“低甲醇濃度- 高溶解氧濃度”策略誘導畢赤酵母高效表達HSA-GCSFm及其轉錄組學機理分析

涂庭勇，賈祿強，孫佼文，陳珊珊，史仲平

(江南大學 生物工程學院,工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

“低甲醇濃度- 高溶解氧濃度”策略誘導畢赤酵母高效表達HSA-GCSFm及其轉錄組學機理分析

涂庭勇，賈祿強，孫佼文，陳珊珊，史仲平*

(江南大學 生物工程學院,工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

甲醇/山梨醇共混誘導畢赤酵母(Mut+,GS115)表達人血清白蛋白-人粒細胞集落刺激因子突變體融合蛋白(HSA-GCSFm)的過程中，甲醇消耗與O2消耗相互偶聯(lián)，難以將甲醇濃度和溶解氧濃度(DO)同時維持在高水平。該文研究探討了“低甲醇濃度-高DO”和“高甲醇濃度-低DO”誘導策略下HSA-GCSFm的表達性能。結果表明，“低甲醇濃度-高DO”誘導策略策略下的HSA-GCSFm濃度達到587.5 mg/L，而“高甲醇濃度-低DO”誘導策略下的HSA-GCSFm濃度僅達到106 mg/L。利用轉錄組學技術分析上述2種誘導策略引起HSA-GCSFm表達水平差異的分子機制，結果表明：“低甲醇濃度-高DO”條件下甲醇代謝途徑、TCA循環(huán)和過氧化物酶體相關的部分基因上調，而與蛋白水解作用相關的部分基因下調，表明該條件下甲醇和山梨醇的代謝活性更高，細胞抗高DO沖擊的能力更強，錯誤折疊的蛋白減少。

畢赤酵母；甲醇濃度；溶解氧濃度；轉錄組學分析

甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母(MethylotrophicPichiapastoris)表達系統(tǒng)是1980年代初開發(fā)和研制的一種新型蛋白表達系統(tǒng)。由于畢赤酵母表達系統(tǒng)具有細胞容易達到高密度、產物表達效率高、產物可分泌到胞外、外源基因遺傳穩(wěn)定等許多優(yōu)點，近年來已成為極受青睞、應用廣泛的外源蛋白表達系統(tǒng)[1]。一般而言，根據(jù)畢赤酵母利用甲醇的能力不同，可以將其分為甲醇利用快型(methanol utilization positive，Mut+)和甲醇利用慢型(methanol utilization slow，MutS)。Mut+型畢赤酵母的代表菌株為GS115；MutS型畢赤酵母的代表菌株為KM71。人粒細胞集落刺激因子是(human granulocyte colony stimulating factor，hG-CSF)特異的作用于粒系祖細胞，促進其向中性細胞增殖、分化及維持功能、存活所必需的糖蛋白造血生長因子[2]。BAHRAMI等成功地實現(xiàn)了hG-CSF在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達，且產量達到320 mg/L[3]。然而，hG-CSF由于分子量較小而易被腎小球過濾，導致其在人體內半衰期短，使用效果不佳。目前，人們已利用人血清白蛋白(human serum albumin, HSA) 融合技術成功地融合了大量的多肽/蛋白類藥物并顯著地延長了其半衰期[4]。為了延長hG-CSF在人體內的半衰期，本研究室的合作者將G-CSF突變體(GCSFm)與HSA進行基因融合并在畢赤酵母GS115中成功表達。融合蛋白HSA-GCSFm兼具HSA抗原性及G-CSF活性，且突變型融合蛋白活性高出野生型融合蛋白數(shù)倍，具有良好的應用前景[5]。

為了提高HSA-GCSFm在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達水平，需要對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化。畢赤酵母表達外源蛋白的過程主要分為甘油初始培養(yǎng)期、甘油流加培養(yǎng)期和甲醇誘導培養(yǎng)期，其中甲醇誘導期是表達蛋白最為關鍵的時期。本研究室的合作者在前期研究中已經證明，在甲醇誘導階段添加輔助碳源山梨醇能夠提高HSA-GCSFm在畢赤酵母GS115中的表達量[6]。在畢赤酵母表達外源蛋白的誘導階段，甲醇濃度和溶解氧濃度(dissolved oxygen, DO)是影響外源蛋白表達的2個重要因素。對于畢赤酵母GS115而言，其誘導過程中甲醇能夠被快速消耗，且O2消耗與甲醇利用相互偶聯(lián)。因此，難以同時將甲醇濃度和DO控制在較高的水平，只能滿足其中之一。因此，本研究將在合作者前期研究[7]的基礎之上，考察采用甲醇/山梨醇共混誘導策略時，“高甲醇濃度-低DO”和“低甲醇濃度-高DO”2種條件下HSA-GCSFm的表達性能，并利用轉錄組學分析的方法進一步解析導致上述2種條件下發(fā)酵性能差異的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

