HPLC—RID測(cè)定咽炎清片中左旋龍腦含量

趙俊杰　錢一鑫　康冀川　何珺

摘要：以左旋龍腦標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，應(yīng)用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）（條件：Neptune C-18色譜柱，甲醇-04%磷酸（65∶35）為流動(dòng)相，流速08mL/min，柱溫25℃）對(duì)咽炎清片中左旋龍腦的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)左旋龍腦在10～100μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y=13687X-21173（r=09997，n=6），加樣回收率為1033%，RSD為042%，同時(shí)該方法操作簡(jiǎn)便，分析快速，方法學(xué)考察結(jié)果符合有關(guān)新藥研究的技術(shù)要求及《中國(guó)藥典》2015年版第四部通則中對(duì)于高效液相色譜法的各項(xiàng)規(guī)定，適宜用于咽炎清片中左旋龍腦含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：示差檢測(cè)器；咽炎清；左旋龍腦；高效液相色譜

中圖分類號(hào)：R917；O6577

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2017）02-0074-04國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.016

Abstract：The concentration of L-borneol in Yanyanqing Tablet was determined by High Performance Liquid Chromatography （HPLC） （Conditions： C-18 Neptune column， methanol -04% phosphoric acid （65∶35） as the mobile phase， flow rate 08mL/min， column temperature 25℃）. The results showed that the concentration of L-borneol had a good linear relationship within the range of 10-100μg/mL. The regression equation was Y=13687X-21173 （r=09997， n=6）. The average recovery was 1033%， while RSD was 042%. It is an easy and fast approach that meet the requirements for developing new drug， as well as Chinese Pharmacopoeia 2015 （the fourth volume）， by methodological study. The method is suitable for determining the concentration of L-borneol in Yanyanqing Tablet.

Key words：refractive index detector； Yanyanqing tablet； L-borneol； HPLC

示差檢測(cè)器（Refractive index detector， RID）是目前HPLC法中常用的一種檢測(cè)器，它可與輸液泵、色譜柱、進(jìn)樣器等組成凝膠滲透色譜儀或高速液相色譜儀系統(tǒng)，也可以配置適當(dāng)?shù)倪M(jìn)樣系統(tǒng)作為單獨(dú)的分析儀器使用，同時(shí)對(duì)所有溶質(zhì)都有響應(yīng)。某些不能用選擇性檢測(cè)器檢測(cè)的組分，可用示差檢測(cè)器檢測(cè)。由于不同的液體折光不同，因此該檢測(cè)器通用性強(qiáng)，可廣泛地應(yīng)用于化工、石油、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。示差檢測(cè)器是基于連續(xù)測(cè)定樣品流路和參比流路之間折射率的變化來測(cè)定樣品含量的。光從一種介質(zhì)進(jìn)入另一種介質(zhì)時(shí)，由于兩種物質(zhì)的折射率不同就會(huì)產(chǎn)生折射。只要樣品組分與流動(dòng)相的折光指數(shù)不同，就可被檢測(cè)，二者相差愈大，靈敏度愈高，在一定濃度范圍內(nèi)檢測(cè)器的輸出與溶質(zhì)濃度成正比[1]。

咽炎清片為貴州苗族藥驗(yàn)方，是由腫節(jié)風(fēng)、左旋龍腦和薄荷腦3味組成，味甜，微澀；對(duì)于口瘡（復(fù)發(fā)性口瘡、皰疹性口炎）、喉痹（急慢性咽炎）、牙周炎等具有清熱解毒，消腫止痛的作用[2]，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》口腔腫瘤兒科分冊(cè)。其中左旋龍腦是由菊科艾納香屬植物艾納香Blumea balsamifera（L）DC的葉和嫩枝中提取制得，為揮發(fā)性物質(zhì)，具有開竅醒神、清熱止痛等功效；可用于熱病神昏、痙厥、中風(fēng)痰厥、氣郁暴厥、中惡昏迷、目赤、口瘡、咽喉腫痛和耳道流膿等的治療[3]。目前，咽炎清片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只針對(duì)腫節(jié)風(fēng)這一味藥材進(jìn)行了質(zhì)量控制，而揮發(fā)性物質(zhì)左旋龍腦的含量測(cè)定主要為氣相色譜法或氣質(zhì)聯(lián)用[4-6]，因此本文參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用HPLC-RID法測(cè)定了咽炎清片中左旋龍腦的含量，分離度較好，簡(jiǎn)便易行，適合于咽炎清片中左旋龍腦的定性、定量分析，為有效控制咽炎清片的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1儀器、藥品與試劑

