鬼傘屬真菌的殺線蟲活性

丁正蛟，孟 帥，劉亞君

(云南大學(xué) 云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091)

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鬼傘屬真菌的殺線蟲活性

丁正蛟，孟 帥，劉亞君*

(云南大學(xué) 云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091)

研究了10種鬼傘屬真菌對(duì)全齒復(fù)活線蟲的毒殺活性，并用HPLC法分析了殺線蟲毒素在各真菌中的分布。結(jié)果表明，有7種鬼傘屬真菌表現(xiàn)出明顯的殺線蟲活性，且殺線蟲活性與其殺線蟲毒素的分布呈正相關(guān)。

鬼傘屬；殺線蟲活性；殺線蟲毒素

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)約21屬90多種擔(dān)子菌可以捕食線蟲。Luo等[1]報(bào)道毛頭鬼傘(C.comatus)可以捕殺全齒復(fù)活線蟲(Panagrellus redivivus)和根結(jié)線蟲。研究發(fā)現(xiàn)，鬼傘屬真菌的殺線蟲活性與殺線蟲毒素密切相關(guān)，毛頭鬼傘含有多種殺線蟲毒素[2]。作者在此研究了10種鬼傘屬真菌對(duì)全齒復(fù)活線蟲的毒殺活性，測(cè)定了殺線蟲毒素的分布，建立了每種真菌的代謝物HPLC圖譜，構(gòu)建了化學(xué)成分相似性聚類樹，以期找到代謝物和殺線蟲活性之間的相關(guān)性，為深入研究鬼傘屬真菌的殺線蟲活性提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 真菌的培養(yǎng)

10種鬼傘屬真菌均保藏于云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物保藏中心。 將10種真菌分別接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(直徑9cm培養(yǎng)平板)上，22 ℃靜置培養(yǎng)12d，提取代謝物。每種真菌做3個(gè)平行。

1.2 代謝物的提取

代謝物的提取參照Smedsgaard[3]和Andersen等[4]建立的微萃取法并加以改進(jìn)。用100mL氯仿-甲醇(1∶1，體積比)浸提10種真菌培養(yǎng)物； 然后用100mL乙酸乙酯萃取殘余物，最后用100mL丙醇萃??；合并所有萃取物，減壓蒸發(fā)溶劑，干燥，得代謝提取物。

1.3 代謝物化學(xué)成分的測(cè)定

將干燥的代謝提取物溶解于1mL甲醇中，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，以從毛頭鬼傘中分離的一系列殺線蟲毒素作為外標(biāo)，采用HPLC法測(cè)定代謝物的化學(xué)成分。

HPLC色譜條件：Agilent1100系統(tǒng)(Agilent，USA)，SB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm，Agilent，USA)，DAD檢測(cè)器全掃描，5%～100%乙腈線性梯度洗脫，流速1.0mL·min-1，60min。 所用化學(xué)品均為Merck公司HPLC級(jí)，水為雙蒸水。

1.4 殺線蟲活性的測(cè)定

將全齒復(fù)活線蟲置于燕麥片培養(yǎng)基(燕麥片20g+水80mL)上于25 ℃培養(yǎng)7d，通過Baermann漏斗法[5]從培養(yǎng)基中分離線蟲。

殺線蟲活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[6]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

將10種真菌代謝提取物的HPLC圖譜與總圖譜進(jìn)行比較，其中毒素存在的賦予值“1”，毒素缺乏的賦予值“0”。以毛頭鬼傘的色譜圖為標(biāo)準(zhǔn)，采用UPGMA法構(gòu)建化學(xué)成分相似性聚類樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 鬼傘屬真菌的殺線蟲活性

10種鬼傘屬真菌培養(yǎng)物和提取物的殺線蟲活性如表1所示。

表1 10種鬼傘屬真菌培養(yǎng)物和提取物的殺線蟲活性

Tab.1 Nematicidal activities of culture and extract from ten kinds of Coprinus fungi

注：“++”表示線蟲致死率在80%以上(18 h)，“+”表示線蟲致死率在50%～80%(18 h)，“-”表示線蟲致死率小于 50%(18 h)。

由表1可知，在10種鬼傘屬真菌中，4#、5#、6#真菌的培養(yǎng)物和提取物都具有明顯的殺線蟲活性，7#、8#、10#真菌的培養(yǎng)物和提取物有一定的殺線蟲活性，1#、2#、3#真菌的培養(yǎng)物和提取物殺線蟲活性很弱，9#真菌的培養(yǎng)物殺線蟲活性也很弱，但其提取物具有較強(qiáng)的殺線蟲活性。表明，部分鬼傘屬真菌具有殺線蟲活性，且殺線蟲活性強(qiáng)度不同。

