高效液相色譜法測(cè)定四角蛤蜊、菲律賓蛤仔中呈味核苷酸

張倩，劉睿,3，王欣之,3，程建明,3，張文英，杜俊潮，吳皓,3*

1(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京，210023) 2(江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京，210023) 3(江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京，210023)

高效液相色譜法測(cè)定四角蛤蜊、菲律賓蛤仔中呈味核苷酸

張倩1,2，劉睿1,2,3，王欣之1,2,3，程建明1,2,3，張文英1,2，杜俊潮1,2，吳皓1,2,3*

1(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京，210023) 2(江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京，210023) 3(江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京，210023)

建立高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)同時(shí)測(cè)定四角蛤蜊、菲律賓蛤仔中呈味核苷酸5’-尿苷酸(5’-UMP)、5’-鳥苷酸(5’-GMP)、5’-肌苷酸(5’-IMP)和5’-腺苷酸(5’-AMP)含量。采用Waters Atlantis T3(4.6 mm×250 mm,3 μm)色譜柱，以0.01 mol/L KH2PO4溶液-甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，紫外檢測(cè)器在260 nm處進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法進(jìn)行定量。結(jié)果表明：各呈味核苷酸線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均為0.999 9，回收率在96.19%～103.25%內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.08%～1.28%內(nèi)。四角蛤蜊與菲律賓蛤仔中均含有4種呈味核苷酸，其中5’-AMP含量最多，其次是5’-IMP和5’-UMP，而5’-GMP含量最低。該方法簡單，重現(xiàn)性好、靈敏度和準(zhǔn)確度高，適用于四角蛤蜊、菲律賓蛤仔中呈味核苷酸含量測(cè)定，為研究貝類風(fēng)味及貝類食品的開發(fā)提供一定的依據(jù)。

高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)；四角蛤蜊；菲律賓蛤仔；呈味核苷酸

四角蛤蜊(MactraveneriformisReeve)、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)是江蘇沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)貝類[1]，營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)鮮美。核苷酸是機(jī)體體內(nèi)重要的極性小分子化合物，其中5’-UMP，5’-GMP，5’-IMP，5’-AMP等核苷酸成分具有明顯的呈鮮特點(diǎn)[2]，極大程度上影響著貝類的口感及鮮度。

目前，呈味核苷酸的含量測(cè)定方法有分光光度法[3]、高效液相色譜法[4-6]、高效毛細(xì)管電泳法[7]及離子交換色譜法[8]等。國內(nèi)外對(duì)肉類、水產(chǎn)品等食用產(chǎn)品中核苷酸進(jìn)行了大量的研究[9-10]，而對(duì)江蘇沿海低值貝類中呈味核苷酸的研究相對(duì)較少，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)江蘇沿海低值貝類四角蛤蜊、菲律賓蛤仔中4種呈味核苷酸進(jìn)行分析測(cè)定，為食用貝類的風(fēng)味研究及貝類食品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四角蛤蜊、菲律賓蛤仔(江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，批號(hào)為20150714、20150920，經(jīng)江蘇省海洋水產(chǎn)研究所萬夕和研究員鑒定為蛤蜊科動(dòng)物四角蛤蜊MactraveneriformisReeve，簾蛤科動(dòng)物菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum)；5’-尿苷酸(5’-UMP)、5’-鳥苷酸(5’-GMP)、5’-肌苷酸(5’-IMP)’5’-腺苷酸(5’-AMP)(純度≥99%，美國Sigma-Aldrich公司)；甲醇(色譜純)，德國默克公司；KH2PO4(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2489 UV檢測(cè)器(美國Waters公司)；3-16pk高速離心機(jī)(美國Sigma-Aldrich公司)；UNIQUE-s15超純水機(jī)(美國Millipore公司)；BT-125D型電子分析天平(德國Sartorius公司)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備

分別稱取5’-UMP，5’-GMP，5’-IMP，5’-AMP，精密稱定，加水制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液。將5’-UMP，5’-GMP，5’-IMP配制成質(zhì)量濃度為0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；5’-AMP配制成2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備

取四角蛤蜊、菲律賓蛤仔新鮮軟體適量，稱量，加入3倍質(zhì)量水煎煮，每次45 min，煎煮2次，將濾液濃縮至軟體質(zhì)量的1/3，100 00 r/min離心10 min，去沉淀，得上清液，加乙醇調(diào)節(jié)體積分?jǐn)?shù)至80%，靜置12 h，抽濾，濾液減壓回收乙醇至無醇味，得水提醇沉上清液，超純水定容，過0.45 μm濾膜過濾，高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 HPLC分析條件

色譜柱：Waters T3色譜柱(4.6 mm×150 mm, 3 μm)；流動(dòng)相A相為甲醇，B相為0.01 mol/L KH2PO4，梯度洗脫(0～10 min，1%～3% A；10～20 min，3%～20% A；20～25 min，20%～25% A；)流速為0.4 mL/min，檢測(cè)波長：260 nm，進(jìn)樣體積：10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將核苷酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液注入高效液相色譜儀中，以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性，以外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC條件的考察

