• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    膀胱尿路上皮癌組織Livin和BCL-2的表達及其相關(guān)性研究

    2017-05-02 06:53:52楊立軍鄭文武周安傳蘇曉哲吳亞東李珅
    河北醫(yī)藥 2017年8期
    關(guān)鍵詞:尿路膀胱癌上皮

    楊立軍 鄭文武 周安傳 蘇曉哲 吳亞東 李珅

    ·論著·

    膀胱尿路上皮癌組織Livin和BCL-2的表達及其相關(guān)性研究

    楊立軍 鄭文武 周安傳 蘇曉哲 吳亞東 李珅

    目的 探討Livin與BCL-2在膀胱尿路上皮癌及癌旁組織中的蛋白表達水平及二者在膀胱尿路上皮癌中的相關(guān)關(guān)系,分析其致癌機制,為膀胱尿路上皮癌的診斷及臨床治療提供理論依據(jù)。方法 用流式細胞分析技術(shù)檢測90例膀胱尿路上皮癌及對應(yīng)的90例癌旁組織,及20例正常膀胱粘膜移行上皮組織中的Livin、BCL-2蛋白的表達。90例膀胱尿路上皮癌中,男66例,女24例,年齡26~68(平均50.24±9.87)歲。按照WHO病理分級:G124例,G240例,G326例;TNM臨床分期診斷標(biāo)準(zhǔn):非浸潤性癌(Ta-1期)38例,浸潤性癌(T2-4期)52例;單發(fā)48例,多發(fā)42例;初發(fā)54例,復(fù)發(fā)36例;20例正常對照為前列腺增生癥、膀胱結(jié)石患者經(jīng)膀胱手術(shù)所取膀胱黏膜組織,均經(jīng)病理檢查證實為正常膀胱黏膜組織。將表達結(jié)果進行分析。結(jié)果 Livin在正常膀胱組織中不表達。于癌旁組織中亦無表達。Livin在膀胱尿路上皮癌組織中陽性率為71.11%,其中陽性64例,陰性26例。Livin的蛋白表達與細胞的凋亡率呈負相關(guān)。BCL-2陽性表達結(jié)果 膀胱癌癌組織(51.11%)與癌旁組織(73.33)BCL-2的表達差異有顯著性 (P<0.05)。90例膀胱尿路上皮癌中46例BCL-2蛋白表達陽性,陽性率為51.11%,與正常膀胱粘膜陽性表達率10%比較,陽性率明顯上升(P<0.05)。Bcl-2的蛋白表達與細胞的凋亡率呈負相關(guān)。在膀胱尿路上皮癌中Livin與BCL-2表達有密切關(guān)系 ,在膀胱癌BCL-2的表達隨著膀胱腫瘤的分化程度越差陽性表達就增加 ,而Livin蛋白的表達亦明顯增加 ,呈現(xiàn)正相關(guān) (P<0.05)。結(jié)論 細胞凋亡抑制因子Livin在膀胱尿路上皮癌組織中表達上調(diào),并且與凋亡率呈負相關(guān),提示Livin可能通過抑制細胞凋亡,對膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用,有望成為一種有效、敏感的腫腫瘤標(biāo)志物志物,并為膀胱尿路上皮癌的基因治療提供新的靶點。Livin與BCL-2在膀胱尿路上皮癌細胞凋亡的調(diào)控方面可能起著協(xié)同作用。

    Livin:BCL-2:膀胱尿路上皮癌:癌旁:蛋白表達:流式細胞分析技術(shù)

