1株總狀毛霉CGMCC8700的鑒定及蛋白質(zhì)譜分析

蔣立文，謝靚，廖盧艷，周紅麗，周輝，曾玉倫

1(食品科學與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙,410128) 2(湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，湖南 長沙,410128)

1株總狀毛霉CGMCC8700的鑒定及蛋白質(zhì)譜分析

蔣立文1,2*，謝靚1,2，廖盧艷1,2，周紅麗1,2，周輝1,2，曾玉倫1,2

1(食品科學與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙,410128) 2(湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，湖南 長沙,410128)

毛霉是發(fā)酵大豆制品常用的菌種，通過常規(guī)分離方法從自然發(fā)酵的豆制品中分離得到一種純種霉菌，采用培養(yǎng)和顯微觀察方法，分析其脂肪酸組成、(G+C)%摩爾含量、rRNA基因序列的ITS1-5.8S-ITS2區(qū)、結(jié)合蛋白質(zhì)譜分析毛霉蛋白質(zhì)的組成。經(jīng)過鑒定該霉菌為總狀毛霉(CGMCC8700)，菌絲為棉絮狀，有厚垣孢子，孢子呈卵圓形或橢圓形，黃褐色，G+C摩爾含量為39.53%，TM值為70%，rRNA基因序列的ITS1-5.8S-ITS2區(qū)包括640個堿基，蛋白質(zhì)全譜質(zhì)譜鑒定為該毛霉有1 304個特定的肽段，鑒定到肽段的長度集中在8和22之間，但長度為11的肽段最多，平均肽段長度為14.62，平均蛋白質(zhì)的鑒定覆蓋度為17.25%。這些指標與毛霉菌發(fā)酵特性有關(guān)。

總狀毛霉CGMCC8700；脂肪酸；TM值；質(zhì)譜

毛霉菌種是一種重要的微生物資源，中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)保藏的65種毛霉菌中，有19種標注可以用于腐乳或者豆豉生產(chǎn)；中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)公開的毛霉菌有309種，可用于腐乳或豆豉生產(chǎn)的僅有1種，為五通橋毛霉(3.00025)。這說明釀造專用的微生物資源沒有建立統(tǒng)一的信息庫。目前國內(nèi)毛霉的研究很多，主要代表性研究集中在酶系分布、發(fā)酵特性、產(chǎn)品品質(zhì)等方面[1-5]。

關(guān)于毛霉菌CGMCC8700的運用已經(jīng)有很多相關(guān)研究，主要體現(xiàn)在對毛霉菌前期選育[6-8]、豆豉生產(chǎn)[9-14]、酶系分布及與風味變化關(guān)系[15-16]、發(fā)酵過程中異黃酮的轉(zhuǎn)化[17]等。

蛋白質(zhì)組全譜分析是指以完整的組織、細胞、血液或體液等復雜樣本為研究對象，采用質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學方法，識別出樣品中盡可能多的多肽或蛋白序列，并對其做一系列相關(guān)功能注釋。目前基于質(zhì)譜技術(shù)的大規(guī)模蛋白質(zhì)組鑒定技術(shù)已非常成熟，該技術(shù)已顛覆了傳統(tǒng)鑒定蛋白質(zhì)序列(如Edman法、2-DE)的方法[18-19]。與傳統(tǒng)方法相比，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學研究具有通量大、精度高、適用范圍廣等特點，并且在食品營養(yǎng)與健康方面運用廣泛[20]，真菌的蛋白質(zhì)研究也受到關(guān)注[21-22]。為強化對毛霉菌的系統(tǒng)研究，本研究將以傳統(tǒng)豆豉、腐乳分離出來的毛霉菌(中國工業(yè)微生物菌種保藏中心登記注冊號為：CGMCC8700)為對象，其進行了分析和鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

毛霉菌種來源：CGMCC8700，菌種保藏用培養(yǎng)基：Potato Dextrose Agar (PDA )。

主要試劑：45 g NaOH溶于150 mL甲醇和150 mL蒸餾水中(溶液1)；190 mL濃HCl，275 mL溶于135 mL蒸餾水中(溶液2)；200 mL正己烷與200 mL甲基叔丁醚均勻混合(溶液3)；10.8 g NaOH溶于90 mL蒸餾水中(溶液4)；飽和NaCl溶液(溶液5)。

1.2 儀器與設(shè)備

HP6980氣相色譜分析儀，美國Agilent公司[配備分流/不分流進樣口，氫火焰離子化檢測器(FID)及HP氣相色譜工作站(HP chemstationver A5.05),色譜柱為Ultra-2柱，柱長25 m，內(nèi)徑0.2 mm，濾膜厚度為0.33 μm]；TripleTOFTM5600 plus高分辨質(zhì)譜儀，AB sciex公司的Lambda35UV/VIS Spectrometer紫外/可見分光光度計，美國Perkin/Elmer公司；Sherolock全自動細菌鑒定系統(tǒng)，美國MIDI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種顯微鑒定