重組畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115(pPIC9K-HSA-GCSFm)，由江南大學藥學院分子藥理學實驗室提供。表達載體為pPIC9k蛋白信號肽為α交配因子信號肽，外源基因為HSA-GCSFm。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10，葡萄糖20，蛋白胨20。發(fā)酵罐初始培養(yǎng)基(g/L)：甘油20 mL/L，K2SO41，MgSO41，CaSO40.1，(NH4)2SO45，PTM110 mL/L，H3PO42%(v/v)，pH 6.0。甘油流加培養(yǎng)基(g/L)：甘油500 mL/L，(NH4)2SO40.5，MgSO40.03，PTM110 mL/L， KH2PO40.5，pH 6.0。誘導流加培養(yǎng)基(g/L)：甲醇500 mL/L，(NH4)2SO40.5，MgSO40.03，PTM110 mL/L， KH2PO40.5，pH 5.5。山梨醇流加培養(yǎng)基(g/L)：山梨醇 500。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

在裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中接入從YPD平板上挑取的單菌落，30 ℃、220 r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h，作為發(fā)酵的種子液。

1.2.2 5 L發(fā)酵罐分批補料培養(yǎng)畢赤酵母表達HSA-GCSFm

分批補料培養(yǎng)在5 L發(fā)酵罐(百侖生物科技公司)內進行，裝液量3 L，接種量10%，通風比為1.5 vvm。初始甘油耗盡后開始補加甘油流加培養(yǎng)基，利用前期研究中構建的改良型DO-stat策略控制甘油流加，當DO基線過低時改為通純氧，當菌體質量濃度達到100 g-DCW/L時停止流加甘油。經過1～2 h的饑餓培養(yǎng)，甘油以及其他可以充當碳源的中間代謝物全部耗盡后，添加甲醇誘導HSA-GCSFm的表達。因此本研究中，采用2種不同的甲醇/山梨醇共混流加誘導策略：(1)誘導策略Ⅰ(低甲醇濃度-高DO)：將DO設定為10%，按照下列公式修正甲醇流加速率：F=F*+Kc×(DO-DOset)。其中F表示甲醇流加速率(F≥ 0)；F*代表基準甲醇流加速率，本次實驗驗中F*=0.7 mL/min；控制參數(shù)Kc在實驗中設定為0.05。(2)誘導策略Ⅱ(高甲醇濃度-低DO)：利用甲醇電極在線檢測甲醇濃度，并采用ON-OFF控制的方式將甲醇濃度維持在5～10 g/L，同時按2∶1的質量比流加山梨醇。在整個誘導期內，均采用空氣供氧，通風比為1.5 vvm，攪拌速率保持不變，并將2個電子天平通過RS232通訊接口連接至工業(yè)控制計算機，通過自編的監(jiān)控程序在線記錄甲醇和山梨醇的流加速率。

1.3 檢測方法

1.3.1 乙醇和甲醇濃度測定

商用的膜滲透型甲醇電極(上海蘇泊公司，F(xiàn)C2002)可以對乙醇和甲醇這一類的揮發(fā)性小分子有機物產生響應，其響應電壓與有機物濃度存在二次曲線型的數(shù)量關系。利用不同濃度的甲醇和乙醇標準溶液，分別擬合出描述電極輸出電壓與乙醇/甲醇濃度之間數(shù)量關系的標準曲線。在細胞培階段和誘導階段，根據(jù)電極的輸出電壓，分別利用各自的標準曲線計算得到乙醇和甲醇的濃度。

