存在表達(dá)差異，其中1079條表達(dá)上調(diào)，2342條表達(dá)下調(diào)，差異表達(dá)10倍以上的lncRNA有448條，其中208條表達(dá)上調(diào)，240條表達(dá)下調(diào)。

2.2 lncRNA子類(lèi)分析

2.2.1 差異反義lncRNA（antisense lncRNA）與相應(yīng)mRNA聯(lián)合分析在差異表達(dá)的lncRNA中，有44條lncRNA為antisense lncRNA（20條表達(dá)上調(diào)，24條表達(dá)下調(diào)），這些antisense lncRNA可能通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控正義（sense）mRNA的表達(dá)（表1），從而發(fā)揮生物學(xué)功能。

2.2.2 差異基因間lncRNA（long intergenic noncod?ing RNA，lincRNA）與鄰近mRNA聯(lián)合分析在差異表達(dá)的lncRNA中，有422條lncRNA為lincRNA（213條表達(dá)上調(diào)，209條表達(dá)下調(diào)），這些lincRNA可能通過(guò)調(diào)控鄰近mRNA（＜300 kb）的表達(dá)（表2），從而發(fā)揮生物學(xué)功能。

2.3 差異mRNA的GO分析和pathway分析

2.3.1 GO分析上調(diào)的mRNA中，細(xì)胞因子活性（cytokine activity）是富集程度最高的分子功能，細(xì)胞通訊（cell communication）是富集程度最高的生物過(guò)程，細(xì)胞質(zhì)膜（plasma membrane）是富集程度最高的細(xì)胞組分；下調(diào)的mRNA中，G蛋白偶聯(lián)受體活性（G?protein coupled receptor activity）是富集程度最高的分子功能，G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路（G?protein coupled receptor signaling pathway）是富集程度最高的生物過(guò)程，細(xì)胞質(zhì)膜（plasma mem?brane）是富集程度最高的細(xì)胞組分。

2.3.2 KEGG pathway分析在上調(diào)的mRNA中，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（Cytokine?cyto?kine receptor interaction）為富集程度最高的通路（圖1），在下調(diào)的mRNA中，嗅覺(jué)傳導(dǎo)（Olfactory transduction）為富集程度最高的通路（圖2）。

表2 差異lincRNA與鄰近mRNA聯(lián)合分析（lncRNA差異倍數(shù)＞50倍）

3 討論

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活方式的改變以及壽命的延長(zhǎng)，糖尿病患病率急劇增加，隨之而來(lái)的糖尿病各種慢性并發(fā)癥的發(fā)生率也逐年增加。糖尿病足是糖尿病的主要慢性并發(fā)癥之一，也是糖尿病致殘致死的重要原因。長(zhǎng)期高血糖造成的皮膚局部微環(huán)境的改變與外周血管病變和外周神經(jīng)病變等因素共同導(dǎo)致的糖尿病皮膚病變是糖尿病足的發(fā)病基礎(chǔ)［13］。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者雖然經(jīng)治療后血糖已降至正常或接近正常，仍然容易發(fā)生糖尿病的慢性并發(fā)癥，這是由于患者在確診糖尿病之前就已經(jīng)出現(xiàn)糖耐量異常，機(jī)體隨之形成了代謝性記憶。這種現(xiàn)象被稱(chēng)為血糖的“代謝記憶效應(yīng)”［14］。高血糖的代謝記憶效應(yīng)發(fā)生機(jī)制目前仍不清楚，表觀遺傳調(diào)控可能通過(guò)影響代謝性記憶的發(fā)生而參與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制［15］。表觀遺傳調(diào)控包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、非編碼RNA調(diào)控等等。占非編碼RNA絕大部分的lncRNA曾被認(rèn)為是進(jìn)化過(guò)程中無(wú)功能的“垃圾序列”，是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能，然而，隨著研究的深入，已發(fā)現(xiàn)lncRNA可在多個(gè)層面上廣泛參與細(xì)胞增殖、分化乃至個(gè)體發(fā)育等多種重要的生理過(guò)程，并與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8］。

目前關(guān)于lncRNA的研究多集中在腫瘤領(lǐng)域，在糖尿病及其并發(fā)癥的領(lǐng)域還很少。Moran等［9］首次全面的報(bào)道了人類(lèi)胰島β細(xì)胞的lncRNA表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)lncRNA的表達(dá)具有階段特異性的特點(diǎn)，這提示了lncRNA可能參與調(diào)控β細(xì)胞的分化和成熟。進(jìn)而該研究確定了一條人胰島β細(xì)胞特異表達(dá)的lncRNA?HI?LNC25，其能夠正向調(diào)節(jié)胰島轉(zhuǎn)錄因子GLIS3的mRNA，提示lncRNA可能參與調(diào)控胰島β細(xì)胞的功能［9］。此外，lncRNA βlinc1可通過(guò)協(xié)同調(diào)控特異性的胰島β細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子從而影響β細(xì)胞功能［16］。