選取生長速度快，菌絲致密，孢子量多的單個菌落，繼續(xù)進行多次點種培養(yǎng)，然后用稀釋平板分離，待長出單菌落移接斜面。進行初步的應用試驗[6]后進行保存、鑒定、測試生長表征指標。

1.3.2 測定菌株DNA中G+C mol%的方法

(1)將待測DNA樣品0.1×SSC稀釋至OD260值在0.3～0.4；(2)在波長260 nm下首先記錄25 ℃時的OD值，然后設(shè)定升溫程序，從65 ℃升溫到95 ℃，每分鐘升溫1 ℃；(3)OD值上升表示變性開始，記錄比色皿的溫度和OD值，直到OD值不變，代表變性已經(jīng)結(jié)束；(4)根據(jù)熱變性曲線，得出熔鏈溫度TM值，計算G+C mol%的含量。0.1×SSC溶液中計算公式為：

G+C mol%=G+C mol%1.365+2.08(TM未知-TM1.365)

1.3.3 菌種脂肪酸測定方法

(1)用接種環(huán)從培養(yǎng)基表面掛取少量的真菌培養(yǎng)物，在8 mL螺口玻璃管中，加入1 mL溶液1，擰緊螺蓋，沸水浴5 min，取出振蕩5～10 s，再擰緊螺蓋，沸水浴25 min；(2)待樣品管冷卻后，再加入2 mL溶液2，蓋嚴振蕩，然后于(80±1)℃進行恒溫水浴，冰浴冷卻；(3)在冷卻管中加入1.25 mL溶液3，快速振蕩10 min，棄去下層水相，再加入3 mL溶液4和幾滴溶液5，快速振蕩5 min，取2/3有機相于樣品瓶中，進行測定；(4)色譜分析條件：采用HP6980氣相色譜分析儀，爐溫為二階程序升溫，起始溫度為170 ℃，每5 ℃/min升溫至260 ℃，隨后以每分鐘40 ℃升溫到310 ℃維持1.5 min。進樣口溫度為250 ℃，載氣為H2，進樣速度為0.5 mL/min,分流進樣模式，分流比為100∶1，進樣量為2 μL，檢測器溫度為300 ℃，H2流速30 mL/min，空氣流速為216 mL/min，補充氮氣流速為 30 mL/min。

1.3.4 蛋白質(zhì)全譜測定的實驗流程

(1)蛋白提取：將分離純化的純種斜面收集培養(yǎng)物，用200 μL的TEAB，用超聲破碎儀進行破碎，加入4倍體積的冷丙酮(含終濃度為10 mmol/L DTT)沉淀2 h,13 000 r/min 離心20 min，收集沉淀；加入800 μL的冷丙酮(含終濃度為10 mmol/L DTT)重懸沉淀；13 000 r/min離心20 min，收集沉淀，然后風干沉淀，加入100 μL的TEAB溶解蛋白；(2)蛋白質(zhì)定量：采用 Bradford定量；(3)蛋白質(zhì)的SDS-PAGE檢測、酶切、標記；(4)除鹽：將標記過程中的標記試劑和相關(guān) buffer 的鹽除去，以便于后續(xù)分析；(5)等量混合各樣本中的標記肽段；(6)MS/MS質(zhì)譜檢測及分析；(7)生物信息分析。

1.4 主要測定方法

1.4.1 微生物主要培養(yǎng)特征及顯微特征的鑒定

采用PDA培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，同時利用常規(guī)顯微試驗對菌絲生產(chǎn)、繁殖體生成情況進行顯微鑒定。

1.4.2 測定菌株DNA中G+C mol%的方法

采用溶解溫度法(Tm值)，以大腸菌群埃希氏大腸桿菌E.coliK12(CGMCC1.365)為參比對照，儀器采用紫外分光光度計測定，用PTP-1數(shù)字溫控儀控溫。

1.4.3 菌體脂肪酸含量

采用Sherolock全自動細菌鑒定系統(tǒng)對菌株進行菌種脂肪酸測定。

1.4.4 微生物蛋白質(zhì)全譜分析

Uniprot/Mucor(包含23827條蛋白質(zhì)序列)(2016年3月更新)數(shù)據(jù)庫。采用與 AB Sciex 5600 plus 配套的搜索引擎——ProteinPilot v4.5 進行數(shù)據(jù)解析。在選擇數(shù)據(jù)庫時，遵循如下原則：若為已經(jīng)測序生物，直接選用該物種數(shù)據(jù)庫，若為非測序生物，則選擇與被測樣品最為相關(guān)的大類蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與討論

