小分子糖及糖醇體外抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響

劉國玉，柳嘉，萬寧，王璽，倪慶桂，喻勤，孫忠偉，杜玉蘭，嚴建剛，王菲，段盛林*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 2(完美(中國)有限公司，廣東 廣州，528402) 3(北京市科學技術委員會，北京，100195)

小分子糖及糖醇體外抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響

劉國玉1，柳嘉1，萬寧1，王璽1，倪慶桂2，喻勤2，孫忠偉2，杜玉蘭2，嚴建剛2，王菲3，段盛林1*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 2(完美(中國)有限公司，廣東 廣州，528402) 3(北京市科學技術委員會，北京，100195)

研究了D-木糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、棉籽糖、水蘇糖、赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇、山梨糖醇、木糖醇以及麥芽糖醇等小分子糖及糖醇對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，以期為降糖營養(yǎng)食品的開發(fā)提供參考。通過高效液相色譜法，確定α-葡萄糖苷酶對糖及糖醇的分解作用，進一步檢測各種糖及糖醇在蔗糖底物存在下對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，將抑制效果較好的糖及糖醇進行復配，利用Calcusyn軟件計算復配結果，觀察樣品的相互作用。D-木糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇、山梨糖醇均能抑制α-葡萄糖苷酶的活性，且D-木糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇以及山梨糖醇的IC50值分別為23.89 mg/mL、15.03 mg/mL、9.75 mg/mL、3.19 mg/mL、20.64 mg/mL、106.19 mg/mL。赤蘚糖醇分別與海藻糖、異麥芽酮糖醇復配后對α-葡萄糖苷酶的抑制作用明顯增強(聯(lián)合指數(shù)CI<1)，表現(xiàn)出協(xié)同效應。結論：赤蘚糖醇與海藻糖或異麥芽酮糖醇復配后(CI<1)有助于增強對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

功能性糖；糖醇；α-葡萄糖苷酶；復配；體外抑制

由于環(huán)境和生活方式變化，人類疾病譜發(fā)生了很大轉(zhuǎn)變，糖尿病、心血管疾病、肥胖癥等慢性疾病比例不斷上升，已成為目前全球性重大的公共衛(wèi)生問題[1]。其中，糖尿病已成為繼心腦血管病、腫瘤之后位居第3的慢性非傳染疾病，在臨床上以高血糖為主要特征[2-3]，若血糖控制不佳則會導致全身多系統(tǒng)、多臟器損害，引發(fā)各種急慢性并發(fā)癥。研究表明，血糖主要來源于食物中的糖類[4]，α-葡萄糖苷酶是調(diào)節(jié)食物來源血糖的關鍵酶，食物中的碳水化合物經(jīng)過口腔、胃到達小腸時，被小腸上皮絨毛膜刷狀緣上的多種α-葡萄糖苷酶(如蔗糖酶、麥芽糖酶、淀粉葡萄糖苷酶等)分解為單糖，最終被機體吸收利用。因此，設計安全有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑來抵抗糖尿病成為人們研究的熱點。目前，臨床上多采用藥物療法[5]，如阿卡波糖和伏格列波糖作為α-葡萄糖苷酶抑制劑來控制血糖，但其制備工藝復雜，生產(chǎn)成本高昂且副作用明顯。研究發(fā)現(xiàn)，部分功能性糖能抑制α-葡萄糖苷酶活性，減少葡萄糖生成量，進而降低餐后引起的血糖波動。功能性糖包括功能性單糖、寡糖、糖醇等小分子糖以及植物性多糖。關于功能性糖對血糖值的影響國外報道較多[6-9]，而國內(nèi)多通過研究植物多糖組分探究其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用[10-12]。目前，有關海藻糖、棉籽糖、水蘇糖及糖醇對α-葡萄糖苷酶抑制作用的探究鮮見報道，且關于寡糖與糖醇的復配物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究未見報道。故本研究對部分單糖、寡糖、糖醇及其復配物的α-葡萄糖苷酶抑制活性進行了探究，篩選出具有降糖特性的糖及糖醇復配物，并將其運用到糖尿病患者飲食中，如制備糖尿病患者食用的谷物食品、焙烤食品、甜味劑和牛奶等食物，以期為降糖食品的開發(fā)提供參考。