1.3.2 菌濃測定

測量方法與參考文獻[8]相同。

1.3.3 HSA-GCSFm濃度測定

SDS-PAGE蛋白電泳。使用5%的濃縮膠和8%的分離膠定性檢測。利用尿微量蛋白檢測試劑盒測定樣品中HSA的含量，根據(jù)公式C(HSA-GCSFm)=1.30×C(HSA)來計算融合蛋白的濃度(g/L)，其中1.30代表HSA與HSA-GCSFm的相對分子質量之比。

1.3.4 總蛋白濃度測定

采用考馬斯亮藍法測定發(fā)酵液中的總蛋白濃度，操作步驟與參考文獻[9]相同。

1.3.5 乙醇和甲醇濃度的離線測定

乙醇和甲醇濃度使用氣相色譜儀測定，色譜條件與參考文獻[10]相同。

1.3.6 山梨醇的檢測方法

采用高效液相色譜法測定。檢測之前，發(fā)酵上清液樣過0.22 μm 膜處理。色譜條件如下:氨基柱(Agilent)；示差折光檢測器 (RID)；檢測器溫度 30 ℃；柱溫 30 ℃；流動相 70% 乙腈和 30% 超純水；流速 1 mL/min;進樣量 20 μL。

1.3.7 O2利用速率，CO2釋放速率的計算

利用尾氣分析儀(LKM2000A，韓國LOKAS公司)在線檢測發(fā)酵尾氣中的CO2和O2的分壓，按文獻[11]中的公式進行計算O2利用速率(oxygen uptake rate OUR),CO2釋放速率(carbon dioxide rate CER),并借助RS232通信接口將數(shù)據(jù)傳輸記錄于工業(yè)控制計算機中。

1.3.8 甲醇及山梨醇代謝關鍵酶比酶活測定

醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX),甲醛脫氫酶(formaldehyde dehydrogenase，F(xiàn)LD)，甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase，F(xiàn)DH),異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)以及α-酮戊二酸脫氫酶(α-ketogluarate dehydrogenase complex, α-KD)比酶活按文獻[12]報道方法測定。

1.3.9 不同誘導條件下產HSA-GCSFm的轉錄組學分析

誘導HSA-GCSFm表達36 h后，分別取10 mL誘導策略Ⅰ和誘導策略Ⅱ條件下的發(fā)酵液。委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司提取胞內RNA，并采用RNA-seq法進行轉錄組分析。分析兩種發(fā)酵策略下基因的差異表達情況，并對差異表達基因進行KEGG功能富集分析。

2 結果與討論

2.1 不同誘導策略下的發(fā)酵性能

前期研究表明，將DO控制在10%～15%時，Mut+型畢赤酵母細胞能夠高效表達豬圓環(huán)病毒Cap蛋白[13]。因此，在本研究中，將10%～15%的DO水平定為“高DO”。對于本研究中使用的Mut+型畢赤酵母菌株，在甲醇供應充足條件下醇氧化酶被大幅度激活，細胞耗氧劇烈，導致DO始終處于0%。想要將DO控制在10%～15%的高水平，必須要限制細胞對甲醇的消耗速率。通過調節(jié)甲醇流加速率將DO控制在10%～15 %(高DO)時，甲醇濃度必然處于極低的水平(1 g/L以下)，此時的甲醇濃度被認為是“低甲醇濃度”。DAMASCENO等人發(fā)現(xiàn)，將甲醇濃度控制在5 g/L時，可以獲得最高的目的蛋白產量(A33scFv)[14]；DING等人發(fā)現(xiàn)，將甲醇濃度控制在5 g/L以上時，甲醇供應充足，畢赤酵母細胞能夠高效表達豬α干擾素[15]。在本研究中，將高于5 g/L的甲醇濃度界定為“高甲醇濃度”。將甲醇濃度控制在5 g/L以上時，DO自然處于接近0%的水平，此時的DO水平被認定為“低DO”。