圖1 上調(diào)的mRNA富集程度最高的10條通路

圖2 下調(diào)的mRNA富集程度最高的10條通路

在lncRNA與糖尿病并發(fā)癥方面的研究，目前已發(fā)現(xiàn)lncRNA參與糖尿病心肌病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病以及糖尿病神經(jīng)病變等多種糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。糖尿病心肌病方面，MALAT1在糖尿病大鼠心肌組織中特異性高表達(dá)，下調(diào)MALAT1的表達(dá)可增加大鼠左心室的收縮功能［10］。糖尿病視網(wǎng)膜病變方面，運(yùn)用lncRNA芯片篩選糖尿病小鼠視網(wǎng)膜差異表達(dá)的lncRNA，發(fā)現(xiàn)在早期糖尿病視網(wǎng)膜病變有303條lncRNA差異表達(dá)，其中214條表達(dá)下調(diào)，89條表達(dá)上調(diào)，GO分析以及KEGG分析顯示，這些差異表達(dá)的lncRNA主要參與了眼靶向發(fā)育、膜的完整性、結(jié)構(gòu)分子活性等過(guò)程［17］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1在內(nèi)皮細(xì)胞中豐富表達(dá)，可通過(guò)p38/MAPK信號(hào)通路影響視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的功能和血管的新生［11，18］。糖尿病腎病方面，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，lncRNA CYP4B1?PS1?001與PVT1都參與了系膜細(xì)胞的增殖與纖維化，介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的積累［12，19］，而lncRNA MIAT則可介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮損傷［20］。這些lncRNA均參與了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。

本研究通過(guò)體外建立糖尿病皮膚細(xì)胞模型，以AGEs作用24 h的皮膚成纖維細(xì)胞模擬糖尿病皮膚狀態(tài)，以正常培養(yǎng)下的成纖維細(xì)胞作為對(duì)照，分析AGEs誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜的變化。已有研究證實(shí)，AGEs可抑制皮膚成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和分泌能力，增加成纖維細(xì)胞的凋亡和自噬水平［4-6］，使糖尿病患者皮膚組織發(fā)生一定程度的病理生理改變，導(dǎo)致自發(fā)性潰瘍的發(fā)生且延緩愈合。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AGEs能引起成纖維細(xì)胞中3421條的lncRNA發(fā)生顯著變化，其中差異表達(dá)10倍以上的lncRNA有448條，提示這些lncRNA可能參與影響皮膚成纖維細(xì)胞的各種生物學(xué)功能，在糖尿病皮膚病變中發(fā)揮了一定的作用。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們將對(duì)lncRNA進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)行進(jìn)一步的功能研究，探討lncRNA是否參與了AGEs誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為改變的過(guò)程，并通過(guò)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)lncRNA可能的靶基因，并進(jìn)行驗(yàn)證，以期闡明lncRNA在糖尿病皮膚病變中的作用。

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Expression profiles of long noncoding RNA in advanced glycosylation end products treateddermal fibroblast

HU Mengdie，ZHOU Liyan，WANG Xiaoyi，WANG Wei，REN Meng，YAN Li.Department of Endocrinology and Metabolism，Sun Yat?sen Memorial Hospital，Sun Yat?sen University，Guangzhou，510120，China.Corresponding author：YAN Li，hfxyl@163.net

ObjectiveTo explore the expression profile variation of long noncoding RNA（IncRNA）in advanced glycosylation end products（AGEs）treated dermal fibroblast compared with normal dermal fibroblast.MethodsThe differences of lncRNA expression profile between AGEs treated fibroblast and normal fibroblast were analyzed through lncRNA microarray.LncRNA with differential expression were screened out after pretreatment of raw data.ResultsCompared with normal fibroblast，3421 lncRNAs were identified to be different expression（fold change≥2.0）in AGEs treated fibroblast. 1079 were up?regulated and 2342 were down?regulated.448 lncRNAs（208 up?regulated and 240 down?regulated）were highly differentially expressed with absolute fold change greater than ten. ConclusionThe expression profile of lncRNA in AGEs treated fibroblast was significantly changed in comparsion with normal fibroblast.These lncRNA may be involved in the occurrence and development of diabetic dermopathy.

long noncoding RNA；advanced glycosylation end products；dermal fibroblast；diabetic dermopathy；diabetic foot

R394-3

A

10.3969/j.issn.1009?976X.2017.02.001

2017-03-10）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81471034，81670764）

510120廣州中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院內(nèi)分泌科

*通訊作者：嚴(yán)勵(lì)，Email：hfxyl@163.net