    膀胱癌正式名稱為膀胱尿路上皮細胞癌(TCC),是泌尿生殖 系腫瘤中最常見的腫瘤,近年發(fā)病有增加趨勢。男性發(fā)病率約為女性的3~4倍,發(fā)病年齡以51~70歲為多,臨床最常見的首發(fā)癥狀是血尿,而且表現(xiàn)為間隙性、無痛性血尿為主。目前研究表明,腫瘤發(fā)生是細胞增殖因子與細胞凋亡因子失衡所致,受多種因素控制。凋亡抑制蛋白(IAP)是一類內(nèi)源性抑制因子,其高表達引起凋亡不足,與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切。Livin是一種新近發(fā)現(xiàn)的IAP成員,其作用機制主要通過直接抑制procaspase或caspase來抑制細胞凋亡。BCL-2通過對線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、死亡受體通路的調(diào)控,來抑制細胞凋亡。本文用流式細胞分析技術(shù)研究Livin與BCL-2在膀胱尿路上皮癌、癌旁組織中的蛋白表達水平及二者在膀胱尿路上皮癌中的相關(guān)關(guān)系,為膀胱尿路上皮癌的診斷及臨床治療提供理論方向。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 標(biāo)本取自2012至2013年我院泌尿外科手術(shù)治療的住院患者,檢測90例膀胱尿路上皮癌及對應(yīng)的90例癌旁組織,20例正常膀胱粘膜組織中的Livin、Bcl-2蛋白的表達水平。90例膀胱尿路上皮癌患者中,術(shù)后均經(jīng)病理證實為膀胱尿路上皮癌,其中男66例,女24例;年齡26~68歲,平均(50.24±9.87)歲。按照WHO病理分級:G124例,G240例,G326例;TNM臨床分期診斷標(biāo)準(zhǔn):非浸潤性癌(Ta-1期)38例,浸潤性癌(T2-4期)52例;單發(fā)48例,多發(fā)42例;初發(fā)58例,復(fù)發(fā)32例;20例正常對照為經(jīng)膀胱手術(shù)所取的前列腺增生癥、膀胱結(jié)石的膀胱黏膜組織,均經(jīng)病理證實為正常膀胱黏膜組織。標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定。

    1.2 試劑與儀器

    1.2.1 試劑:鼠抗人Livin單克隆抗體(工作濃度1∶700),美國NEOMARKERS公司;兔抗人Bcl-2多克隆抗體,SantaCruz公司;hanks(緩沖液),百浩生物科技有限公司;AlexaFiuor488(異硫氰酸熒光素),Proteintech公司;胃蛋白酶工作液,上海易欣生物科技有限公司。

    1.2.2 儀器:BDFACSEALIBUR流式細胞儀BDBioscience公司(U.S.A)。

    1.3 試驗方法 應(yīng)用流式細胞分析技術(shù)檢測。

    1.4 試驗步驟 在檢測蛋白免疫熒光標(biāo)記物時,設(shè)hanks(緩沖液)為陰性對照,二抗AlexaFiuor488(異硫氰酸熒光素)為陽性對照。具體操作步驟如下:

    1.4.1 標(biāo)本蠟塊的處理:在切片機上將蠟塊包埋的組織切取3~5片40~50μm厚的組織片。

    1.4.2 脫蠟:將切取的組織片用二甲苯5~8ml(室溫)浸泡2~3d,脫凈石蠟。

    1.4.3 水化:依次用100%、95%、70%、50%濃度的乙醇6~8ml對組織進行水化,每次水化10~15min,棄掉乙醇后加入0.9%氯化鈉溶液5~8ml浸泡30min后棄掉0.9%氯化鈉溶液。

    1.4.4 消化:經(jīng)水化的組織加入0.5%胃蛋白酶(pH值1.5~2)2ml,置37℃恒溫水浴中,每10分鐘振蕩1次。至30min,立即加入0.9%氯化鈉溶液終止消化。

    1.4.5 過濾:將消化好的組織放在120目不銹鋼網(wǎng)上,下置一平皿,將組織剪碎并輕輕搓組織,邊搓邊用生理鹽水沖洗,直至將組織搓完。將平皿中的混懸液用300目銅網(wǎng)過濾去掉細胞團塊。

    1.4.6 離心:將收集的細胞懸液依次離心沉淀1 500r/min、1 000r/min,4min,均去掉多余懸清液,以0.9%氯化鈉溶液漂洗1次,再離心沉淀800r/min,4min,去掉多余懸清液,剩約0.5ml。

    1.4.7 標(biāo)抗:將Livin和Bcl-2一抗均按1∶50進行稀釋。離心后的組織分二等份,分別加入Livin和Bcl-2抗體工作液0.1ml,靜置1h,加入hanks(0.01mol/L)5~8ml,離心沉淀800r/min,4min,棄懸清液,每個試管內(nèi)再加入二抗(AlexaFiuor488)100μl,2h后,加入hanks5~8ml,離心同上,除去未結(jié)合的熒光二抗,上機檢測。

    1.5 結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)Livin和Bcl-2蛋白表達含量以細胞的平均熒光強度表示,為了使免疫熒光定量分析更加完備,將平均熒光強度換算成熒光指數(shù)(FI),用FI來表示Livin和Bcl-2在組織中的相對表達含量,按照組織細胞表達熒光指數(shù)大小對其進行統(tǒng)計分類,F(xiàn)I≤1判定表達量為陰性,F(xiàn)I>1判定為陽性。應(yīng)用流式細胞儀檢測Livin,Bcl-2陽性和陰性表達細胞的凋亡率。