2.1 選育菌種的培養(yǎng)特征、顯微特征

經(jīng)鑒定為總狀毛霉(Mucorracemosus)，平皿生長可布滿培養(yǎng)基，菌絲為薄棉絮狀，淺黃褐色(圖1a)；孢囊具有短的、稀疏的假軸狀分枝，孢子囊直徑在(20～100) μm(圖1b)，囊軸近卵形，(17～60) μm×(10～45) μm(圖1c)，孢囊孢子近球形，寬橢圓形，單個無色，聚集在孢囊中呈灰褐色(5～8.5) μm×(4～7) μm(圖1d)。結(jié)合孢子未見，厚垣孢子形狀、大小不一致，無色或者淺黃色(圖1d)。

圖1 總狀毛霉培養(yǎng)特征、顯微特征Fig.1 Mucorracemosus cultural characteristics, microscopic characteristics

2.2 毛霉菌種的TM值和G+C mol %

按照規(guī)定的方法，測定的TM值和G+C%含量見表1。根據(jù)TM值毛霉菌的變性溫度比大腸桿菌低，毛霉菌的耐熱性比大腸桿菌還要差些，同時可以推斷大腸桿菌G+C mol %高于毛霉菌。

表1 CGMCC8700的TM值和G+C mol%含量

2.3 脂肪酸組成測定

細胞中脂肪酸構(gòu)成對菌種性能有非常重要的作用和意義。從表2可以看出，飽和脂肪酸C14∶0、C16∶0、C18∶0占總比例超過25.46%，不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸比例為2.67∶1，脂肪酸含量、飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量的比例直接影響微生物本身細胞膜的流動性及可能的低溫下生長適應能力。其組成與微生物細胞結(jié)構(gòu)、耐熱性、生長特性密切相關(guān)[23]。

表2 總狀毛霉菌脂肪酸組成測定

2.4 蛋白質(zhì)全譜鑒定的結(jié)果

采用基于質(zhì)譜方法的蛋白質(zhì)組鑒定基本流程，即對MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過系列優(yōu)化處理后與數(shù)據(jù)庫進行相似性比較打分從而進行蛋白鑒定。蛋白質(zhì)鑒定信息統(tǒng)計結(jié)果見表3。

表3 蛋白質(zhì)鑒定信息表

注：*表示可信度至少為95%以上，**表示至少含有2個unique肽段的鑒定蛋白質(zhì)數(shù)目。

2.4.1 Unique肽段數(shù)分布

圖2 CGMCC8700中鑒定蛋白中的 unique 肽段數(shù)分布Fig.2 Unique peptide profile of identified several proteins in CGMCC 8700

Unique肽段為僅在一個蛋白質(zhì)中存在的肽段。由這類型肽段的存在，可以唯一地確定相應蛋白質(zhì)的存在。圖2為CGMCC8700鑒定到的所有蛋白所包含的95%可信度Unique肽段數(shù)的雙坐標分布圖，橫坐標為蛋白質(zhì)包含的Unique肽段數(shù)，左側(cè)縱坐標為與橫坐標對應的蛋白數(shù)目；右側(cè)縱坐標為與橫坐標對應的累計蛋白比例，從鑒定結(jié)果可以看出，至少含有2個Unique肽段的蛋白質(zhì)數(shù)目為1 304，占總蛋白質(zhì)的73.42%。Unique肽段是針對毛霉菌CGMCC8700特有的肽段，在至少含有Unique-2肽段在鑒定比例達到70%以上，說明其獨特性，這為以后深入研究不同毛霉菌本身蛋白特性提供了依據(jù)。

2.4.2 肽段長度分布

圖3是本次鑒定到肽段的長度分布。從圖3中可以看出，CGMCC8700鑒定到肽段的長度也同樣集中在 8 和 22 之間，但長度為 11 的肽段最多，平均肽段長度為14.62，肽段數(shù)量適當。如果鑒定到的肽段偏高或者偏低，說明實驗階段使用的酶選用不恰當，使得酶切肽段大部分高于或者低于質(zhì)譜儀的檢測范圍，從而使得可檢測肽段偏少，鑒定蛋白數(shù)目降低。此次鑒定到的肽段主峰在11、12，介于質(zhì)譜儀的鑒定范圍中值，保證鑒定到足夠多的蛋白。

