荊半夏胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

李先良 李居寧 張喜才 趙志常

摘要：以竹葉型荊半夏葉柄為外植體，研究不同培養(yǎng)基、激素配比、不同葉柄處理方式對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，單獨(dú)添加2，4-D或6-BA均能誘導(dǎo)半夏葉柄愈傷組織，但誘導(dǎo)率較低，愈傷組織質(zhì)量相對(duì)較差。葉柄不同部位對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)有顯著影響，葉柄下段適合愈傷組織誘導(dǎo)，黃化處理能提高葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的效果。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，4因素對(duì)半夏愈傷組織誘導(dǎo)影響從大到小為2，4-D濃度>葉柄位置>6-BA濃度>蔗糖濃度。從誘導(dǎo)率和愈傷組織質(zhì)量考慮，取半夏葉柄下段接種于培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+60 g/L蔗糖上進(jìn)行培養(yǎng)，效果較好。

關(guān)鍵詞：荊半夏；葉柄；胚性；愈傷組織；誘導(dǎo)；培養(yǎng)基；激素

中圖分類(lèi)號(hào)： S567.23+9.043文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）03-0028-03

收稿日期：2016-08-16

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31471850）；湖北省荊門(mén)市科技局科學(xué)基金（編號(hào)：110588）。

作者簡(jiǎn)介：李先良（1976—），男，副教授，研究方向?yàn)閳@藝植物遺傳改良和分子生物學(xué)。E-mail：libusher@sina.com。

通信作者：趙志常，副研究員，研究方向?yàn)闊釒Ч麡?shù)遺傳育種與分子生物學(xué)。E-mail：zhaozhichang2001@163.com。

半夏（Pinellia ternata）是天南星科多年生草本植物，主要分布于湖北省、四川省、河南省、貴州省、安徽省等地，其中產(chǎn)于湖北省荊州市的半夏被稱(chēng)為荊半夏，因色白、質(zhì)堅(jiān)實(shí)、粉性足等優(yōu)點(diǎn)而被譽(yù)為上品。半夏是傳統(tǒng)中藥，據(jù)對(duì)558個(gè)處方分析，半夏出現(xiàn)頻率位于第22位。半夏以塊莖入藥，含半夏生物堿、β-谷甾醇等成分[1-2]，具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結(jié)等多種功效[3-4]。近年來(lái)，半夏蛋白被發(fā)現(xiàn)還具有抗早孕、抗腫瘤[4-6]、抗心律失常、抗衰老[7-8]的特殊功效。半夏市場(chǎng)需求量大，市場(chǎng)價(jià)格比較穩(wěn)定，野生半夏滿(mǎn)足不了市場(chǎng)需求，人工栽培逐漸發(fā)展起來(lái)。人工栽培半夏種莖價(jià)格較高，目前湖北省半夏栽培使用種莖量為4.5～6 t/hm2，需 9萬(wàn)～12萬(wàn)元/hm2。因此，降低種莖成本可以有效提高半夏人工栽培效益。

[JP2]半夏自然狀態(tài)下可進(jìn)行有性繁殖和無(wú)性繁殖。有性繁殖形成的種子發(fā)芽率低，除了種子外，半夏通過(guò)塊莖形成珠芽來(lái)進(jìn)行無(wú)性繁殖，一般2～3年生的塊莖會(huì)形成1～2個(gè)珠芽，無(wú)性繁殖效率較低。因此，組織培養(yǎng)作為一種高效繁殖方法，將其運(yùn)用于半夏種苗或種莖的培育一直備受重視。半夏主要通過(guò)器官發(fā)生途徑成苗，但器官發(fā)生途徑形式至少有3種類(lèi)型，[JP3]一是外植體直接成苗，通常也被稱(chēng)為一次成苗；二是外植體先形成帶芽的球狀體，該球狀體經(jīng)過(guò)進(jìn)一步培養(yǎng)后成苗；三是外植體形成比較明顯的愈傷組織，該愈傷組織經(jīng)過(guò)分化培養(yǎng)后成苗。[JP]

[JP2]高質(zhì)量愈傷組織可以建立高效再生體系，在細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因體系建立等方面也具有基礎(chǔ)性作用。高質(zhì)量愈傷主要特征是良好胚性，具有較強(qiáng)的再生能力，從外觀上看，高質(zhì)量愈傷表現(xiàn)為顆粒狀、有光澤，一般將高質(zhì)量愈傷組織稱(chēng)為胚性愈傷組織。從半夏愈傷組織誘導(dǎo)所用外植體看，主要是塊莖[9-13]、葉柄[14-18]及葉片[19-21]。關(guān)于最佳外植體的篩選，現(xiàn)有研究結(jié)果存在一定差異，這可能是由外植體基因型和篩選培養(yǎng)基不同造成的。本研究以荊半夏竹葉形半夏葉柄為外植體，探索葉柄位置、黃化處理、培養(yǎng)基類(lèi)型、蔗糖濃度、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)胚性愈傷誘導(dǎo)的效果，為建立高效組培再生體系建立基礎(chǔ)。[JP]