    2 結(jié)果

    2.1 Livin蛋白在膀胱組織中的表達特征 Livin在正常膀胱組織及癌旁組織中不表達。Livin在膀胱尿路上皮癌組織中陽性表達率為71.11%。Livin在膀胱尿路上皮癌組織中表達上調(diào)。見表1。

    表1 Livin蛋白在膀胱組織中的表達 例

    注: 與TCC比較,*P<0.05

    2.2Bcl-2蛋白在膀胱組織中的表達特征Bcl-2在癌旁組織與膀胱癌組織的陽性表達率分別為73.33%和51.11%,膀胱癌組織與癌旁組織Bcl-2的表達差異顯著 (P<0.05)。45例膀胱尿路上皮癌中Bcl-2蛋白陽性率為51.11%(46/90),與正常膀胱黏膜陽性表達率10%相比較,陽性率明顯上升(P<0.05)。癌旁組織Bcl-2的陽性表達率與正常膀胱黏膜陽性表達率差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。見表2。

    表2 Bcl-2蛋白在膀胱組織中的表達 例

    注: 與正常膀胱比較,*P<0.05;與TCC比較,#P<0.05

    2.3Livin蛋白與Bcl-2蛋白表達與凋亡率的關(guān)系 膀胱尿路上皮癌組織中Livin蛋白表達陽性的凋亡率明顯低于陰性表達。同樣,Bcl-2蛋白表達陽性的凋亡率明顯低于陰性表達。均呈負相關(guān)。見表3、4。

    組別凋亡率t值P值陽性(n=64)4.23±0.6816.8030.000陰性(n=26)8.79±1.10

    組別凋亡率t值P值陽性(n=46)4.29±0.6716.3410.000陰性(n=44)8.85±1.15

    2.4 膀胱尿路上皮癌組織中Livin蛋白與Bcl-2蛋白表達的相關(guān)性Bcl-2在膀胱尿路上皮癌組織中陽性表達中的Livin陽性表達率為91.30%,Bcl-2在膀胱尿路上皮癌組織中陰性表達中的Livin陽性表達率為50.00%,兩者表達呈正相關(guān)(P<0.01)。見表5。

    表5 膀胱尿路上皮癌組織中Livin蛋白與 Bcl-2蛋白表達的相關(guān)性 例(%)

    3 討論

    Livin(又稱KIAP.MLIAP)是新發(fā)現(xiàn)的一個IAP家族成員,Ashhab等[1]明確了Livin基因位于人染色體20q13.3,全長4.6kb,包含7個外顯子?;蜣D(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA長1.4kb。Livin蛋白N端僅包含一個BIR結(jié)構(gòu),C端含一個RING環(huán)指結(jié)構(gòu)。編碼的Livin蛋白Livinα和Livinβ分別由298和280個氨基酸組成,Livin氨基酸殘基C124,C127,H44及C151與鋅原子結(jié)合,以穩(wěn)定整個重疊結(jié)構(gòu)。Livinα和Livinβ蛋白分子量分別為39 000和37 000。Kasof等[2]認為Livin同時成絲狀表達于胞質(zhì)和胞核。其抗細胞凋亡機制為:(1)抑制Caspase途徑:Livin可與介導(dǎo)細胞凋亡的下游效應(yīng)Caspase,即激活形式的Caspase-3和Caspase-7結(jié)合,并抑制其活性。Livin還可與未加工的或斷裂形式的Caspase-9結(jié)合,可抑制由Apaf-1(apoptosisprotein-activatingfactor-1),細胞色素C及dATP誘導(dǎo)的Caspase-9激活作用。Livin與Caspase的結(jié)合抑制作用具有高度的特異性和親和性,這有賴于其BIR結(jié)構(gòu)域的完整,BIR結(jié)構(gòu)域內(nèi)單個氨基酸的突變即可導(dǎo)致Livin與Caspase的結(jié)合作用及Livin抗細胞凋亡作用的明顯降低甚至完全喪失。抑制Caspase途徑:Livin可與介導(dǎo)細胞凋亡的下游效應(yīng)Caspase,即激活形式的Caspase3和Caspase7結(jié)合,抑制其活性,從而阻斷各種刺激因素誘導(dǎo)的細胞凋亡過程。(2)激活TAK1/JNK1信號傳導(dǎo)途徑:Livin可激活MAP(mitogenactivatedprotein)激酶JNK1和JNK2,從而抑制細胞凋亡。TAK1是一上游MAP3激酶,在TGFβ1的刺激下可激活JNK1。TAB1是TAK1的共反應(yīng)子(coactivator),TAB1本身對于JNK1無激活作用,但可促進TAK1介導(dǎo)的JNK1激活作用。而抑制細胞凋亡。鑒于Livin具有明顯的抗凋亡作用,人們開始日益關(guān)注其與腫瘤發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系。