圖3 CGMCC8700中肽段長度分布Fig.3 Peptide segment length distribution in CGMCC 8700

2.4.3 蛋白覆蓋度分布

對于一個鑒定到的蛋白質(zhì)，如果包含支持該蛋白的肽段數(shù)目越多，說明該蛋白的可信度越高。因此，蛋白質(zhì)的鑒定覆蓋度也能間接反應鑒定結(jié)果的整體準確性。圖4為CGMCC8700蛋白質(zhì)鑒定(95%可信度肽段)覆蓋度分布餅圖中，不同顏色的餅代表了具有不同鑒定覆蓋度范圍的蛋白質(zhì)百分比。CGMCC8700鑒定覆蓋度在(0, 10%)范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)百分比為40.6%，覆蓋度大于等于20%的蛋白占總蛋白的33.44%，平均蛋白質(zhì)的鑒定覆蓋度為17.25%。

圖4 CGMCC8700蛋白鑒定覆蓋度的整體分布Fig.4 coverage of the distribution of identified protein in CGMCC 8700

蛋白鑒定主要是鑒定Unique肽段(Unique肽段指每個蛋白或者蛋白家族特有的多肽序列)，而unique肽段占蛋白質(zhì)全長的比例一般較低，因此鑒定的蛋白質(zhì)覆蓋度偏低的較多，所以此數(shù)據(jù)是具有參考價值的。

3 結(jié)論

該菌株經(jīng)過鑒定為總狀毛霉(CGMCC8700)，菌絲為棉絮狀，有厚垣孢子，孢子呈卵圓形或橢圓形，黃褐色，G+C含量為39.53%，TM值為70%，rRNA基因序列的ITS1-5.8S-ITS2區(qū)包括640個堿基，蛋白質(zhì)全譜質(zhì)譜鑒定為該毛霉有1 304個特定的肽段，鑒定到肽段的長度集中在8和22之間，但長度為11的肽段最多，平均肽段長度為14.62，平均蛋白質(zhì)的鑒定覆蓋度為17.25%。

上述研究結(jié)果只是對從傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品分離得到的1株毛霉菌進行初步的鑒定和分析，得到了一些有意義有價值的信息但需要更加系統(tǒng)，或許可采用相關(guān)的其他類似菌株比較相關(guān)指標的差異性來確定分離得到微生物的差異，這有待進一步探索。

發(fā)酵微生物是傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品的核心和靈魂，其優(yōu)良的生長條件、形成所需要的酶系復合型、定時定向分泌酶系得到相應的代謝產(chǎn)物是發(fā)酵食品重要的研究內(nèi)容，這將為發(fā)酵食品的差異性、功能性、營養(yǎng)性等奠定非常重要的基礎(chǔ)。因此充分比較更應該采用更多的類似樣本，建立發(fā)酵食品微生物資源庫，實現(xiàn)資源共享，同時利用宏基因組學、代謝組學等有機結(jié)合[20]，探討菌種特性、酶系的形成控制和釋放、風味與品質(zhì)形成之間的關(guān)聯(lián)性[24-26]，這是下一步研究的重要方向。

致謝：上述分析得到了中國科學院微生物研究所和杭州聯(lián)川生物信息技術(shù)有限公司的支持，在此表示感謝。

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Identification and protein spectrum analysis ofMucorracemosusCGMCC8700

JIANG Li-wen1,2*, XIE Jing1,2，LIAO Lu-yan1,2, ZHOU Hong-li1,2, ZHOU Hui1,2, ZENG Yu-lun1,2

1(Hunan Provincial Key Laboratory of Food science and Biotechnology,Changsha 410128, China) 2(College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University,Changsha 410128, China)

Mucor is a kind of specie commonly used for fermented soybean products. In this paper, a pure mold was isolated from naturally fermented soy products using conventional separation methods. Through culture and microscopic observation method, its fatty acid composition, (G+C)% (mol) content, rRNA gene sequence ITS1-5.8S-ITS2 region, binding protein spectrum were analyzed. The results showed that it was identified asMucorracemosus(CGMCC8700) and had mycelium of cotton wool, thick wall sporeswith oval or elliptical shape, brown color, G+C mol content of 39.53%, andTMvalue of 70%. ITS1-5.8S-ITS2 region of rRNA gene sequence comprising 640 bp. Proteins spectrum identified by mass spectrometry had 1 304 specific peptides forMucorracemosus. The sizes of the identified peptides were ranged from 8aa to 22aa with average size of 14.62aa, wherein the number of 11aa peptide was the highest. The average coverage for identification of protein was 17.25%. These indices were related to fermentation characteristics.

MucorracemosusCGMCC8700;fatty acid;TMvalue; mass spectrum(MS)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703014

博士，教授(本文通訊作者，E-mail：1024305380@qq.com)。

國家自然科學基金(31571819)

2016-10-10，改回日期：2016-11-29