目前，試驗室多采用紫外分光光度法篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑，試劑消耗大且重現(xiàn)性差，準確度相對較低，尤其對有顏色干擾的樣品，其假陽性高[13]。而利用高效液相色譜法，以蔗糖為底物時，不僅出峰時間快，與其他樣品峰無重疊現(xiàn)象，而且底物峰面積隨酶解時間的延長呈現(xiàn)規(guī)律性變化，準確性高且重現(xiàn)性好，有學者[12,14]曾分別以蔗糖和麥芽糖為底物探究L-阿拉伯糖和桑葉多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)L-阿拉伯糖和桑葉多糖以蔗糖為底物時對酶活的抑制作用要顯著大于以麥芽糖為底物時對酶活的抑制作用。本研究采用高效液相色譜法，以蔗糖為底物，利用Hypersil NH2S氨基色譜柱分離糖及糖醇的特性，根據(jù)蔗糖峰面積的變化，分析各種糖及糖醇對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，并將不同糖及糖醇復配組合，觀察復配物對抑制酶活是否有增強作用，通過Calcusyn數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對不同濃度的抑制劑和相應抑制率進行分析，得到半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。IC50值越小，抑制活性越強，以此為依據(jù)研究各種糖及糖醇的活性差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糖醇：麥芽糖醇、異麥芽酮糖醇 、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇；單糖：D-木糖、L-阿拉伯糖；二糖：海藻糖；三糖：棉籽糖，以上原料均來自上海士豐生物科技有限公司，純度>98%；四糖：水蘇糖，中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院制備，純度>97%；α-葡萄糖苷酶(50 U/mg)，上海士豐生物科技有限公司；蔗糖(化學純)；乙腈、甲醇(均為色譜純或優(yōu)級純)。

1.2 儀器與設備

LC-20AT型高壓液相色譜儀、RID-10A示差折光檢測器，日本島津公司；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；DK-8D三溫三控水槽，上海博迅實業(yè)有限公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 色譜條件

色譜柱：Hypersil NH2S氨基色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；流動相：V(乙腈)∶V(水)=70∶30；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

1.4 溶液的配制

1.4.1 母液的配制

分別精確稱取0.50 g蔗糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、水蘇糖、麥芽糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇、異麥芽酮糖醇、海藻糖、棉籽糖樣品，用去離子水定容于 10 mL 容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為 50 mg/mL的母液，備用。

1.4.2 樣品溶液的配制

用移液管分別吸取按1.4.1配制的母液，用去離子水定容至10 mL容量瓶中，分別配制質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10 mg/mL的赤蘚糖醇溶液，3、6、9、12、15 mg/mL的海藻糖溶液、D-木糖溶液、L-阿拉伯糖溶液、山梨糖醇溶液以及5、10、15、20、25 mg/mL的異麥芽酮糖醇溶液。

1.4.3 復配溶液的配制

用移液管分別吸取按1.4.1配制的母液，分別配制赤蘚糖醇溶液終質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，海藻糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、異麥芽酮糖醇以及山梨糖醇樣品相應終質(zhì)量濃度為1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 mg/mL的混合溶液。

1.4.4α-葡萄糖苷酶溶液的配制

精密稱取20.0 mgα-葡萄糖苷酶于10 mL容量瓶中，用去離子水定容，得到0.1 U/μL的α-葡萄糖苷酶溶液。

1.5 標準曲線的制作

用移液管分別取0.2、0.4、0.6、1、2 mL上述蔗糖母液，用去離子水定容于10 mL容量瓶中，配制質(zhì)量濃度分別為1、2、3、5、10 mg/mL的標準溶液，充分搖勻，溶液過0.45 μm微孔濾膜后上高效液相色譜測定。以峰面積為縱坐標(y)，以蔗糖濃度為橫坐標(x)，做標準曲線，得線性回歸方程y=81 035x+1 678，r2=0.999 6，在0～10 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

1.6 試驗過程與計算方法

試驗分組如下，依次加入去離子水、樣品溶液，混合均勻，于37 ℃保溫10 min，結束后，取出，加入37 ℃酶溶液，充分混勻，于37 ℃反應40 min后，沸水浴滅酶，而后10 000 r/min離心10 min，取上清液過 0.45 μm 微孔濾膜后上高效液相色譜測定。

試驗共設定4個組，每組3個平行，分別為：

①對照組(900 μL去離子水+100 μL樣品)

②測試組(850 μL去離子水+100 μL樣品+50 μL酶液 )

③樣品對照組(850 μL去離子水+100 μL底物+50 μL酶液 )

④樣品測定組(750 μL去離子水+100 μL樣品+100 μL底物+50 μL酶液)

抑制率按公式(1)計算：

(1)

