環(huán)境因素對(duì)屎腸球菌產(chǎn)酪胺的影響

王俊朋，呂曉玲，張穎，朱曉娟，張健*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

環(huán)境因素對(duì)屎腸球菌產(chǎn)酪胺的影響

王俊朋1，呂曉玲1，張穎1，朱曉娟2，張健2*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

酪胺是發(fā)酵食品中廣泛存在的、毒性較強(qiáng)的一種生物胺。屎腸球菌作為發(fā)酵劑或污染菌廣泛存在于發(fā)酵食品中，大多數(shù)具有產(chǎn)生酪胺的能力，成為發(fā)酵食品的潛在安全隱患。該研究以一株黃酒酒曲中分離的產(chǎn)酪胺屎腸球菌為對(duì)象，選取葡萄糖、酪氨酸、溫度、pH值和酒精含量5個(gè)因素，研究這些因素對(duì)該菌生長(zhǎng)和酪胺合成的影響。結(jié)果表明，葡萄糖或酪氨酸添加量對(duì)菌體的生長(zhǎng)影響不大，溫度、環(huán)境pH值和酒精含量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響較顯著。酪氨酸對(duì)菌體產(chǎn)酪胺促進(jìn)作用明顯，溫度＜20℃，環(huán)境pH值＞5，酒精含量＞10%vol時(shí)都會(huì)減少酪胺的產(chǎn)生。

屎腸球菌；酪胺；環(huán)境因素；菌體生長(zhǎng)；黃酒

生物胺是一類含氮的具有生物活性的小分子量有機(jī)化合物的總稱。根據(jù)結(jié)構(gòu)可以將其分成三類：脂肪族（如腐胺，尸胺、精胺、亞精胺等）；芳香族（如章魚胺、酪胺、苯乙胺等）；雜環(huán)族（如組胺、色胺等[1]）。適量的生物胺在生物體內(nèi)具有重要的生理作用，但是當(dāng)人體吸收過(guò)量的生物胺時(shí)，將產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，甚至死亡。

黃酒是我國(guó)特有的傳統(tǒng)酒種，開放式多菌種發(fā)酵方式使其中生物胺含量遠(yuǎn)高于葡萄酒或啤酒等其它發(fā)酵酒。雖然，目前沒有黃酒中生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)，但是很多學(xué)者建議酒精飲料中組胺的中毒劑量為8～20 mg/L，酪胺的中毒劑量為25～40 mg/L[2-7]。前期調(diào)研以及文獻(xiàn)報(bào)道表明，很多黃酒產(chǎn)品中的酪胺含量高于此標(biāo)準(zhǔn)，這使得黃酒的飲用安全受到一些質(zhì)疑，影響了黃酒產(chǎn)品的推廣和出口創(chuàng)匯。

酪胺是黃酒中的主要生物胺之一，也是毒性僅次于組胺的生物胺，在人體內(nèi)大量積累會(huì)引起偏頭痛和高血壓，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致腦溢血。酪胺是由酪氨酸脫羧酶將酪氨酸脫羧轉(zhuǎn)化而成的，酪氨酸脫羧酶廣泛存在于腸球菌屬細(xì)菌中[5]，因此腸球菌屬細(xì)菌是最常見的酪胺產(chǎn)生菌。本實(shí)驗(yàn)室前期從黃酒酒曲中分離鑒定了一株屎腸球菌（Enterococcus faecalis），具有很強(qiáng)的酪胺合成能力。前期，也有學(xué)者從發(fā)酵肉制品、奶酪等產(chǎn)品中分離到了產(chǎn)酪胺的屎腸球菌。

通常認(rèn)為，屎腸球菌是腸系菌群平衡的關(guān)鍵菌株，具有較好的抑菌效果和降膽固醇等益生功能，同時(shí)也在很多發(fā)酵食品的成熟和風(fēng)味形成中發(fā)揮重要作用[6]。同時(shí)，一些屎腸球菌也被醫(yī)院公認(rèn)為是引起血癥、心內(nèi)膜炎、泌尿道和其他感染的病原體[8-10]。由于這些菌株可以生存在高鹽濃度，低pH值和高溫的環(huán)境中，在食品加工過(guò)程中很難完全滅活[11-12]。