    本研究顯示Livin在膀胱尿路上皮癌中陽性表達率為71.11%,而在正常膀胱黏膜組織及癌旁組織中無表達。細胞凋亡抑制因子Livin在膀胱尿路上皮癌組織中表達增加,提示Livin可能通過抑制細胞凋亡,對膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用,Livin在膀胱癌中的高表達有望成為一種有效、敏感的瘤標(biāo),并為膀胱尿路上皮癌的基因治療提供新的方向。本研究結(jié)果也說明Livin表達陽性的凋亡率明顯低于陰性表達,即Livin表達與凋亡率呈負相關(guān),表明Livin參與膀胱尿路上皮癌的凋亡調(diào)控。Gazzaniga等[3]結(jié)果顯示Livinα和Livinβ在正常膀胱組織中均無表達,Livinβ在膀胱癌組織中也無表達,而Livinα表達陽性率為23%。進一步分析顯示Livinα表達陽性的患者術(shù)后腫瘤平均復(fù)發(fā)時間為3.5個月,而Livinα表達陰性的患者則延長至27.2個月,差異明顯(P<0.01),提示Livinα表達與膀胱癌患者治療預(yù)后關(guān)系密切。有文獻報道以Livin基因為靶點的RNAi技術(shù)可以有效的特異性阻斷內(nèi)源性Livin基因的表達,使得caspase-3活化,明顯增強各種促凋亡因素(如阿霉素、紫外線照射、TNF-α)導(dǎo)致的細胞凋亡率[4]。用Livin基因的反義核酸和Smac肽反向調(diào)節(jié)Livin基因的抗凋亡活性也收到明顯的效果,包括增加化療藥物的促凋亡作用[5]。

    Bcl-2是凋亡研究中熱點癌基因之一。Bcl-2蛋白是抗凋亡蛋白,位于線粒體內(nèi)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜,分子量為26 000。研究表明Bcl-2與惡性腫瘤的惡性程度的強弱明顯相關(guān)[6]。其中抑制凋亡的Bcl-2 與促進凋亡的Bax互相拮抗。Bcl-2 蛋白是一個良好的預(yù)后指標(biāo)[7]。其抑制細胞凋亡的主要機制為:阻止細胞色素C從線粒體釋放,抑制caspase蛋白酶的活化[8]; 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+進入細胞,線粒體基質(zhì)中高濃度的Ca2+促進反向轉(zhuǎn)運載體(anfiporter)-ANT與親環(huán)素D(CypD)結(jié)合,抑制PT孔的開放[9]。Bax蛋白存在于細胞內(nèi)膜、細胞質(zhì)和細胞核上,含有BH1-BH3 三個Bcl-2 家族特征性結(jié)構(gòu)域及疏水C末端的跨膜結(jié)構(gòu)域。其生物學(xué)作用主要是形成Bax同源二聚體時拮抗Bcl-2 促進細胞凋亡。實驗研究表明,Bax和Bcl-2 形成同源或異源二聚體后根據(jù)Bcl-2/Bax的比例調(diào)控細胞的凋亡,Bax蛋白高表達時加速細胞凋亡,Bcl-2 蛋白高表達時抑制細胞凋亡[10]。本試驗Bcl-2在正常膀胱粘膜中低表達,在膀胱尿路上皮癌及癌旁細胞中高表達。本研究結(jié)果也顯示Bcl-2表達陽性的凋亡率明顯低于陰性表達,即Bcl-2表達與凋亡率呈負相關(guān),表明Bcl-2參與膀胱尿路上皮癌的凋亡機制。本實驗研究了Livin與Bcl-2的表達的相關(guān)性,在膀移行細胞癌中Livin與Bcl-2表達有密切關(guān)系,在膀胱癌Bcl-2的表達隨著膀胱腫瘤的分化程度越差陽性表達就增加,而Livin蛋白的表達亦明顯增加,呈現(xiàn)正相關(guān)(P<0.05)。已有的相關(guān)檢驗表明Livin與Bcl-2表達密切相關(guān)(P<0.05),Livin與Bcl-2在膀胱尿路上皮癌細胞凋亡的凋控方面起著協(xié)同作用。推測其機制可能是共同抑制Caspase途徑從而抑制細胞的凋亡,促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但相關(guān)課題研究較少,尚需進一步探究。

    1AshhabY,AlianA,PolliackA,etal.Twosplicingvariantsofanewinhibitorofapoptosisgenewithdifferentbiologicalpropertiesandtissuedistributionpattern.FEBSLett,2001,495:56-60.