式中：C對為樣品對照組蔗糖濃度，mg/mL；C測為樣品測定組蔗糖濃度,mg/mL；C初為初始蔗糖濃度,mg/mL。

1.7 數(shù)據(jù)分析方法

每組試驗重復3次，結果以x±s表示。試驗數(shù)據(jù)采用Origin8.1 軟件進行單因素方差(One-Way ANOVA)分析，來判斷顯著性差異，P<0.05代表有顯著性差異，P<0.01代表有極顯著性差異，樣品復配后的相互作用通過Calcusyn軟件進行分析，根據(jù)聯(lián)合指數(shù)(Combination Index，CI)值來判斷，CI<1、CI=1、CI>1分別代表協(xié)同、疊加、拮抗。

2 結果與分析

2.1 糖及糖醇對α-葡萄糖苷酶的影響

配制對照組和測試組，按1.3的色譜條件和1.6的方法操作，比較酶存在或不存在的條件下，糖及糖醇樣品峰的變化，以考察其能否被酶分解。

研究發(fā)現(xiàn)，酶存在時，D-木糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、棉籽糖、水蘇糖、山梨糖醇、木糖醇和赤蘚糖醇的液相色譜圖與未加酶時對應的色譜圖相比，出峰時間一致且出峰面積基本相等，可知此類糖及糖醇不能被α-葡萄糖苷酶分解(圖略)。而麥芽糖醇和異麥芽酮糖醇(如圖1)在酶存在時峰面積比未加酶的峰面積小，且色譜圖中出現(xiàn)了2個小峰(如箭頭所示)，說明麥芽糖醇和異麥芽酮糖醇能部分被α-葡萄糖苷酶分解，經(jīng)檢測，異麥芽酮糖醇分解生成的物質(zhì)出峰時間與葡萄糖、山梨糖醇出峰時間一致，表明異麥芽酮糖醇能被α-葡萄糖苷酶分解為葡萄糖和山梨糖醇。

a-未加酶時糖醇樣品；b-加酶時糖醇樣品圖1 麥芽糖醇(A)和異麥芽酮糖醇(B)的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of maltitol (A) and isomaltitol (B)

2.2 糖及糖醇對α-葡萄糖苷酶分解蔗糖能力的影響

配制樣品對照組和不同糖及糖醇的樣品測定組，觀察各種糖及糖醇對酶分解蔗糖能力的影響，溶液中剩余的蔗糖濃度越高，表明該糖或糖醇抑制酶分解蔗糖的能力越強，試驗結果如圖2所示。

A-蔗糖+酶；B-L-阿拉伯糖+蔗糖+酶；C-D-木糖+蔗糖+酶；D-海藻糖+蔗糖+酶；E-棉籽糖+蔗糖+酶；F-水蘇糖+蔗糖+酶；G-異麥芽酮糖醇+蔗糖+酶；H-山梨糖醇+蔗糖+酶；I-赤蘚糖醇+蔗糖+酶；J-麥芽糖醇+蔗糖+酶；K-木糖醇+蔗糖+酶圖2 各種糖及糖醇對α-葡萄糖苷酶分解蔗糖程度的影響Fig.2 The effect of various sugars and sugar alcohols on the sucrose decomposition degree of α-glucosidase*p<0.05，與A組相比有顯著性差異，** p<0.01，與A組相比有極顯著性差異。

由圖2可知，L-阿拉伯糖、D-木糖、海藻糖、赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇能極顯著(P<0.01)抑制α-葡萄糖苷酶的活性，山梨糖醇能顯著(P<0.05)抑制α-葡萄糖苷酶的活性，從而使蔗糖分解減少。水蘇糖能極顯著(P<0.01)促進蔗糖分解，即能促進酶對蔗糖的分解作用，水蘇糖是由果糖、葡萄糖以及2個半乳糖聚合形成的四糖結構，難以被人體消化酶分解，且王曉莉[15]等研究發(fā)現(xiàn)，水蘇糖具有降血糖的作用，本試驗中水蘇糖促進蔗糖分解，表明其降糖作用并不是通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性來實現(xiàn)的，具體的降糖機制還需進一步探究；棉籽糖、麥芽糖醇和木糖醇對蔗糖分解未見顯著影響。實驗結果表明，糖及糖醇抑制體外α-葡萄糖苷酶活性試驗中，D-木糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇、山梨糖醇均能較好地抑制α-葡萄糖苷酶活性，而其他的糖及糖醇對該酶的抑制活性表現(xiàn)較差。為研究各種糖及糖醇抑制α-葡萄糖苷酶活性強弱，選取上述有酶抑制作用的糖及糖醇，設計濃度梯度，計算相應的酶抑制率，通過Calcusyn軟件對數(shù)據(jù)進行分析，求得IC50值，從而得到抑制α-葡萄糖苷酶的最佳糖及糖醇樣品。