利用誘導策略Ⅰ實現(xiàn)上述的“高DO-低甲醇濃度”誘導條件，將DO設定在10%，甲醇濃度自然；利用誘導策略Ⅱ實現(xiàn)上述的“低DO-高甲醇濃度”誘導條件，將甲醇濃度設定在5 g/L，DO自然。實際的控制性能如圖1所示，在誘導策略Ⅰ下，DO在絕大多數(shù)時間內都被維持在10%～15%，而甲醇濃度則始終被維持在1 g/L以下。與此相反，在誘導策略Ⅱ中，DO始終維持在0%，而甲醇濃度則始終被維持在5～8 g/L。圖2a是2種誘導策略下發(fā)酵液樣品SDS-PAGE檢測結果，從中可以看出，誘導策略Ⅰ條件下的HSA-GCSFm表達水平明顯高于誘導條件Ⅱ下的相應值。直接測定各時間點發(fā)酵液樣品中的HSA-GCSFm濃度，也得到相同的結論。如圖2b所示，采用誘導策略Ⅰ時，誘導60 h后HSA-GCSFm的濃度達到587.5 mg/L；采用誘導策略Ⅱ時，誘導60 h后HSA-GCSFm的濃度僅達到106 mg/L。

圖1 不同誘導策略下的DO及甲醇濃度變化Fig.1 Variations of DO and methanol concentration in different induction strategies誘導策略Ⅰ：低甲醇濃度-高DO；誘導策略Ⅱ：高甲醇濃度-低DO

圖2 不同誘導策略下的HSA-GCSFm表達水平Fig.2 The expression level of HSA-GCSFm in different induction strategies誘導策略Ⅰ：低甲醇濃度-高DO；誘導策略Ⅱ：高甲醇濃度-低DO

2.2 不同誘導策下的呼吸特性

OUR和CER是發(fā)酵過程中重要的在線狀態(tài)參數(shù)，可以直接反應菌體的呼吸代謝狀況。圖3比較了誘導策略Ⅰ和誘導策略下的OUR和CER。從中可以看出，采用誘導策略Ⅰ的批次其OUR和CER在誘導期內分別維持在50 mmol/(L·h)和40 mmol/(L·h)；采用誘導策略Ⅱ的批次其OUR和CER在誘導期內分別維持在90 mmol/(L·h)和60 mmol/(L·h)。在誘導策略Ⅱ的調節(jié)下，甲醇濃度能夠被維持在5～8 g/L，從而保證甲醇的充足供應，甲醇代謝活性被大幅度提高，這就導致該條件下的OUR和CER均明顯高于采用誘導策略Ⅰ的批次。在采用誘導策略Ⅱ的批次中，HSA-GCSFm表達水平較低。由此可以看出，高代謝呼吸活性并不一定能夠促進HSA-GCSFm的高效表達。

圖3 不同誘導策略下細胞CER和OUR變化Fig.3 Variations of CER and OUR in different feeding strategies誘導策略Ⅰ：低甲醇濃度-高DO；誘導策略Ⅱ：高甲醇濃度-低DO

2.3 不同誘導策略下的碳代謝關鍵酶活性

如圖4所示，AOX是甲醇代謝途徑中最關鍵的酶，它催化甲醇代謝過程中的第一步反應，將甲醇氧化為甲醛。AOX的活性則直接決定細胞對甲醇的利用速率，從而影響發(fā)酵產蛋白的速率。不同的誘導策略在誘導期的細胞干重基本相同，AOX的比活性實際體現(xiàn)了不同誘導條件下細胞代謝甲醇的能力。由圖5a可知，誘導策略Ⅰ下的AOX比活性活性比采用誘導策略Ⅱ的批次提高了一倍多。這表明在高DO環(huán)境下畢赤酵母細胞具有更強的代謝甲醇的能力。但在誘導策略Ⅰ條件下，由于甲醇供應收到限制，實際的甲醇消耗速率仍然低于采用誘導策略Ⅱ的批次，如圖5b所示。

圖4 畢赤酵母胞內碳代謝路徑Fig.4 Carbon metabolism pathways in Pichia pastoris

：誘導策略Ⅰ(低甲醇濃度-高DO)；：誘導策略Ⅱ(高甲醇濃度-低DO)圖5 不同誘導策略下的AOX比酶活和甲醇消耗速率Fig.5 Specific activities of AOX and methanol consumption rate in different induction strategies

