海水厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動(dòng)及最佳運(yùn)行工藝摸索

郝建安，張愛(ài)君，楊 波，姜天翔，張秀芝，張曉青，張雨山，王 靜

(國(guó)家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192)

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海水厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動(dòng)及最佳運(yùn)行工藝摸索

郝建安，張愛(ài)君，楊 波，姜天翔，張秀芝，張曉青，張雨山，王 靜*

(國(guó)家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192)

從渤海灣灘涂地區(qū)采集泥水樣品，通過(guò)厭氧氨氧化反應(yīng)特異引物對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取可以擴(kuò)增出特征條帶的樣品構(gòu)建厭氧氨氧化反應(yīng)器，容積為18 L。當(dāng)反應(yīng)器的水力停留時(shí)間從7 d延長(zhǎng)到14 d時(shí)，反應(yīng)器啟動(dòng)成功。反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行的最佳條件為：水力停留時(shí)間 7～21 d、鹽度 35‰～50‰、進(jìn)水總氮負(fù)荷變化值小于20%、溫度 20～35 ℃、pH值 6～7。

海水；厭氧氨氧化反應(yīng)器；啟動(dòng)；運(yùn)行工藝

厭氧氨氧化(anaerobicammoniaoxidation，anammox)是一種生物介導(dǎo)的脫氮反應(yīng)，在此反應(yīng)中，硝酸鹽和銨離子可以直接轉(zhuǎn)化為氮?dú)夂退甗1]。1977年，Broda[2]預(yù)測(cè)到了厭氧氨氧化反應(yīng)的存在；1992年，Mulder[3]在GistBrocades公司的厭氧流化床中發(fā)現(xiàn)了該反應(yīng)的存在；1995年，vandeGraaf等[4]通過(guò)一系列研究證明了該反應(yīng)，并隨后證明參與該反應(yīng)的微生物是自養(yǎng)型細(xì)菌。厭氧氨氧化過(guò)程可以在不投加電子供體(碳源)的情況下完成脫氮，具有污泥產(chǎn)量低、CO2排放量少、節(jié)能等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，荷蘭等多個(gè)國(guó)家已經(jīng)建立了厭氧氨氧化反應(yīng)中試或工廠(chǎng)規(guī)模反應(yīng)器[5-7]。

海水利用是解決水資源匱乏的重要手段，許多沿海城市已經(jīng)采用海水作為市政工程用水(如沖廁、街道灑水等)[8-10]。對(duì)于期間產(chǎn)生的污、廢海水的處理常借用淡水的處理方法，但由于海水鹽度較高，影響微生物的活性，因此，處理效率往往較低。伴隨海水利用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，污、廢海水量將大大增加，如何處理這些廢水，是海水利用產(chǎn)業(yè)亟需解決的問(wèn)題。

作者在此首次研究海水厭氧氨氧化反應(yīng)器的構(gòu)建與啟動(dòng)，并摸索反應(yīng)器的穩(wěn)定運(yùn)行工藝，以期為厭氧氨氧化技術(shù)應(yīng)用于污、廢海水處理奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 泥水樣品采集與篩選

于渤海灣海河入海口處灘涂采集泥水樣品。用美國(guó)MOBIO公司的PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒提取泥水樣品總DNA，用特異引物Amx809F與Amx1066R進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11]。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：基因組DNA 1.5 μL(80～100 ng)，引物1.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，Taq 0.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃暫停。

1.2 反應(yīng)器構(gòu)建

海水厭氧氨氧化反應(yīng)器如圖1所示，容積為18 L，用黑色膠皮與黑色漆對(duì)反應(yīng)器進(jìn)行避光處理，反應(yīng)溫度控制在35 ℃，注滿(mǎn)海水以保證厭氧條件。

進(jìn)水(mg·L-1)：NH4Cl 3 000，NaNO2600，MgSO4300，KH2PO430，CaCl2136，NaHCO3500；微量元素Ⅰ 1 mL·L-1，微量元素Ⅱ 1 mL·L-1；海水補(bǔ)齊。

微量元素Ⅰ(mg·L-1)：EDTA 5 000，F(xiàn)eSO45 000。

微量元素Ⅱ(mg·L-1)：EDTA 50 000，ZnSO4·7H2O430，CoCl2·6H2O 240，MnCl2·4H2O 990，CuSO4·5H2O250，NaMoO4·2H2O 220，NiCl2·6H2O 190，NaSeO4·10H2O 210，H3BO414。