2.3 不同濃度的糖及糖醇對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

按1.4.2小節(jié)配制樣品溶液，測定蔗糖峰面積，計算反應后蔗糖終質(zhì)量濃度，計算抑制率，試驗結果如圖3所示。

圖3 不同濃度下赤蘚糖醇(A)、海藻糖(B)、L-阿拉伯糖(C)、D-木糖(D)、山梨糖醇(E)、異麥芽酮糖醇(F)對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.3 The inhibitory effects of different concentrations of erythrito(A), trehalose (B), L-arabinose (C),D-xylose (D), sorbitol (E) and isomaltitol (F) on α-glycosidase activity

由圖3可以看出，D-木糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、赤蘚糖醇以及異麥芽酮糖醇隨著濃度的增加，對酶的抑制率逐漸增強。通過Calcusyn軟件處理數(shù)據(jù)，得到D-木糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、赤蘚糖醇以及異麥芽酮糖醇的IC50值分別為23.89 mg/mL、15.03 mg/mL、9.75 mg/mL、3.19 mg/mL和20.64 mg/mL，與其他小分子糖及糖醇比較，赤蘚糖醇作用濃度較低且有較好

的酶抑制效果，IC50值較小，因此，本試驗選用赤蘚糖醇與其他糖及糖醇復配。

2.4 赤蘚糖醇與其他糖及糖醇復配后對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由2.3可知，糖及糖醇抑制率達到50%時，赤蘚糖醇相應的作用濃度較低，而其他糖及糖醇作用濃度較高，因此，按1.4.3配制混合溶液，計算抑制率，實驗結果見圖4。

圖4 赤蘚糖醇與各種糖及糖醇不同配比對α-葡萄糖苷酶的抑制作用比較Fig.4 Comparison of erythritol combined with other sugars and sugar alcohols on the inhibition of α-glycosidase

由圖4看出，隨著濃度的增加，赤蘚糖醇分別與海藻糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、異麥芽酮糖醇以及山梨糖醇復配后對酶的抑制率逐漸增強，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，利用Calcusyn軟件計算赤蘚糖醇分別與海藻糖、異麥芽酮糖醇、D-木糖、L-阿拉伯糖以及山梨糖醇復配后的CI，并比較抑制率為25%、50%、75%和90%時赤蘚糖醇與其他糖及糖醇的聯(lián)合作用，結果見表1。

表1 赤蘚糖醇與其他糖及糖醇不同配比對α-葡萄糖苷酶的聯(lián)合作用

注：Dm代表中效劑量即IC50值。

由表1可知，當抑制率在25% ～75%范圍內(nèi)，赤蘚糖醇分別與海藻糖、異麥芽酮糖醇復配時，抑制作用明顯增強，且CI值<1，表現(xiàn)出協(xié)同作用，即兩者復配后抑制率高于兩者單獨作用時抑制率之和。赤蘚糖醇分別與D-木糖、L-阿拉伯糖、山梨糖醇復配時，與各糖及糖醇單獨使用時比較，復配后的抑制率明顯降低，CI值>1，表現(xiàn)出拮抗作用，即兩者復配后抑制率低于兩者單獨作用時抑制率之和。

3 討論

本試驗系統(tǒng)檢測了10種小分子糖及糖醇對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，通過高效液相法，以α-葡萄糖苷酶為靶標，檢測糖及糖醇在底物不存在時能否被α-葡萄糖苷酶分解，結果表明，部分異麥芽酮糖醇能被α-葡萄糖苷酶分解為葡萄糖和山梨糖醇。張堅[16]等研究發(fā)現(xiàn)，異麥芽酮糖醇在胃、小腸能被緩慢且不完全地水解為葡萄糖、山梨糖醇，本試驗結果與其研究發(fā)現(xiàn)一致。試驗中部分赤蘚糖醇被α-葡萄糖苷酶分解生成兩種物質(zhì)，而蘇永[17]等研究表明，目前尚未發(fā)現(xiàn)人體消化系統(tǒng)的正常微生物菌群和人體所分泌的α-1，4-糖苷酶對麥芽糖醇分子中的糖苷鍵有分解作用，即麥芽糖醇不能被人體內(nèi)的α-葡萄糖苷酶分解，本試驗中麥芽糖醇部分分解，其具體機制還需進一步探究。