鑒于屎腸球菌在眾多發(fā)酵制品中的重要作用，有必要深入研究環(huán)境因素對(duì)該菌種合成酪胺的影響。為此，本試驗(yàn)選取葡萄糖、酪氨酸、溫度、pH值和酒精含量5個(gè)因素，結(jié)合黃酒發(fā)酵過(guò)程設(shè)置不同水平，研究這些環(huán)境因素對(duì)屎腸球菌生長(zhǎng)和酪胺合成的影響。真實(shí)的黃酒發(fā)酵過(guò)程是多菌種開放式發(fā)酵[13-14]，其中酪胺的形成除與上述因素有關(guān)，還受原料、菌群互相作用等因素的影響，且黃酒中存在多種酪胺產(chǎn)生菌，酪胺的形成非常復(fù)雜。因此本研究并不能完全反映黃酒發(fā)酵過(guò)程中環(huán)境因素對(duì)酪胺形成的影響，但是可為屎腸球菌為主要發(fā)酵菌種生成酪胺的過(guò)程提供一些基礎(chǔ)參數(shù)，有助于理解黃酒發(fā)酵過(guò)程中酪胺的形成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

屎腸球菌（Enterococcus faecalis）：從黃酒酒曲中分離。

乙腈（色譜純）：東莞市喬科化學(xué)有限公司；酪胺標(biāo)準(zhǔn)品：天津一方科技有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母提取物4g/L，葡萄糖20g/L，乙酸鈉·3H2O 5 g/L，吐溫80 1 mL/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸三胺2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，酪氨酸0.5 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

Essentia PrepLC-16P高效液相色譜儀：日本島津公司；756PC紫外分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；BCD-257SL冰箱：青島海爾有限股份公司；REGEND MICRO 17R小型高速離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司；QL-901渦旋混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HH-B11-BY恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療有限公司；SY-1-2恒溫水浴鍋：天津市歐諾儀器儀表有限公司；KQ-500DE超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；CP64電子分析天平（精確至0.0001g）：奧豪斯儀器有限公司；Sartorius普及型pH計(jì)：Sartorius；0.45 μm針頭微孔濾膜過(guò)濾器：北京華盛鼎國(guó)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)條件

研究過(guò)程所用培養(yǎng)基是在MRS液體培養(yǎng)基加入0.05%的酪氨酸基礎(chǔ)上稍加修改，使研究的因素為液體培養(yǎng)基的單一變量。30℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，每4 h取樣。所有試驗(yàn)的培養(yǎng)基的pH值控制在6.15～6.20范圍內(nèi)。

因素水平為：（1）葡萄糖的添加量（5g/L、10g/L、15g/L、20 g/L）；（2）酪氨酸的添加量（0.2 g/L、0.5 g/L、0.8 g/L）；（3）溫度（20℃、25℃、30℃、35℃）；（4）pH值（4.5、5.0、5.5、6.2）；（5）酒精含量（0、5%vol、8%vol、10%vol）。

相應(yīng)的液體培養(yǎng)基（10 mL MRS培養(yǎng)基加入0.05%的酪氨酸）接種體積分?jǐn)?shù)1%的菌懸液，用試管在30℃條件下培養(yǎng)24 h，每4 h取樣，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，在不同環(huán)境條件下培養(yǎng)之后，分別測(cè)定菌體的OD600nm值和酪胺產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線如下：

菌體活化→制備菌懸液→接種菌懸液到不同因素水平的培養(yǎng)基進(jìn)行恒溫培養(yǎng)→測(cè)定菌體OD600nm→測(cè)定發(fā)酵液中的酪胺含量

1.3.2 菌體生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

用分光光度法在波長(zhǎng)600 nm處分別每4 h測(cè)定菌體OD值，當(dāng)OD值＞0.7時(shí)樣液將被稀釋2～3倍，最后的吸光度值為測(cè)定值乘以稀釋倍數(shù)。