2.1.1 色譜柱的考察

呈味核苷酸是極性大的小分子化合物，在一般的C18色譜柱上不易保留，分別考察了Waters XBridgeTMHILIC色譜柱、Phenomenex Luna C18(2) 色譜柱、Waters Atlantis T3色譜柱對(duì)4種呈味核苷酸的分離效果，結(jié)果見圖1。

圖1 Waters HILIC(a)、Phenomenex Luna C18(b)、Waters Atlantis T3色譜柱(c)對(duì)呈味核苷酸的分離效果圖Fig.1 Separation schematic diagram of flavor nucleotides on Waters HILIC, Phenomenex Luna C18, Waters Atlantis T3

結(jié)果顯示T3色譜柱對(duì)核苷酸的保留能力明顯強(qiáng)于HILIC色譜柱與Phenomenex Luna C18(2) 色譜柱，且5’-GMP與5’-IMP達(dá)到分離度要求，故選擇Waters Atlantis T3色譜柱作為分離呈味核苷酸的色譜柱。

2.1.2 流動(dòng)相種類的考察

核苷酸類成分在色譜柱的分離中易發(fā)生拖尾現(xiàn)象，原因是色譜柱上固定相與核苷酸之間產(chǎn)生氫鍵作用，產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象[11]。分別選用了磷酸、乙酸及磷酸緩沖鹽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(見圖2)，發(fā)現(xiàn)在乙酸條件下，5’-GMP與5’-IMP部分重疊且每個(gè)峰有拖尾現(xiàn)象。在磷酸條件下，拖尾現(xiàn)象有所改善但5’-GMP與5’-IMP仍沒達(dá)到分離要求。而使用KH2PO4磷酸二氫鉀作為流動(dòng)相，能將4種呈味核苷酸達(dá)到基線分離的效果，且能抑制拖尾現(xiàn)象，故選擇磷酸二氫鉀作為流動(dòng)相。

圖2 不同流動(dòng)相條件下呈味核苷酸的分離效果圖Fig.2 Separation schematic diagram of flavor nucleotides in different mobile phase conditions

2.1.3 緩沖鹽濃度的考察

針對(duì)緩沖KH2PO4的濃度進(jìn)一步考察，分別選用0.01、0.02、0.05 mol/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(見圖3)，結(jié)果表明隨著緩沖鹽濃度的上升，每個(gè)物質(zhì)的保留時(shí)間逐漸減小，而對(duì)分離效果的影響不大。高濃度的緩沖鹽溶液對(duì)色譜柱及色譜儀有一定的危害，故在達(dá)到核苷酸分離效果的前提下，選擇低濃度0.01 mol/L的KH2PO4。

圖3 緩沖鹽濃度對(duì)呈味核苷酸分離的影響Fig.3 Chromatogram of effect of buffer concentration on the separation of flavor nucleotides

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性考察

在色譜條件下，混合對(duì)照品溶液與四角蛤蜊、菲律賓蛤仔供試品溶液的色譜圖見圖4，樣品中4種呈味核苷酸均達(dá)到基線分離。

2.2.2 線性關(guān)系考察

分別將質(zhì)量濃度為0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL的5’-UMP，5’-GMP，5’-IMP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL的5’-AMP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述色譜條件取10 μL注入高效液相色譜儀，以峰面積Y對(duì)核苷酸濃度X進(jìn)行回歸計(jì)算，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程見表1。

圖4 呈味核苷酸對(duì)照品(標(biāo)樣)及樣品(A四角蛤蜊、B菲律賓蛤仔)色譜圖Fig. 4 HPLC chromatogram of flavor nucleotides(Std) and samples(A,B)

表1 4種呈味核苷酸的線性關(guān)系和線性范圍

2.2.3 精密度考察

取“1.3.2”項(xiàng)下的供試品溶液，將同一份樣品在色譜條件下平行測(cè)定6次，樣品中5’-UMP，5’-GMP，5’-IMP，5’-AMP經(jīng)過測(cè)定后，相對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是0.31%、0.37%、0.39%、0.42%，符合精密度要求。

2.2.4 重復(fù)性與穩(wěn)定性考察

取四角蛤蜊(批號(hào)20150714)、菲律賓蛤仔(批號(hào)20150920) 100g，按供試品溶液制備方法平行制備6份，按1.2.3色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定相應(yīng)峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果表明5’-UMP，5’-GMP，5’-IMP，5’-AMP的RSD為2.30%、2.22%、1.98%、1.92%，表明該方法的重復(fù)性良好。

對(duì)樣品中核苷酸的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，分別考察0、2、4、8、12、24 h的峰面積，結(jié)果表明5’-UMP，5’-GMP，5’-IMP，5’-AMP的RSD為1.72%、2.25%、1.89%、1.51%，表明四角蛤蜊、菲律賓蛤仔中4種核苷酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 加樣回收率考察