1.3 反應(yīng)器最佳運(yùn)行工藝摸索

圖1 海水厭氧氨氧化反應(yīng)器Fig.1 Seawater anammox reactor

分別改變水力停留時(shí)間(3 d、7 d、14 d、21 d)、鹽度(32‰、35‰、40‰、42‰、50‰)、進(jìn)水總氮負(fù)荷(增加20%、增加10%、減少10%、減少20%)、反應(yīng)溫度(10 ℃、20 ℃、35 ℃、50 ℃)、反應(yīng)pH值(5、6、7、8、9)，觀(guān)察海水厭氧氨氧化反應(yīng)器運(yùn)行參數(shù)的變化，以確定最佳的運(yùn)行工藝。

1.4 檢測(cè)方法

氨氮含量參照GB 17378.4-2007中的納氏試劑法測(cè)定，亞硝酸鹽含量參照GB/T 12763.4-2007中的萘乙二胺分光光度法測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 泥水樣品的篩選結(jié)果

提取泥水樣品總DNA，用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅部分樣品可以擴(kuò)增出約200 bp的特異條帶。將該條帶測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 DNA片段在GenBank中的比對(duì)結(jié)果

Tab.1 Sequence alignment of DNA fragment in GenBank

由表1可知，該序列與Planctomycete菌株的16S rRNA基因序列相似度很高，說(shuō)明可以擴(kuò)增出特異條帶的樣品中很可能含有厭氧氨氧化特征菌屬Planctomycete的菌株。

目前，還未分離到參與厭氧氨氧化反應(yīng)的微生物純培養(yǎng)物。但是，通過(guò)分子生物學(xué)手段發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生厭氧氨氧化作用的微生物屬于浮霉?fàn)罹?Planctomycetales)[12]。厭氧氨氧化反應(yīng)在海洋環(huán)境中普遍存在，并且可能是海洋中無(wú)機(jī)氮更重要的匯[13-15]。本實(shí)驗(yàn)采樣區(qū)為渤海灘涂，是沿海大潮高潮位與低潮位之間的潮浸地帶，其環(huán)境溶氧濃度較低，同時(shí)PCR反應(yīng)顯示泥水樣品中極有可能存在參與厭氧氨氧化反應(yīng)的細(xì)菌。因此，選擇該泥水樣品構(gòu)建反應(yīng)器，以加快厭氧氨氧化反應(yīng)的啟動(dòng)。

2.2 海水厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動(dòng)

反應(yīng)器接種從渤海灣灘涂采集的泥水樣品18 L，定期更換培養(yǎng)液，監(jiān)測(cè)出水的氨氮、亞硝基氮含量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 海水厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動(dòng)Fig.2 Startup of seawater anammox reactor

從圖2可以看出，海水厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動(dòng)耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月，主要分為2個(gè)階段。第一個(gè)階段，開(kāi)始約1周時(shí)間，由于反應(yīng)器剛剛建立，出水參數(shù)很不穩(wěn)定，氨氮去除率與亞硝基氮去除率波動(dòng)較大，沒(méi)有規(guī)律；緊接著4個(gè)月時(shí)間，氨氮去除率在50%左右，而亞硝基氮去除率升高至50%以上，有時(shí)甚至升高2倍以上，此時(shí)反硝化反應(yīng)占主導(dǎo)地位。第二個(gè)階段，水力停留時(shí)間由7 d延長(zhǎng)到14 d，氨氮去除率達(dá)到70%以上，亞硝基氮去除率達(dá)到85%以上，且氨氮去除率與亞硝基氮去除率比值約為1∶1.17。繼續(xù)監(jiān)測(cè)2個(gè)月，發(fā)現(xiàn)氨氮去除率、亞硝基氮去除率、氨氮去除率與亞硝基氮去除率比值一直很穩(wěn)定，且出水pH值一直在6.5左右，反應(yīng)器中的污泥由黑色變?yōu)榧t色。文獻(xiàn)報(bào)道，厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動(dòng)有2個(gè)主要特征，一是反應(yīng)器內(nèi)污泥變紅，這是由于厭氧氨氧化反應(yīng)發(fā)生后，細(xì)胞色素累積所致[16]；二是出水氨氮與亞硝基氮含量同時(shí)降低，且去除率比值為1∶1.32[17]。因此，可以確定海水厭氧氨氧化反應(yīng)器已經(jīng)啟動(dòng)。