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料為荊半夏無(wú)菌苗葉柄。無(wú)菌苗通過(guò)荊半夏葉柄消毒接種到培養(yǎng)基 MS+1.0 mg/L 6-BA上，在溫度（26±2） ℃、光照周期12 h/d、光照度 2 000～3 000 lx下培養(yǎng)30 d即可獲得。

1.2方法

取將無(wú)菌苗葉柄下段平躺接入單獨(dú)添加了2，4-D（濃度為0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L）或6-BA（濃度為0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L）的MS培養(yǎng)基，比較2，4-D和6-BA對(duì)半夏愈傷組織誘導(dǎo)的效果；取葉柄下段平躺接入分別添加15、30、45、60、75、90 g/L蔗糖的MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基，比較蔗糖濃度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效果；取暗培養(yǎng) 10 d 和正常光照的無(wú)菌苗，取葉柄分上、中、下段，分別平躺接入培養(yǎng)基 MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，考察黃化處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)效果；以不同濃度2，4-D、6-BA、蔗糖、不同葉柄位置為因素，設(shè)置4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)，各因素水平見(jiàn)表1，研究各因素水平對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)效果。以上各處理每瓶各接5個(gè)，每處理重復(fù)15次，培養(yǎng)25 d統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

2結(jié)果與分析

2.16-BA、2，4-D對(duì)半夏葉柄愈傷組織誘導(dǎo)效果

從表2可以看出，單獨(dú)添加6-BA或2，4-D均能誘導(dǎo)葉柄形成愈傷組織，但誘導(dǎo)率及愈傷組織狀態(tài)都有較大差別。添加2，4-D誘導(dǎo)率較高，出愈時(shí)間較長(zhǎng)，愈傷組織質(zhì)地松軟。添加6-BA出愈較快，愈傷組織量較少，顏色呈現(xiàn)黃綠色，質(zhì)地較硬，后期愈傷組織出現(xiàn)再分化成苗的現(xiàn)象。

2.2蔗糖對(duì)半夏愈傷組織誘導(dǎo)的效果

從表3可以看出，低濃度（15～60 g/L）蔗糖處理下，增大蔗糖利于愈傷組織誘導(dǎo)，葉柄膨大和出現(xiàn)愈傷組織的時(shí)間提前，而且愈傷組織在葉柄兩端分布較均勻，相對(duì)疏松且顏色呈現(xiàn)黃白色。當(dāng)濃度過(guò)大（60～95 g/L）時(shí)，可能滲透壓過(guò)大，會(huì)引起外植體死亡。

2.3黃化處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表4可以看出，葉柄不同部位對(duì)愈傷誘導(dǎo)率影響差異明顯，下部誘導(dǎo)率最高，其次是中部，上部最低，但對(duì)愈傷質(zhì)量影響不大。這說(shuō)明葉柄下段可能發(fā)育程度較低，脫分化相對(duì)容易。黃化處理誘導(dǎo)率提高，特別是對(duì)中上部葉柄，效果最為明顯，黃化處理后葉柄上、中、下段誘導(dǎo)率差異變小，這有利于擴(kuò)大合適外植體來(lái)源。

2.4荊半夏胚性愈傷組織誘導(dǎo)條件的不同因素正交試驗(yàn)

由表5可以看出，4個(gè)因素對(duì)無(wú)菌苗葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響作用大小為2，4-D濃度>葉柄部位>6-BA濃度=蔗糖濃度，最優(yōu)組合為A2B3C3D3，即采用葉柄下段為外植體，培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+60 g/L蔗糖。但從愈傷組織質(zhì)量來(lái)看，6-BA濃度過(guò)高會(huì)使愈傷緊密，如不及時(shí)繼代容易分化成苗。

3結(jié)論與討論

本研究以竹葉形荊半夏葉柄為外植體，考察不同部位葉柄、黃化處理2個(gè)會(huì)影響外植體生理狀態(tài)的因素及2，4-D濃度、6-BA 濃度、蔗糖濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織質(zhì)量的影響。研究的4個(gè)因素中，2，4-D濃度對(duì)半夏葉柄愈傷組織誘導(dǎo)影響較大，這與章偉標(biāo)等的研究結(jié)果[10，14]一致。當(dāng)2，4-D濃度較高而6-BA濃度較低時(shí)，誘導(dǎo)的愈傷組織往往呈現(xiàn)暗黃色和水浸狀，質(zhì)地軟。當(dāng)6-BA濃度較高而2，4-D 較低時(shí)，形成的愈傷組織呈現(xiàn)黃白色，質(zhì)地硬而板結(jié)。因此，2，4-D和6-BA合適的濃度是形成胚性愈傷組織的關(guān)鍵。