    2KasofGM,GomesBC.Livin,anovelinbitorofapoptosisproteinfamilymember.JBiolChem,2001,276:3238-3246.

    3GazzanigaP,GradiloneA,GiulianL,etal.ExpressionandprognosticsignificanceofLIVIN,SURVIVINandotherapoptosisrelatedgenesintheprogressionofsuperficialbladdercancer.Annoncol,2003,14:85-90.

    4Crnkovic-MerrensI,Hoppe-SeylerF,ButzK.InductionofapoptosisintumorcellsbysiRNA-mediatedsilencingoftheLivin/ML-IAP/KIAPgene,Oncogene,2003,22:8330-8336.

    5VucicD,StennickeHR,PisabarroMT,etal.MLIAP,anovelinhibitorofapoptosisthatispreferentiallyexpressedinhumanmelanomas.CurrBiol,2000,10:1359-1366.

    6ShimizuS,NaritaM,TsujimotoY.Bcl-2familyproteinsregulatethereleaseofapoptogeniccytochromecbythemitochondrialchannelVDAC.Nature,1999,399:483-487.

    7TawfikK,KimlerBF,DavisMK,etal.PrognosticsignificanceofBcl-2ininvasivemammarycarcinomas:Acomparativeclinico-pathologicstudybetween“triple-negative”andnon-“triplenega-tive”tumors.HumPathol,2012,43:23-30.

    8ZhaoL,HeF,LiuH,etal.Naturalditerpenoidcompoundelevatesexpressionofbimprotein,whichinteractswithantiapoptoticpro-teinBcl-2,convertingittoproapoptoticbax-likemolecule.JBiolChem,2012,287:1054-1065.

    9RongYP,AromolaranAS,BultynckG,etal.TargetingBcl-2-IP3receptorinteractiontoreverseBcl-2’sinhibitionofapoptoticcal-ciumsignals.MolCell,2008,31:255-265.

    10JohnsenSP,PedersenL,F(xiàn)riisS.Nonaspirinnonsteroidalanti-in-flammatorydrugsandriskofhospitalizationforintracerebralhem-orrhage:apopulation-basedcase-controlstudy.Stroke,2003,34:387-91.

    10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.031

    050051 河北省石家莊市第一醫(yī)院泌尿外科

    R

    A

    1002-7386(2017)08-1228-04

    2016-12-09)