近年文獻(xiàn)報(bào)道的厭氧氨氧化反應(yīng)器大部分是淡水型反應(yīng)器和耐鹽型反應(yīng)器[18-19]。啟動(dòng)厭氧氨氧化反應(yīng)器一般采用原位啟動(dòng)法或人工培養(yǎng)富集法。原位啟動(dòng)法是將反應(yīng)器構(gòu)建在海底，使反應(yīng)器在自然環(huán)境中啟動(dòng)厭氧氨氧化反應(yīng)，耗時(shí)較長(zhǎng)。如Nakajima等[20]發(fā)明了一種柱式反應(yīng)器，將其固定在海底，耗時(shí)1年富集厭氧氨氧化細(xì)菌，成功啟動(dòng)厭氧氨氧化反應(yīng)。人工培養(yǎng)富集法是在構(gòu)建的反應(yīng)器中用人工配制的培養(yǎng)基啟動(dòng)厭氧氨氧化反應(yīng)，該法依賴(lài)于培養(yǎng)基成分與反應(yīng)條件的控制。如van de Vossenberg等[21]利用一種基于紅海鹽配制的培養(yǎng)基，從瑞典的Gullmar峽灣海底沉積物中富集了Scalindua屬細(xì)菌；Kawagoshi等[22]用合成的海水培養(yǎng)基在海洋環(huán)境中成功富集了厭氧氨氧化細(xì)菌；Kindaichi等[23]用Hiroshima海灣表面沉積物及人工配制的海水培養(yǎng)基在上流柱反應(yīng)器中富集了厭氧氨氧化細(xì)菌。

本實(shí)驗(yàn)選擇人工培養(yǎng)富集法啟動(dòng)海水厭氧氨氧化反應(yīng)器。相比報(bào)道的海水厭氧氨氧化反應(yīng)器，本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器具有更高的效率與更好的穩(wěn)定性，在環(huán)境條件不發(fā)生重大改變的情況下，可以穩(wěn)定運(yùn)行1年以上，且氨氮去除率超過(guò)90%。

2.3 反應(yīng)器最佳運(yùn)行工藝的確定

2.3.1 水力停留時(shí)間對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)的影響(圖3)

圖3 水力停留時(shí)間對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of hydraulic retention time on anammox reaction

從圖3可以看出，在海水厭氧氨氧化反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行后，當(dāng)水力停留時(shí)間為7～21 d時(shí)，氨氮去除率一直穩(wěn)定在95%以上；當(dāng)水力停留時(shí)間為3 d時(shí)，氨氮去除率降至85%。這是因?yàn)?，水力停留時(shí)間直接關(guān)系到水中污染物與厭氧氨氧化細(xì)菌接觸的時(shí)間，當(dāng)水力停留時(shí)間過(guò)短，水中氨氮來(lái)不及被厭氧氨氧化細(xì)菌降解，反應(yīng)效率較低；當(dāng)水力停留時(shí)間延長(zhǎng)，水中氨氮與厭氧氨氧化細(xì)菌接觸充分，反應(yīng)效率較高；但水力停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，水中污染物基本耗盡，反應(yīng)效率也較低。因此，適宜的水力停留時(shí)間為7～21 d。

2.3.2 鹽度對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)的影響(圖4)

圖4 鹽度對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of salinity on anammox reaction

從圖4可以看出，鹽度過(guò)高或過(guò)低對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)均有一定影響，其中低鹽度對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)的影響更大些。當(dāng)鹽度提高到50‰時(shí)，反應(yīng)效率降低值在10%以?xún)?nèi)；但當(dāng)鹽度降低至32‰時(shí)，反應(yīng)效率幾乎降低70%。這是因?yàn)?，一方面鹽度直接影響滲透壓，鹽度的波動(dòng)使得滲透壓急劇變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞活性降低，甚至死亡；另一方面，鹽度的波動(dòng)對(duì)生物處理影響很大，對(duì)于經(jīng)過(guò)高鹽馴化的厭氧氨氧化細(xì)菌，一旦鹽度突然降低，其生物活性會(huì)瞬間降低。因此，適宜的鹽度為35‰～50‰。

2.3.3 進(jìn)水總氮負(fù)荷對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)的影響

初始進(jìn)水總氮負(fù)荷：氨氮94.68 mg·L-1，亞硝基氮99.76 mg·L-1。改變進(jìn)水總氮負(fù)荷分別增加20%、增加10%、減少10%、減少20%，考察進(jìn)水總氮負(fù)荷對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 進(jìn)水總氮負(fù)荷對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of total influent nitrogen loading on anammox reaction