半夏葉柄的位置對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)也具有較大的影響。從誘導(dǎo)率和和愈傷組織質(zhì)量?jī)煞矫婵?，葉柄下段比較合適。黃化處理可改變?nèi)~柄的生理狀態(tài)，從而影響其愈傷組織誘導(dǎo)。經(jīng)過(guò)黃化處理的試管苗上、中、下段愈傷組織誘導(dǎo)率差異縮小，與未經(jīng)黃化處理的葉柄比較，上中段葉柄誘導(dǎo)率有所提高。蔗糖在培養(yǎng)基中的作用除了作為碳源外，另一個(gè)作用是提供合適的滲透壓。在一定濃度范圍內(nèi)，提高蔗糖濃度可以增加葉柄兩端膨大速度和程度，這可能主要是由培養(yǎng)基滲透壓提高造成的。

[HS2]參考文獻(xiàn)：

[1]秦文娟，王瑞，溫月笙，等. 掌葉半夏化學(xué)成分的研究[J]. 中草藥，1995，25（1）：3-6.

[2]吳皓，李偉，張科衛(wèi)，等. 半夏藥材鑒別成分的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2003，28（9）：836-839.

[3]白權(quán)，李敏，賈敏如，等. 不同產(chǎn)地半夏祛痰鎮(zhèn)咳作用比較[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2004，20（9）：1059-1062.

[4]李玉先，劉曉東，朱照靜.半夏藥理作用的研究述要[J]. 遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，6（6）：459-460.

[5]張科衛(wèi)，吳皓，李偉. HPLC同時(shí)測(cè)定半夏藥材中鳥(niǎo)次黃嘌呤核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷的含量[J]. 藥物分析雜志，2005，25（5）：487-489.

[6]鄭國(guó)燦. 半夏提取液的抗腫瘤性研究[J]. 四川中醫(yī)，2004，22（9）：9-11.

[7]張小麗，謝人明，馮英菊. 四種中藥對(duì)血小板聚集性的影響[J]. 西北藥學(xué)雜志，2000，15（6）：260-261.

[8]蔣文躍，楊宇，李燕燕. 化痰藥半夏、瓜英、浙貝母、石曹摘對(duì)人鼠血液流變性的影響[J]. 中醫(yī)雜志，2002，43（3）：215-216.

[9]羅華彥，庭玉鳳，宋萍，等. 半夏快速繁殖體系的研究[J]. 植物生理學(xué)通訊，2005，41（6）：777-778.

[10]章偉標(biāo)，王姿云，張瑩瑩，等. 半夏疏松愈傷組織誘導(dǎo)及高產(chǎn)半夏蛋白懸浮株系篩選[J]. 浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28（5）：800-803.

[11]蘇新.半夏愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，1989（14）：15-17.[HJ1.75mm]

[12]潘衛(wèi)倉(cāng)，劉菊英. 半夏愈傷組織的誘導(dǎo)及植株的再生研究[J]. 北方園藝，2009（11）：221-223.

[13]邱璐，黃靜，范樹(shù)國(guó)，等. 半夏愈傷組織的誘導(dǎo)與分化研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（6）：72-74.

[14][JP2]朱艷芳，毛春娜，張愛(ài)民，等. 半夏疏松愈傷組織誘導(dǎo)條件的優(yōu)化研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（25）：15275-15276，15292.[JP]

[15]范美華，周吉源，彭瑜，等. 半夏愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖效應(yīng)[J]. 山東中醫(yī)雜志，2005，24（3）：168-171.

[16]萬(wàn)美亮，陳宏康，詹亞華，等. 半夏組織培養(yǎng)與快速繁殖研究[J]. 中國(guó)中藥雜志[J]. 中國(guó)中藥雜志，1995，20（9）：526-529.

[17]劉鑫欣，崔曉星，劉金欣，等. 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)半夏愈傷組織誘導(dǎo)效應(yīng)的研究[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2011，18（5）：57-59.

[18]程霞英，楊宗岐. 半夏愈傷組織誘導(dǎo)優(yōu)化研究[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，19（9）：4-6.

[19]羅成科，彭正松. 半夏疏松愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J]. 西華師范大學(xué)報(bào)，2005，26（1）：37-39.

[20]漢麗萍，趙月玲. 半夏葉片愈傷組織誘導(dǎo)和快速繁殖研究[J]. 通化師院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1995（2）：50-51.

[21]林秋月，曾萬(wàn)勇，李天佩，等. 半夏愈傷組織誘導(dǎo)與分化 最適培養(yǎng)基篩選[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（3）：3183-3186.