    猜你喜歡
    尿路膀胱癌上皮
    VI-RADS評分對膀胱癌精準(zhǔn)治療的價值
    要想不被“尿路”困擾 就要把它扼殺在搖籃里
    Analysis of compatibility rules and mechanisms of traditional Chinese medicine for preventing and treating postoperative recurrence of bladder cancer
    膀胱癌患者手術(shù)后癥狀簇的聚類分析
    CXXC指蛋白5在上皮性卵巢癌中的表達及其臨床意義
    手部上皮樣肉瘤1例
    miRNA-148a在膀胱癌組織中的表達及生物信息學(xué)分析
    清熱化瘀排石湯治療尿路結(jié)石32例
    FHIT和PCNA在膀胱尿路上皮癌中的表達及相關(guān)性
    Snail, CK18和Fn在胃癌中的表達及其與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系
    免费黄网站久久成人精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 永久网站在线| 久久99热这里只有精品18| 亚洲国产欧美人成| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 男人的好看免费观看在线视频| 日本黄色片子视频| av在线亚洲专区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 欧美高清性xxxxhd video| 欧美激情在线99| 日日撸夜夜添| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产三级在线视频| 日韩av不卡免费在线播放| 成人亚洲欧美一区二区av| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品不卡视频一区二区| 99热这里只有是精品50| 免费人成在线观看视频色| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产爱豆传媒在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 内地一区二区视频在线| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美潮喷喷水| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产伦在线观看视频一区| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品久久久久久久电影| 久久久久久久久大av| 卡戴珊不雅视频在线播放| 精品日产1卡2卡| 国产精品亚洲美女久久久| 国产av在哪里看| 精品久久久久久久久av| 午夜激情欧美在线| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产精品无大码| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 精品人妻熟女av久视频| 中文字幕av在线有码专区| 一区二区三区高清视频在线| 波多野结衣高清作品| 日本欧美国产在线视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲精品在线观看二区| 国产成人freesex在线 | 搡老熟女国产l中国老女人| 成年免费大片在线观看| 中国国产av一级| 国产成人福利小说| 中国国产av一级| 日本爱情动作片www.在线观看 | 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产视频一区二区在线看| ponron亚洲| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产成人精品久久久久久| 99视频精品全部免费 在线| 22中文网久久字幕| 欧美三级亚洲精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产真实乱freesex| 久久综合国产亚洲精品| 精华霜和精华液先用哪个| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 晚上一个人看的免费电影| 色av中文字幕| 日本黄色片子视频| 最近的中文字幕免费完整| 在线免费观看不下载黄p国产| 99热这里只有是精品在线观看| 午夜激情福利司机影院| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产成人一区二区在线| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 美女cb高潮喷水在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产探花在线观看一区二区| av在线观看视频网站免费| 色哟哟·www| 一个人免费在线观看电影| 中国美女看黄片| 最近在线观看免费完整版| 成人美女网站在线观看视频| 此物有八面人人有两片| 国产av不卡久久| 麻豆成人午夜福利视频| av在线老鸭窝| 日本-黄色视频高清免费观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲无线在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 床上黄色一级片| 熟女人妻精品中文字幕| 成人一区二区视频在线观看| 赤兔流量卡办理| 真实男女啪啪啪动态图| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 精品乱码久久久久久99久播| 国产乱人视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产免费男女视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 成人美女网站在线观看视频| 欧美高清成人免费视频www| 91在线观看av| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 国内揄拍国产精品人妻在线| 免费高清视频大片| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲av熟女| 国产精品一二三区在线看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 少妇被粗大猛烈的视频| 色播亚洲综合网| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 欧美+日韩+精品| 久久久午夜欧美精品| 国产精品爽爽va在线观看网站| 成年免费大片在线观看| 看片在线看免费视频| 日本黄大片高清| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产高清有码在线观看视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国语自产精品视频在线第100页| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日本爱情动作片www.在线观看 | 一进一出抽搐gif免费好疼| 在线免费观看的www视频| 一区二区三区免费毛片| 校园春色视频在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 1000部很黄的大片| 久久精品综合一区二区三区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产午夜精品论理片| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 免费电影在线观看免费观看| 免费观看的影片在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 99国产极品粉嫩在线观看| 国国产精品蜜臀av免费| 熟女人妻精品中文字幕| 国产激情偷乱视频一区二区| 悠悠久久av| 国产精品,欧美在线| 久久久精品94久久精品| 国产高清有码在线观看视频| 99久国产av精品| 国产在视频线在精品| 国产黄片美女视频| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美激情在线99| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品国产高清国产av| 美女免费视频网站| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品久久久久久久久免| 国内精品美女久久久久久| 亚洲自偷自拍三级| 