從圖5可以看出，當(dāng)進(jìn)水總氮負(fù)荷變化值在10%以?xún)?nèi)時(shí)，并未影響厭氧氨氧化反應(yīng)效率；但當(dāng)進(jìn)水總氮負(fù)荷變化值達(dá)到20%時(shí)，反應(yīng)效率明顯降低。這是因?yàn)?，氨氮是厭氧氨氧化的反?yīng)基質(zhì)，在適宜的范圍內(nèi)，濃度越高越有益于反應(yīng)；但過(guò)高的氮濃度對(duì)生物有抑制作用，加上亞硝酸鹽對(duì)生物的抑制作用，當(dāng)提高進(jìn)水總氮負(fù)荷時(shí)，也就同時(shí)提高了進(jìn)水氨氮與亞硝基氮的量，兩者發(fā)生協(xié)同抑制作用，導(dǎo)致反應(yīng)效率降低。因此，進(jìn)水總氮負(fù)荷變化值應(yīng)小于20%。

2.3.4 溫度對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)的影響(圖6)

圖6 溫度對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of temperature on anammox reaction

從圖6可以看出，溫度對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)的影響較大。當(dāng)溫度在20～35 ℃時(shí)，厭氧氨氧化反應(yīng)效率較高。因此，適宜的溫度為20～35 ℃。

在氣候變化較明顯地區(qū)應(yīng)用厭氧氨氧化反應(yīng)時(shí)，應(yīng)注意溫度變化對(duì)反應(yīng)的沖擊。

2.3.5 pH值對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)的影響(圖7)

圖7 pH值對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)的影響Fig.7 Effect of pH value on anammox reaction

從圖7可以看出，厭氧氨氧化反應(yīng)的適宜pH值范圍較窄，在pH值為6～7時(shí)厭氧氨氧化反應(yīng)效率較高，氨氮去除率均達(dá)到95%以上；當(dāng)pH值升高到8時(shí)，氨氮去除率降低到90%；當(dāng)pH值升高到9時(shí)，氨氮去除率降低到55%以下；當(dāng)pH值降低到5時(shí)，厭氧氨氧化反應(yīng)馬上停止。因此，適宜的pH值為6～7。

pH值不僅直接影響厭氧氨氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)，還影響厭氧氨氧化細(xì)菌基質(zhì)的有效性。文獻(xiàn)報(bào)道[24-26]，厭氧氨氧化反應(yīng)的適宜pH值范圍為6.0～8.0，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符。

3 結(jié)論

研究了海水厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動(dòng)與穩(wěn)定運(yùn)行的最佳工藝。從渤海灣灘涂地區(qū)采集泥水樣品，通過(guò)特異引物對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取可以擴(kuò)增出特征條帶的樣品構(gòu)建厭氧氨氧化反應(yīng)器，容積為18 L。當(dāng)水力停留時(shí)間從7 d延長(zhǎng)到14 d時(shí)，反應(yīng)器啟動(dòng)成功，耗時(shí)5個(gè)月，反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行的最佳條件為：水力停留時(shí)間7～21 d、鹽度 35‰～50‰、進(jìn)水總氮負(fù)荷變化值小于20%、溫度20～35 ℃、pH值6～7。

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Startup of Seawater Anaerobic Ammonia Oxidation Reactor and Optimization on Operation Process

HAO Jian-an,ZHANG Ai-jun,YANG Bo,JIANG Tian-xiang,ZHANG Xiu-zhi,ZHANG Xiao-qing,ZHANG Yu-shan,WANG Jing*

(InstituteofSeawaterDesalinationandMultipurposeUtilization,SOA(Tianjin),Tianjin300192,China)

Throughanaerobicammoniaoxidation(anammox)specificprimers,sludgewatersamplescollectedfromBohaibeachareawereamplifiedbyapolymerasechainreaction(PCR),andthesamplesamplifiedwithfeaturebandswereselectedtobuildananammoxreactorwithvolumeof18L.Reactorstartedsuccessfullywhenthehydraulicretentiontimechangedfrom7dto14d.Theoptimumoperationconditionswereasfollows:hydraulicretentiontimeof7～21d,salinityof35‰～50‰,changevalueoftotalinfluentnitrogenloadinglowerthan20%,temperatureof20～35 ℃,pHvalueof6～7.

seawater;anaerobicammoniaoxidationreactor;startup;operationprocess

海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目(201305022-5)，中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(K-JBYWF-2015-T11，K-JBYWF-2016-T9)，中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(K-JBYWF-2016-G10)

2016-11-15

郝建安(1981-)，男，天津人，高級(jí)工程師，研究方向：微生物學(xué)，E-mail：phoenix328@hotmail.com；通訊作者：王靜，正高級(jí)工程師，E-mail：13820529296@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.04.015

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A

1672-5425(2017)04-0063-05

郝建安，張愛(ài)君，楊波，等.海水厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動(dòng)及最佳運(yùn)行工藝摸索[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(4)：63-67.