取2.2.4中的四角蛤蜊(批號(hào)20150714)共6份，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各核苷酸含量，分別加入等量的混合對(duì)照品，密塞，搖勻，按照1.3.2供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，在1.3.3色譜條件進(jìn)樣，平行3次，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，5’-UMP，5’-GMP，5’-IMP，5’-AMP的平均加樣回收率在96.19%～103.25%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.08%～1.28%之間，表明該測(cè)定方法的準(zhǔn)確度符合要求，研究方法可靠。

表2 樣品中呈味核苷酸的回收率(n=6)

2.3 樣品中呈味核苷酸的測(cè)定

取四角蛤蜊與菲律賓蛤仔適量，按照1.3.2供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，在1.3.3色譜條件進(jìn)樣，平行3次，結(jié)果見表3。由表3可知，四角蛤蜊與菲律賓蛤仔中均含有4種呈味核苷酸，且5’-UMP，5’-IMP及5’-AMP均含量相似，而5’-GMP在這兩種貝類中含量差異明顯(P<0.05)。在四角蛤蜊與菲律賓蛤仔中，5’-AMP的含量明顯高于其他呈味核苷酸，而5’-GMP的含量最低。

味道強(qiáng)度值(taste activity value, TAV)=滋味物質(zhì)的含量/該滋味物質(zhì)的閾值。當(dāng)呈味物質(zhì)的TAV值大于1時(shí)，說明該呈味物質(zhì)對(duì)滋味有貢獻(xiàn)，其值越大表明貢獻(xiàn)越大，反之則對(duì)味道貢獻(xiàn)不大[12]。結(jié)果表明四角蛤蜊與菲律賓蛤仔中鮮味的來源主要是5’-AMP，其次是5’-IMP和5’-GMP。

表3 四角蛤蜊、菲律賓蛤仔中4種呈味核苷酸的含量及呈味強(qiáng)度值

注：同一行中字母相同表示均值間差異不顯著(P>0.05)，字母不同則表示差異顯著(P<0.05)。

3 討論

本文建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定四角蛤蜊、菲律賓蛤仔中呈味核苷酸含量的方法，該方法快速簡便，重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性良好，可應(yīng)用于江蘇低值貝類四角蛤蜊、菲律賓蛤仔中核苷酸的含量測(cè)定。測(cè)定結(jié)果表明四角蛤蜊、菲律賓蛤仔中均含有4種呈味核苷酸 (見表3)，其中5’-AMP含量最多，其次是5’-IMP和5’-UMP，5’-GMP含量相對(duì)較低。

在呈味強(qiáng)度上，5’-AMP是提供四角蛤蜊與菲律賓蛤仔鮮味的主要來源，其次是5’-IMP和 5’-GMP，這與四角蛤蜊、菲律賓蛤仔作為鮮食貝類密切相關(guān)。造成不同呈味核苷酸含量和鮮味的差異可能與貝類攝食的藻類，海洋的環(huán)境及采收期等有關(guān)，后續(xù)將開展不同產(chǎn)地及采收期的貝類中核苷酸動(dòng)態(tài)變化規(guī)律研究，為貝類食品或保健品開發(fā)提供依據(jù)。

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Determination of flavor nucleotides inMactraveneriformisandRuditapesphilippinarumby high performance liquid chromatography

ZHANG Qian1,2,LIU Rui1,2,3,WANG Xin-zhi1,2,3,CHENG Jian-ming1,2,3, ZHANG Wen-ying1,2,DU Jun-chao1,2,WU Hao1,2,3*

1(College of Pharmacology, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China) 2(Jiangsu Key Laboratory of Research and Development in Marine Bio-resource Pharmaceutics, Nanjing 210023, China) 3(Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing 210023, China)

A method was established for determination of flavor nucleotides inMactraveneriformisandRuditapesphilippinarumby high performance liquid chromatography. Methods: Separation and quantization were perfored by using a Waters Atlantis T3 column, with 0.01 mol/L KH2PO4- methanol as the mobile phase in gradient elution. The detection wavelength was 260 nm. Results: The external standard calibration curves were used for quantization. A good linear correlations for flavor nucleotide was shown withR2>0.999 9. The average spike recovery of flavor nucleotides was 96.19%-103.25%, with relative standard deviations of 96.19%-103.25%. Conclusion: The method is simple, with good reproducibility, sensitivity and high accuracy. It is suitable for determining flavor nucleotides inMactraveneriformisandRuditapesphilippinarum. The method provideds a basis for the research of shellfish flavor and the development of shellfish food.

high performance liquid chromatography(HPLC);Mactraveneriformis;Ruditapesphilippinarum; flavor nucleotides

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703039

碩士研究生(吳皓教授為通訊作者，E-mail：whao5795@vip.sina.com)。

國家公益性海洋行業(yè)專項(xiàng)基金(201305007，201405017)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃，2013AA093003)；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目(PAPD)；江蘇省青藍(lán)工程；江蘇省“333”工程

2016-05-27，改回日期：2016-08-15