柱前衍生化HPLC法測定鐵皮石斛破壁飲片中甘露糖的含量

晏薇娜　喬楊　張敏　田民義　王慧娟

摘要：采用柱前衍生化HPLC法測定了12批鐵皮石斛破壁飲片中甘露糖的含量。藥材采用80%乙醇回流提取除雜后，水煎煮制得石斛多糖，然后將多糖經(jīng)酸水解為單糖，再用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（ PMP）進(jìn)行衍生化處理，以鹽酸氨基葡萄糖作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣測定。結(jié)果平均校正因子為08248，RSD為063%，平均加樣回收率為9803%。每批鐵皮石斛破壁飲片中單糖含量存在明顯差異，但均符合藥典要求。

關(guān)鍵詞：柱前衍生化；鐵皮石斛；甘露糖；HPLC；含量測定

中圖分類號(hào)：R927 2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2017）02-0090-05國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.020

Abstract：Pre-column derivatization HPLC method was adopted to measure mannose content in 12 batches of Dendrobium. After removing impurity by reflux extraction with 80% ethanol， Dendrobium polysaccharides of the medicinal materials were prepared by water decoction， and then hydrolyzed into monosaccharides which was treated with 1- phenyl -3- methyl -5- （PMP）. Glucosamine hydrochloride was used as the internal standard for sample determination. The results showed that the average correction factor was 08248， RSD was 063%， and the average recovery was 9803%. Although significant differences in the content of monosaccharide in each batch of medicinal materials were observed， they all met the pharmacopoeia requirements..

Key words：pre-column derivatization； dendrobium； mannose； HPLC； determination of content

鐵皮石斛藥材是蘭科植物鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo的干燥莖，具有益味生津，滋陰清熱的功效[1]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鐵皮石斛多糖具有增強(qiáng)免疫力、降血糖、降血壓、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[2-5]，為其主要藥效成分。經(jīng)研究，鐵皮石斛多糖主要由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成，其中甘露糖的含量最高[6-7]。破壁飲片是采用現(xiàn)代超微技術(shù)，將中藥飲片粉碎至300目、粒徑小于45微米，可供直接口服使用的新型中藥飲片。中藥破壁飲片具有高效免煎、攜帶方便、質(zhì)量可控、安全衛(wèi)生等特點(diǎn)，因此成為近年中藥研究的熱點(diǎn)[8]。

本實(shí)驗(yàn)采用柱前衍生化HPLC法，測定了貴州某企業(yè)提供的12批鐵皮石斛破壁飲片中甘露糖的含量。為鐵皮石斛破壁飲片的質(zhì)量控制提供了依據(jù)，對(duì)石斛多糖的活性研究具有進(jìn)一步的意義。

1材料與方法

11儀器與試藥

111儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，G1311B輸液泵，G1316A柱溫箱，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，G4212B-DAD檢測器，Chemstation色譜工作站。超聲儀（KQ-500型，昆山市超聲儀器有限公司），循環(huán)水式多用真空泵（SHB- IIIS，鄭州長城科工貿(mào)有限公司），分析天平（METTLER TOLEDO）。

112試劑

乙腈為色譜純，水為純凈水，甲醇、乙醇、三氯甲烷、PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）、氫氧化鈉、鹽酸、乙酸銨均為分析純；葡萄糖對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含量測定用，批號(hào)：110833-201506，含量999%）；甘露糖對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含量測定用，批號(hào)：140651-201403，含量996%）；鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院提供，供含量測定用，批號(hào)：140649-201505，含量99%）。

12實(shí)驗(yàn)方法

121色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（46mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-002mol/L的乙酸銨溶液（19∶81）；檢測波長：250nm；流速：07mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

122對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的制備內(nèi)標(biāo)溶液：取鹽酸氨基葡萄糖適量，精密稱定，加水制成每1mL含1204mg的溶液，即得。

內(nèi)標(biāo)稀釋液（10倍）：精密量取內(nèi)標(biāo)溶液10mL，置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

內(nèi)標(biāo)稀釋液（100倍）：精密量取內(nèi)標(biāo)溶液10mL，置100mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

甘露糖對(duì)照品貯備液：精密稱定甘露糖對(duì)照品5040mg，置50mL量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

甘露糖對(duì)照品溶液：精密量取甘露糖對(duì)照品貯備液10mL，置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

加內(nèi)標(biāo)的甘露糖對(duì)照品溶液：精密稱定甘露糖對(duì)照品1015mg，置100mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1mL，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

123多糖的水解

取鐵皮石斛破壁飲片約012g，置索氏提取器中，加80%乙醇適量，加熱回流提取4小時(shí)，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，濾紙筒拆開置于燒杯中，加水100mL，再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2mL，煎煮1小時(shí)并時(shí)時(shí)攪拌，放冷，加水補(bǔ)至約100mL，混勻，離心，吸取上清液1mL，置頂空瓶中，加30mol/L的鹽酸溶液05mL，封口，混勻，110℃水解l小時(shí)，放冷，用30mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，備用。