1.3.3 酪胺含量的測(cè)定

（1）生物胺的衍生

取發(fā)酵液1 mL置于10 mL的離心管中，加入1 mL飽和碳酸氫鈉溶液，加1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 10，1 mL丹磺酰氯衍生溶液，振蕩混勻，置60℃水浴鍋內(nèi)反應(yīng)30 min，中間振蕩兩次，取出，加入100 μL氨水，振蕩混勻，60℃水浴鍋內(nèi)反應(yīng)30min，取出在40℃水浴下氮吹除去丙酮，加入3 mL乙醚振蕩2 min，靜置分層，吸取上清有機(jī)層，重復(fù)萃取兩邊，合并乙醚萃取液，氮?dú)獯蹈?。加? mL乙腈使殘留物溶解，振蕩混勻，0.22 μm濾膜針頭過(guò)濾，濾液待測(cè)。

（2）高效液相色譜測(cè)定

液相色譜參考條件色譜柱為Gemini 5u C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）柱，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30℃，流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為乙腈溶液，流速1 mL/min，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品的含量。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution programs

2 結(jié)果與分析

2.1 酪胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以及衍生物色譜圖的繪制

吸取0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.50 mL、5.00 mL酪胺標(biāo)品（100 mg/L），分別置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L的鹽酸溶液稀釋至刻度，混勻，配制成一定濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)系列和試樣的衍生溶液注入高效液相色譜儀中測(cè)定峰面積，以酪胺質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，酪胺標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，記錄色譜圖，酪胺衍生物的色譜圖見圖2。由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=130 000x+43 047，R2=0.999。由圖2可知，酪胺的保留時(shí)間約為17.0 min。

圖1 酪胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of tyramine

圖2 酪胺衍生物的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC of tyramine derivative

2.2 不同環(huán)境因素對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酪胺的影響

葡萄糖作為碳源是為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量來(lái)源，氮源是生長(zhǎng)過(guò)程中給微生物提供氮元素的物質(zhì)，這些營(yíng)養(yǎng)條件直接影響著菌體的生長(zhǎng)繁殖，除此之外的發(fā)酵條件溫度、pH、酒精等對(duì)菌體的生長(zhǎng)也有抑制或者促進(jìn)作用。不同因素水平條件對(duì)屎腸球菌（E.faecalis）生長(zhǎng)的影響見圖3。

由圖3可知，葡萄糖和酪氨酸的添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的影響不大，生長(zhǎng)12 h均可達(dá)到穩(wěn)定期，且培養(yǎng)24 h，OD值均可達(dá)到2.2左右；酒精含量對(duì)菌體生長(zhǎng)抑制顯著，當(dāng)酒精度＞8%vol時(shí)菌體生長(zhǎng)幾乎停止；pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)有顯著影響，pH值為4.5～6.2時(shí)菌體的生長(zhǎng)速度明顯變快，穩(wěn)定期的最大菌密度也呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。在pH值4.5時(shí)菌體生長(zhǎng)停止生長(zhǎng)；溫度顯著影響菌體生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)溫度的升高菌密度和生長(zhǎng)速度都呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。

酪胺是由酪氨酸脫羧酶催化轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的。環(huán)境因素不僅對(duì)菌體生長(zhǎng)有影響，還會(huì)影響菌體的產(chǎn)酶量以及酶的催化活性。這些都會(huì)影響發(fā)酵液中的酪胺含量。環(huán)境因素對(duì)發(fā)酵液中的酪胺含量的影響如圖4所示。

圖3 不同環(huán)境因素對(duì)屎腸球菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of different environmental factors onE.faecalisgrowth

圖4 不同環(huán)境因素對(duì)屎腸球菌產(chǎn)酪胺的影響Fig.4 Effect of different environmental factors on tyramine production byE.faecalis