2.2 鬼傘屬真菌殺線蟲毒素的分布

從毛頭鬼傘中分離得到的7種殺線蟲毒素(Ⅰ～Ⅶ)在10種鬼傘屬真菌中的分布情況如表2所示。

表2 殺線蟲毒素在10種鬼傘屬真菌中的分布

Tab.2 Distribution of nematotoxin in ten kinds of Coprinus fungi

注：Ⅰ為5-methylfuran-3-carboxylic acid；Ⅱ?yàn)?-hydroxy-3,5-dimethylfuran-2(5H)-one；Ⅲ為5-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-5-methylfuran-2(5H)-one；Ⅳ為4,6-dihydroxyisobenzofuran-1,3-dione；Ⅴ為4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one；Ⅵ為4,6-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one；Ⅶ為3-formyl-2,5-dihydroxybenzyl acetate?！?”表示檢測(cè)到殺線蟲毒素，“-”表示未檢測(cè)到殺線蟲毒素。

由表2可知，在7種真菌中檢測(cè)到了殺線蟲毒素同系物，與它們的殺線蟲活性相對(duì)應(yīng)。比較表1和表2發(fā)現(xiàn)：9#真菌沒有檢測(cè)到殺線蟲毒素但其代謝提取物卻有著較強(qiáng)的殺線蟲活性，而殺線蟲活性較強(qiáng)的7#真菌的殺線蟲毒素分布不如殺線蟲活性較弱的8#真菌，這可能是因?yàn)?，鬼傘屬真菌中可能還存在其它具有殺線蟲活性的化合物，而不僅僅只有殺線蟲毒素Ⅰ～Ⅶ；1#真菌雖檢測(cè)到殺線蟲毒素但殺線蟲活性卻很弱，可能是因?yàn)樗瑲⒕€蟲毒素的含量較低所致。

2.3 鬼傘屬真菌化學(xué)成分相似性聚類樹分析

基于10種鬼傘屬真菌的殺線蟲毒素分布(表2)進(jìn)行聚類分析得到的樹形圖如圖1所示。

從圖1可以看到， 10種鬼傘屬真菌被歸在2個(gè)不同的簇。一個(gè)簇包括強(qiáng)殺線蟲活性的3個(gè)物種，另一個(gè)簇中物種的殺線蟲活性不明顯；具有相似活性的物種在聚類距離上接近。這表明鬼傘屬真菌的殺線蟲活性和其殺線蟲毒素的分布呈正相關(guān)。

圖1 10種鬼傘屬真菌化學(xué)成分相似性聚類樹Fig.1 Cluster tree of ten kinds of Coprinus fungi based on chemical composition similarity

3 結(jié)論

所測(cè)試的10種鬼傘屬真菌中有7種對(duì)全齒復(fù)活線蟲有明顯的毒殺活性，且其毒殺活性與殺線蟲毒素的分布呈正相關(guān)。若能對(duì)影響殺線蟲活性的代謝物進(jìn)行進(jìn)一步的分離和鑒定，必會(huì)為鬼傘屬真菌殺線蟲特性提供更多的證據(jù)。

[1] LUO H,MO M H,ZHANG K Q.An unusual structure designated spinous ball was found on a nematophagousBasidiomycetousfungusCoprinuscomatus[J].Mycological Research,2004,96：1219-1226.

[2] 劉亞君.鬼傘屬真菌殺線蟲活性化合物分離、鑒定[D].昆明：云南大學(xué),2005.

[3] SMEDSGAARD J.Micro-scale extraction procedure for standardized screening of fungal metabolite production in cultures[J].Journal of Chromatography A,1997,760(2):264-270.

[4] ANDERSEN B,KROGER E,ROBERTS R G.Chemical and morphological segregation ofAlternariaalternata,A.gaisenandA.longipes[J].Mycological Research,2001,105(3):291-299.

[5] GRAY N F.Ecology of nematophagous fungi:comparison of the soil sprinkling method with the Baermann funnel technique in the isolation of endoparasites[J].Soil Biology & Biochemistry,1984,16(1):81-83.

[6] STADLER M,ANKE H,BERGQUIST K E,et al.Lachnumon and lachnumol A,new metabolites with nematicidal and antimicrobial activities from the ascomyceteLachnumpapyraceum(Karst.) Karst.Ⅱ.structural elucidation[J].Journal of Antibiotics,1993,46(6):968-971.

Nematicidal Activity ofCoprinusFungi

DING Zheng-jiao,MENG Shuai,LIU Ya-jun*

(StateKeyLaboratoryforConservationandUtilizationofBio-ResourceinYunnan,YunnanUniversity,Kunming650091,China)

NematicidalactivitiesoftenkindsofCoprinusfungiagainstPanagrellus redivivuswerestudied.DistributionofnematotoxininvariousfungiwasanalyzedbyHPLC.Resultsindicatedthat,sevenkindsofCoprinusfungishowedsignificantnematicidalactivity,andthenematicidalactivitywaspositivelyrelatedtodistributionofnematotoxin.

Coprinus;nematicidalactivity;nematotoxin

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30860009，31260446)

2016-11-22

丁正蛟(1992-)，男，云南曲靖人，碩士研究生，研究方向：植物保護(hù)，E-mail:526543777@qq.com；通訊作者：劉亞君，副研究員，E-mail:lyj@ynu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.04.005

Q939

A

1672-5425(2017)04-0019-02

丁正蛟，孟帥，劉亞君.鬼傘屬真菌的殺線蟲活性[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(4)：19-20，27.