124衍生化產(chǎn)物的制備

取對(duì)照品溶液、內(nèi)標(biāo)溶液和供試品溶液400μL，加05mol/L的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液與03mol/L的氫氧化鈉溶液各400μL，混勻，70℃水浴反應(yīng)100分鐘。再加03mol/L的鹽酸溶液500μL，混勻，用三氯甲烷洗滌3次，每次2mL，棄去三氯甲烷液，水層離心后，取上清液10μL，注入液相色譜儀，測定。

2 結(jié)果與分析

21系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別吸取空白溶液、內(nèi)標(biāo)稀釋液（100倍）、甘露糖對(duì)照品溶液、加內(nèi)標(biāo)的甘露糖對(duì)照品溶液、加內(nèi)標(biāo)的供試品溶液的衍生產(chǎn)物進(jìn)樣測定，供試品溶液和對(duì)照品溶液中甘露糖、氨基葡萄糖的保留時(shí)間一致，理論板數(shù)按甘露糖峰計(jì)算大于4000。供試品溶液中甘露糖、氨基葡萄糖與其相近的峰分離度大于15，結(jié)果如圖1。

22線性關(guān)系的考察

精密量取甘露糖對(duì)照品貯備液02mL、04mL、06mL、08mL、10mL、12mL、20mL、40mL，分別置l0mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)稀釋液（10倍）10mL，加水稀釋至刻度，搖勻，吸取400μL，衍生化處理后進(jìn)樣10μL測定，記錄色譜圖。以濃度比C對(duì)照品/C內(nèi)標(biāo)為橫坐標(biāo)（X），相應(yīng)的峰面積比A對(duì)照品/A內(nèi)標(biāo)為縱坐標(biāo)（Y）（見圖2），計(jì)算回歸方程為：y = 1257x - 00303（R2 = 09996）。

23精密度試驗(yàn)

精密量取甘露糖對(duì)照品貯備液08mL、10mL、12mL，分別置10mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)稀釋液（10倍）10mL，加水稀釋至刻度，搖勻，吸取400μL，衍生化處理后進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，按式（1）計(jì)算校正因子f，結(jié)果見表1。平均校正因子為08248，RSD為063%。

校正因子（f）=A內(nèi)標(biāo)/C內(nèi)標(biāo)A對(duì)照品/C對(duì)照品（1）

24重復(fù)性試驗(yàn)

取第一批鐵皮石斛破壁飲片，按“123”項(xiàng)下方法處理，平行制備6份供試品，再衍生化后分別進(jìn)樣10μL，結(jié)果甘露糖的平均含量為1568mg/g，RSD為263%（見表2），表明方法重復(fù)性良好。

25穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，分別于衍生化后0、4、8、12、24h進(jìn)樣測定，結(jié)果甘露糖衍生物峰面積在24h內(nèi)基本無變化，RSD為112%（見表3），說明供試液衍生化后在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

26加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取第一批鐵皮石斛破壁飲片6份，每份約006g，置索氏提取器中，加80%乙醇適量，加熱回流提取4h，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，濾紙筒拆開置于燒杯中，加水100mL，再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2mL和甘露糖對(duì)照品約90mg，煎煮1h并時(shí)時(shí)攪拌，放冷，加水補(bǔ)至約100mL，混勻，離心，吸取上清液1mL，置頂空瓶中，加30mol/L的鹽酸溶液05mL，封口，混勻，110℃水解1h，放冷，用30mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，吸取400μL，衍生化處理后進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果如表4。

27樣品測定

取12批鐵皮石斛破壁飲片約012g，按“123”和“124”項(xiàng)下方法處理，每批飲片平行制備3份供試品溶液，然后進(jìn)樣10μL進(jìn)行測定，計(jì)算甘露糖含量、甘露糖和葡萄糖峰面積比，結(jié)果見表5。

3討論

多糖是鐵皮石斛的主要有效成分，其主要由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成[9]，其中含量最多的是甘露糖，因此在多糖研究基礎(chǔ)上，利用甘露糖作為含測指標(biāo)，更能全面客觀的評(píng)價(jià)出鐵皮石斛的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果甘露糖含量范圍為1602%～2781%，可能是由于12批成破壁飲片在粉碎后粒度差異的原因，顯示出每批飲看的質(zhì)量良莠不齊，且不具規(guī)律性，但均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

由于單糖在紫外區(qū)沒有吸收，因此不能用常規(guī)的紫外檢測器來檢測。根據(jù)文獻(xiàn)，常用的檢測單糖的主要方法有HPLC-RID法、柱前衍生化高效液相色譜法、HPLC-ELSD法等[10]。HPLC-RID法選擇性較差，對(duì)流動(dòng)相、柱溫等太敏感，而HPLC-ELSD法的研究還較少，不夠成熟。本實(shí)驗(yàn)采用柱前衍生化HPLC法，以鹽酸氨基葡萄糖作為內(nèi)標(biāo)，以DAD為檢測器，測定了鐵皮石斛破壁飲片中甘露糖的含量。結(jié)果表明該方法能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確地測定出單糖。

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