由圖4可知，高含量的葡萄糖會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定期后期酪胺的大幅減少，BUNKOVA L等[6]認(rèn)為可能是由于在穩(wěn)定期后期微生物代謝大量產(chǎn)酸抑制了菌體的生長(zhǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)胺量降低。但結(jié)合圖3a可知本實(shí)驗(yàn)條件不會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)，因此酪胺含量降低可能與產(chǎn)酶量減少或產(chǎn)酸導(dǎo)致酪氨酸脫羧酶活性降低所致；酪氨酸添加量不會(huì)改變酪胺的形成規(guī)律，即酪胺在8 h產(chǎn)量最高，隨后逐漸降低。但是隨著酪氨酸含量的增多，酪胺產(chǎn)量呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，酪氨酸的前體作用非常明顯。這與LINARES D M等[20]的報(bào)道一致；酒精含量＞8%vol時(shí)菌體幾乎停止生長(zhǎng)，因此幾乎也無(wú)酪胺生成。但與添加5%vol的酒精相比不添加酒精生成的酪胺更多，即如圖3c所示不添加酒精更有利于菌體的生長(zhǎng)。這說(shuō)明少量的酒精對(duì)產(chǎn)酶或酶活有促進(jìn)作用。pH4.5時(shí)酪胺產(chǎn)量隨時(shí)間呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，而如圖3d所示，此pH條件下菌體幾乎不能生長(zhǎng)。酪胺的逐漸積累可能與酸性條件誘導(dǎo)菌體產(chǎn)酶有關(guān)，PEREZ M等[21]也有過(guò)類似的報(bào)道。中性條件下酪胺的含量并非最高，這也印證了酸性條件有利于菌體產(chǎn)酶。圖4e溫度對(duì)酪胺的影響主要體現(xiàn)在菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，這個(gè)時(shí)期溫度越高酪胺的合成速度越快，產(chǎn)量也越高；但是培養(yǎng)24 h后，溫度對(duì)酪胺含量幾乎無(wú)影響。

3 結(jié)論

總體而言，葡萄糖或酪氨酸添加量對(duì)菌體的生長(zhǎng)影響不大，溫度、pH值和酒精含量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響較顯著。酪氨酸對(duì)菌體產(chǎn)酪胺促進(jìn)作用明顯。溫度低于20℃，環(huán)境pH值＞5，酒精含量＞10%vol都會(huì)抑制酪胺的生成。由圖可知顯然菌體生長(zhǎng)和酪胺的產(chǎn)生并非簡(jiǎn)單的對(duì)應(yīng)關(guān)系。酪胺的合成還受酪氨酸脫羧酶的產(chǎn)量和酶活的雙重影響。進(jìn)一步對(duì)產(chǎn)酶量和酶活的研究將更為清晰的揭示環(huán)境條件對(duì)屎腸球菌（Enterococcus faecalis）合成酪胺的影響。本研究并不能完全反映黃酒發(fā)酵過(guò)程中環(huán)境因素對(duì)酪胺形成的影響，但是可為屎腸球菌為主要發(fā)酵菌種合成酪胺的過(guò)程提供一些基礎(chǔ)參數(shù)，這有助于理解黃酒發(fā)酵過(guò)程中酪胺的形成。

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《中國(guó)釀造》雜志社

Effect of environmental factors on tyramine production byEnterococcus faecalis

WANG Junpeng1,LV Xiaoling1,ZHANG Ying1,ZHU Xiaojuan2,ZHANG Jian2*
(1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China;2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

Tyramine is a kind of strong toxic biogenic amines widely existed in fermented food.Enterococcus faecalis,as fermentation starter or contamination bacteria,is widely existed in fermented food,and most of them have the ability to produce tyrosine,which became potential safety hazard of fermented food.In the paper,using tyramine producing byE.faecalisisolated from Chinese rice wine as research objest,the effect of five factors including glucose,tyrosine,temperature,pH and alcohol content onE.faecalisgrowth and tyramine production was studied.Results showed that glucose or tyrosine addition had little effect on cell growth,while temperature,pH and alcohol content had significant effect on cell growth.Tyrosine can promote tyramine production apparently and tyramine production can be reduced under the condition of temperature＜20℃,or environment pH＞5,or alcohol content＞10%vol.

Enterococcus faecalis;tyramine;environmental factors;cell growth;Chinese rice wine

TS201.1

0254-5071（2017）04-0040-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.009

2016-12-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31471725）

王俊朋（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称诽砑觿┡c功能性配料。

*通訊作者：張健（1978-），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵食品安全。