免费观看的影片在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产淫片久久久久久久久| 99热这里只有是精品50| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久久精品欧美日韩精品| 乱系列少妇在线播放| 中文字幕免费在线视频6| 午夜日韩欧美国产| 亚洲真实伦在线观看| 精品久久久久久久末码| 真实男女啪啪啪动态图| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 亚洲成av人片在线播放无| 又粗又爽又猛毛片免费看| 天堂√8在线中文| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 赤兔流量卡办理| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 99热只有精品国产| 成人亚洲精品av一区二区| 白带黄色成豆腐渣| 99久久精品热视频| 日本欧美国产在线视频| 成人精品一区二区免费| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 成人午夜高清在线视频| 一级av片app| 国产熟女欧美一区二区| 久久久久久久久久黄片| 久久九九热精品免费| 99热这里只有是精品50| 永久网站在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 一级毛片aaaaaa免费看小| 22中文网久久字幕| 一级毛片电影观看 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲av不卡在线观看| av在线亚洲专区| 五月伊人婷婷丁香| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产在视频线在精品| 不卡一级毛片| 免费高清视频大片| 成人特级av手机在线观看| 国产高清激情床上av| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产免费男女视频| 日日啪夜夜撸| 亚洲av.av天堂| 久久6这里有精品| 特大巨黑吊av在线直播| 在线国产一区二区在线| 亚洲无线观看免费| 99视频精品全部免费 在线| 神马国产精品三级电影在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产三级中文精品| 亚洲美女视频黄频| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲av美国av| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产成人影院久久av| 日韩欧美精品免费久久| 国产人妻一区二区三区在| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲图色成人| 欧美日韩综合久久久久久| 日韩三级伦理在线观看| 美女内射精品一级片tv| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲av.av天堂| 在线免费十八禁| 日韩成人伦理影院| 国产精品久久久久久精品电影| 男人的好看免费观看在线视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 十八禁国产超污无遮挡网站| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲国产精品成人久久小说 | 搡老岳熟女国产| 久久国产乱子免费精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产亚洲91精品色在线| 一个人观看的视频www高清免费观看| 午夜福利在线观看吧| 国产真实乱freesex| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产在视频线在精品| 欧美潮喷喷水| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲四区av| 久久久欧美国产精品| avwww免费| 欧美色视频一区免费| 国产精品人妻久久久久久| 久久精品国产自在天天线| 俺也久久电影网| 亚洲丝袜综合中文字幕| 午夜a级毛片| 久久国内精品自在自线图片| 不卡视频在线观看欧美| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 中出人妻视频一区二区| 中文亚洲av片在线观看爽| 床上黄色一级片| 成人二区视频| 女同久久另类99精品国产91| or卡值多少钱| 精品日产1卡2卡| 亚洲欧美精品自产自拍| 日本爱情动作片www.在线观看 | 国产亚洲91精品色在线| 毛片一级片免费看久久久久| 国产69精品久久久久777片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲综合色惰| 69av精品久久久久久| 免费看av在线观看网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 看十八女毛片水多多多| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久久久久久久久黄片| 毛片一级片免费看久久久久| 精品久久久久久久久久久久久| 寂寞人妻少妇视频99o| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲成人久久性| 在线观看美女被高潮喷水网站| av黄色大香蕉| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 男插女下体视频免费在线播放| 免费人成在线观看视频色| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久久久九九精品影院| 免费av观看视频| 国国产精品蜜臀av免费| 九九爱精品视频在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 男女之事视频高清在线观看| 99热这里只有是精品50| 亚洲欧美日韩无卡精品| 免费观看的影片在线观看| 亚洲性久久影院| 日韩欧美三级三区| 老司机午夜福利在线观看视频| 12—13女人毛片做爰片一| 观看美女的网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日韩在线高清观看一区二区三区| 免费看光身美女| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲av免费在线观看| av卡一久久| 午夜激情欧美在线| 久久久a久久爽久久v久久| 黄色配什么色好看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美成人a在线观看| 在现免费观看毛片| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲电影在线观看av| 一级毛片久久久久久久久女| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产成人福利小说| 99久久无色码亚洲精品果冻| 老司机影院成人| 晚上一个人看的免费电影| 日韩在线高清观看一区二区三区| 女同久久另类99精品国产91| 免费看a级黄色片| 精品久久国产蜜桃| 亚洲va在线va天堂va国产| 欧美高清性xxxxhd video| 国产精品野战在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲av第一区精品v没综合| 中出人妻视频一区二区| 日韩欧美 国产精品| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 97超碰精品成人国产| 在线免费观看的www视频| 久久草成人影院| 日本免费一区二区三区高清不卡| 91久久精品国产一区二区三区| 一级av片app| 精品一区二区三区人妻视频| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲丝袜综合中文字幕| 高清日韩中文字幕在线| 免费黄网站久久成人精品| 国产三级在线视频| 乱系列少妇在线播放| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜亚洲福利在线播放| 91在线观看av| 十八禁网站免费在线| 久久久a久久爽久久v久久| 少妇被粗大猛烈的视频| 免费在线观看成人毛片| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 一级毛片电影观看 | 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 