各種糖及糖醇對α-葡萄糖苷酶的作用結果表明，隨著濃度增大，D-木糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇等對酶的抑制能力逐漸增強。L-阿拉伯糖對蔗糖-酶中間體有高親和力，形成三聚體后使酶活性中心空間結構發(fā)生改變，這可能是L-阿拉伯糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的原因[14]。在對α-葡萄糖苷酶抑制劑的結構研究過程中，GABRIELA[18]發(fā)現(xiàn)，該類物質(zhì)存在著某些共性，化合物中的羥基數(shù)目、構型以及糖的構象都會影響化合物對酶的抑制作用[4]。赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇多羥基，木糖多以寡糖和多糖形式存在，海藻糖有多種同分異構體，因此，D-木糖、海藻糖、赤蘚糖醇以及異麥芽酮糖醇等多樣性結構可能與其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用相關。復配結果表明，赤蘚糖醇與D-木糖、L-阿拉伯糖、山梨糖醇分別復配時，抑制率明顯降低，且復配物的抑制率低于單因素實驗中兩者抑制率之和，即表現(xiàn)出拮抗作用，出現(xiàn)該結果的原因可能是，降糖物質(zhì)在人體內(nèi)起作用是一個多成分、多靶點的過程[19]，試驗選用的α-葡萄糖苷酶抑制模型，靶點單一，當赤蘚糖醇分別與D-木糖、L-阿拉伯糖、山梨糖醇復配時，導致兩者在抑制α-葡萄糖苷酶活性過程中存在競爭性抑制，從而使抑制率降低。本試驗對糖及糖醇體外抑制α-葡萄糖苷酶活性作用進行了初步探討，由于機制復雜，有待進一步選用體內(nèi)多靶點模型進行深入研究。

綜上，D-木糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇、山梨糖醇均能抑制α-葡萄糖苷酶的活性，且赤蘚糖醇與海藻糖或異麥芽酮糖醇復配后有助于增強對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。通過研究糖與糖醇及其復配物的特殊功能，從而為降糖營養(yǎng)食品的開發(fā)提供參考，降低食品中糖對特殊人群的影響[20-21]，對于研究糖尿病的預防和飲食治療具有重要意義。

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The inhibitory effects of functional sugars and sugar alcohols on α-glucosidase activityinvitro

LIU Guo-yu1，LIU Jia1，WAN Ning1，WANG Xi1，NI Qing-gui2，YU Qin2， SUN Zhong-wei2，DU Yu-lan2，YAN Jian-gang2，WANG Fei3，DUAN Sheng-lin1*

1(China National Research Institute of Food & Fermentation Industries,Beijing 100015,China) 2(Perfect (China) Co., Ltd,Guangzhou 528402,China) 3(Beijing Municipal Science & Technology Commission ,Beijing 100195,China)

In order to provide references for the development of hypoglycemic nutrition diet, the inhibitory effects ofD-xylose,L-arabinose,trehalose, raffinose, lupeose, erythritol, isomaltitol, sorbitol, xylitol, and maltitol on the α-glucosidase activity were investigated. By using the high performance liquid chromatography method, the decomposition of sugars and sugar alcohols by α-glucosidase was detected, and their inhibitory effects on α-glucosidase were tested in the presence of sucrose. Further, the compounds with better inhibitory effects were designed to observe their interaction by using Calcusyn software.L-arabinose,D-xylose, trehalose, erythritol, isomaltitol and sorbitol all could inhibit the activity of α-glucosidase, and the value of IC50ofD-xylose,L-arabinose, trehalose, erythritol, isomaltitol and sorbitol were 23.89 mg/mL, 15.03 mg/mL, 9.75 mg/mL, 3.19 mg/mL, 20.64 mg/mL, 106.19 mg/mL, respectively. The inhibition of α-glucosidase were significantly increased when erythritol was combined with trehalose or isomaltitol (Combination Index <1) and showed a synergistic effect. The compounds of erythritol and trehalose or isomaltitol may contribute to the enhancement of inhibition of α-glucosidase.

functional sugar; sugar alcohol; α-glucosidase; combination;the inhibitory effectsinvitro

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703007

碩士研究生(段盛林教授級高級工程師為通訊作者,E-mail:dslbeijing@163.com)。

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金(2014GB2A000268)

2016-08-09，改回日期：2016-10-13