Agilent-1100型高效液相色譜儀；Neptune C-18（5μm，46mm×150mm）高效液相色譜柱；SG2200H型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；咽炎清片，06 g/片（貴州百靈企業(yè)集團(tuán)和仁堂藥業(yè)有限公司；產(chǎn)品批號(hào)A20140720、A20140804、A20141101）；左旋龍腦對(duì)照品，供含量測(cè)定用（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111683-200604）；甲醇為Fisher色譜級(jí)純度；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水。

2方法與結(jié)果

21對(duì)照品溶液的制備

精密稱定左旋龍腦對(duì)照品約1016mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

樣品溶液的制備 取咽炎清片10片，除去薄膜衣，精密稱定，研細(xì)，混勻；精密稱取約06g，置50mL容量瓶中，精密加甲醇25mL，稱重；超聲處理（功率250W，頻率50Hz）30min，放冷，稱重，甲醇補(bǔ)足減失的重量，靜置，取上清液用微孔濾膜（045μm）濾過，即得。

22色譜條件

Agilent-1100型高效液相色譜儀，Neptune C-18（5μm，150×46mm）高效液相色譜柱；流動(dòng)相A為水，B為甲醇（各含04%的磷酸）；進(jìn)樣量10μl；柱溫：35℃；體積流量：08mL/min。

23專屬性試驗(yàn)

取對(duì)照品、樣品溶液各10μL，按照“22”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖。左旋龍腦在101min出峰。圖1為左旋龍腦對(duì)照品圖譜，圖2為咽炎清片樣品溶液圖譜，圖3為咽炎清片輔料對(duì)照?qǐng)D譜。

24線性關(guān)系考察

將對(duì)照品溶液稀釋成濃度分別為100、80、60、40、20和10μg/mL的對(duì)照品溶液，各吸取10μL，按“22”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄峰而積，以峰而積為縱坐標(biāo)（Y），以左旋龍腦濃度為橫坐標(biāo)（X），得回歸方程Y=839e6X-388e4（r=09997，n=6），說明峰面積響應(yīng)值Y與被測(cè)組份濃度X成正比[2]。

25穩(wěn)定性考察

按“21”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，使得左旋龍腦濃度為40μg/mL，于室溫下放置，每隔2小時(shí)按“22”項(xiàng)下方法測(cè)定，左旋龍腦峰面積的RSD值為02%（n=7），結(jié)果表明含量測(cè)定所配置的溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

26含量測(cè)定

取咽炎清片10片，精密稱定（計(jì)算平均片重），除去薄膜衣，精密稱定（計(jì)算平均片重），研細(xì)，精密稱取約06g，置50mL容量瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率50Hz）30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取上述續(xù)濾液，按“22”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中左旋龍腦的含量。

27精密度試驗(yàn)

對(duì)同一批樣品含量測(cè)定重復(fù)6次，結(jié)果咽炎清片去薄膜衣前后左旋龍腦含量的RSD值均為01%。說明含量測(cè)定方法的精密度良好。

28加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取咽炎清片10片，除去薄膜衣，精密稱定（計(jì)算平均片重），研細(xì)，精密稱取約04g，置具塞錐形瓶中，精密加入相當(dāng)于樣品中左旋龍腦的量約80%、100%、120%的左旋龍腦對(duì)照品甲醇溶液25mL，置同一具塞錐形瓶中，密塞，按照上述左旋龍腦含量測(cè)定法中，自“稱定重量，超聲處理”起，依法操作，按“22”項(xiàng)下方法測(cè)定，按外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算含量測(cè)定加樣回收率。其結(jié)果見表1。

3討論

本文首次建立了用于咽炎清片中左旋龍腦含量測(cè)定的HPLC法，左旋龍腦與其他藥材和輔料的分離度良好，左旋龍腦濃度再在10～100μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，回收率高，重復(fù)性好，穩(wěn)定性試驗(yàn)證明左旋龍腦樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)左旋龍腦的含量測(cè)定多用氣相色譜法，作者嘗試建立一種新方法，采用HPLC-RID法能夠?qū)⒀恃浊迤凶笮埬X分離完全，避免了其他組分和輔料的影響，而且由于儀器的普及性較高，方便了對(duì)制劑中左旋龍腦的質(zhì)量控制。結(jié)果證明該方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于咽炎清片中左旋龍腦的含量測(cè)定，能夠?yàn)樵u(píng)價(jià)咽炎清片中左旋龍腦的質(zhì)量提供可靠的保證。

按照咽炎清片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》口腔腫瘤兒科分冊(cè)（WS-10329（ZD-0329）-2002），計(jì)算咽炎清片中左旋龍腦的理論含量約為079mg/片，而本文采用HPLC-RID法測(cè)定的含量為076mg/片，實(shí)際值比理論值稍低，這說明左旋龍腦這種易揮發(fā)性物質(zhì)，即便在薄膜衣的包裹下，仍不可避免有極少量的損失。

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