免费大片18禁| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日韩高清综合在线| av在线亚洲专区| 亚洲内射少妇av| 亚洲第一电影网av| 美女免费视频网站| 免费看av在线观看网站| 97碰自拍视频| 日韩亚洲欧美综合| 插逼视频在线观看| 欧美日韩乱码在线| 国产激情偷乱视频一区二区| 91av网一区二区| 最后的刺客免费高清国语| 久久久久久久久中文| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久99热6这里只有精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美zozozo另类| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲精品色激情综合| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 波多野结衣高清无吗| 国产精华一区二区三区| 亚洲性久久影院| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| aaaaa片日本免费| 久久人人精品亚洲av| 中文字幕av成人在线电影| 嫩草影院新地址| 伦精品一区二区三区| a级毛片a级免费在线| 级片在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲精品456在线播放app| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲国产色片| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲五月天丁香| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美潮喷喷水| 在线免费观看的www视频| av黄色大香蕉| 亚洲综合色惰| 中出人妻视频一区二区| av免费在线看不卡| 国产精品野战在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看 | 一区二区三区免费毛片| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产视频内射| av中文乱码字幕在线| 亚洲国产精品成人久久小说 | 婷婷精品国产亚洲av| 偷拍熟女少妇极品色| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 男女下面进入的视频免费午夜| 韩国av在线不卡| ponron亚洲| 久久99热6这里只有精品| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 三级毛片av免费| 久久国产乱子免费精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 一进一出好大好爽视频| 国产乱人偷精品视频| 少妇的逼好多水| 成人综合一区亚洲| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 99久国产av精品| 91av网一区二区| 欧美3d第一页| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 99热这里只有精品一区| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 国产成人aa在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 秋霞在线观看毛片| 97碰自拍视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 少妇人妻一区二区三区视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| av在线观看视频网站免费| 亚洲人与动物交配视频| 日韩中字成人| 美女高潮的动态| 最好的美女福利视频网| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美bdsm另类| 国产精品久久电影中文字幕| 男人舔女人下体高潮全视频| av在线老鸭窝| 日韩三级伦理在线观看| 久久人妻av系列| 欧美性猛交黑人性爽| 久久久欧美国产精品| 色综合站精品国产| 久久久久国产网址| 毛片一级片免费看久久久久| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲国产精品成人综合色| 看十八女毛片水多多多| 国产高清有码在线观看视频| 不卡视频在线观看欧美| 舔av片在线| 国产黄片美女视频| 日本一二三区视频观看| 在线观看66精品国产| 欧美xxxx性猛交bbbb| 大型黄色视频在线免费观看| 国产人妻一区二区三区在| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲av免费高清在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 麻豆国产av国片精品| 两个人的视频大全免费| 熟女人妻精品中文字幕| av天堂在线播放| 国产中年淑女户外野战色| 永久网站在线| 成人av在线播放网站| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产片特级美女逼逼视频| 嫩草影视91久久| 午夜激情欧美在线| 亚洲av中文av极速乱| 性色avwww在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产一区二区三区av在线 | 国产成人a区在线观看| 美女黄网站色视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲成av人片在线播放无| 成人无遮挡网站| 亚洲av中文av极速乱| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲最大成人av| av天堂中文字幕网| 秋霞在线观看毛片| av免费在线看不卡| 成人永久免费在线观看视频| 国内精品宾馆在线| 亚洲自拍偷在线| 亚洲在线自拍视频| 一个人免费在线观看电影| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 性欧美人与动物交配| 波多野结衣高清作品| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产淫片久久久久久久久| 国产不卡一卡二| 欧美潮喷喷水| 毛片一级片免费看久久久久| 波多野结衣高清无吗| 午夜久久久久精精品| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲国产高清在线一区二区三| 欧美中文日本在线观看视频| 国产av不卡久久| 成年版毛片免费区| 男插女下体视频免费在线播放| 日韩欧美精品v在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久人人爽人人爽人人片va| 欧美日本视频| 日本a在线网址| 欧美三级亚洲精品| 热99re8久久精品国产| 亚洲真实伦在线观看| 日本一本二区三区精品| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 男插女下体视频免费在线播放| 久久国产乱子免费精品| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲性夜色夜夜综合| 色综合色国产| 成人av在线播放网站| 日韩欧美精品v在线| 别揉我奶头 嗯啊视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 白带黄色成豆腐渣| 我要看日韩黄色一级片| 黄色日韩在线| 国产精品一二三区在线看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产毛片a区久久久久| 国产麻豆成人av免费视频| 日本色播在线视频| 看片在线看免费视频| 日韩欧美精品免费久久| 久久热精品热| 国产综合懂色| 丰满乱子伦码专区| 麻豆一二三区av精品| 午夜亚洲福利在线播放| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 干丝袜人妻中文字幕| 久久久成人免费电影| 内射极品少妇av片p| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 日日啪夜夜撸| 久久精品国产亚洲av天美| 精品午夜福利在线看| 国产黄片美女视频| 国产片特级美女逼逼视频| 婷婷六月久久综合丁香| 啦啦啦韩国在线观看视频| 激情 狠狠 欧美| 麻豆久久精品国产亚洲av| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产成人福利小说| 日韩精品中文字幕看吧|