FLD和FDH是甲醇異化途徑(Pathway B)中的關鍵酶，分別催化甲醛氧化為甲酸和甲酸完全氧化為CO2的反應。由圖6a和圖6b可知，誘導策略Ⅰ條件下的FLD和FDH比酶活均明顯高于誘導策略Ⅱ。因此，在采用誘導策略Ⅰ時畢赤酵母細胞能夠快速分解甲醛和甲酸，減輕了甲醛和甲酸對細胞的毒害作用。如圖4所示，輔助碳源山梨醇的代謝是通過糖酵解途徑和TCA途徑(Pathway C)完成的，α-KD和IDH是TCA途徑中的關鍵酶。由圖6c和6d可知，誘導策略Ⅰ條件下的α-KD和IDH比酶活均明顯高于誘導策略Ⅱ。因此，誘導策略Ⅰ能夠提高畢赤酵母細胞代謝山梨醇的效率，為蛋白合成途徑提供更多的能量，促進HSA-GCSFm的高效表達。

：誘導策略Ⅰ(低甲醇濃度-高DO)；：誘導策略Ⅱ(高甲醇濃度-低DO)圖6 不同誘導策略關鍵酶的比酶活Fig.6 Specific activities of the key enzyme using different feeding strategies

2.4 不同誘導策略下基因的差異表達

2.4.1 差異表達基因的篩選

利用RNA-seq技術分析獲得誘導策略Ⅰ(高DO-低甲醇濃度)和誘導策略Ⅱ(低DO-高甲醇濃度)條件下、誘導中期(36 h)的細胞樣本各基因的轉錄水平數(shù)據(jù)。以Foldchange≥1.5和qvalue≤0.05為條件，篩選不同誘導條件下的差異表達基因。根據(jù)篩選結果，差異化表達的基因共有514個，其中上調表達的基因數(shù)為278個，下調表達的基因數(shù)為236個。

2.4.2 差異表達基因的 GO功能富集分析

Gene Ontology(GO)是一個國際標準化的基因功能分類體系，通過GO功能顯著性富集分析能確定差異表達基因行使的生物學功能[16]。因此，本研究對不同誘導策略下的差異表達基因進行GO功能富集分析，結果表明(表1)：差異表達基因主要集中于水解酶活性、氧化還原等分子功能和羧酸代謝過程、細胞呼吸等細胞過程。

2.4.3 差異表達基因的KEGG Pathway代謝途徑分析

在生物體內，不同基因相互協(xié)調行使其生物學功能，通過途徑顯著性富集能確定差異表達基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫，它有助于研究者把基因及表達信息作為一個整體網絡進行研究[17]。因此，對不同誘導條件下的差異表達基因進行KEGG信號通路分析，符合P≤0.05則被定義為顯著性差異富集的信號代謝通路，結果如表2所示：TCA循環(huán)、甲醇代謝、氨基酸合成、氮代謝等途徑相關的基因都有不同程度的上調或下調，表明不同誘導策略可以引起畢赤酵母細胞代謝途徑的變化。這些代謝通路改變對研究不同甲醇濃度及DO影響畢赤酵母表達HSA-GCSFm的分子機制具有重要意義。

表1 差異表達基因的GO功能富集分析

表2 差異表達基因的KEGG Pathway 功能集分析

2.5 不同誘導策略影響HSA-GCSFm表達的轉錄組學機理

2.5.1 與甲醇相關代謝基因轉錄水平變化

甲醇是蛋白表達過程的誘導劑和主要碳源，因此首先比較不同誘導策略下甲醇代謝相關基因的表達水平。如圖7所示，在誘導策略Ⅰ條件下，ALOX1基因轉錄水平明顯上調。ALOX1基因編碼醇氧化酶，其轉錄水平上調會引起醇氧化酶活性的提高(圖5a)。FDH是編碼甲酸脫氫酶的基因，在誘導策略Ⅰ條件下明顯上調， FDH酶具有更高的活性(圖6b)，使得酵母細胞更易分解甲醇代謝產生的有毒中間產物甲酸。MTHR2編碼四氫葉酸還原酶，四氫葉酸是一碳單位的攜帶者，MTHR2基因在誘導策略Ⅰ條件下的上調表明細胞的甲醇代謝能力得到大幅提升。ACS1和SERB分別編碼乙酰輔酶A合成酶B和磷酸絲氨酸磷酸酶，也與甲醇代謝密切相關。由此可見，誘導策略Ⅰ能夠提高諸多甲醇代謝相關酶的表達水平，進而顯著激活甲醇代謝通路。

：誘導策略Ⅰ(低甲醇濃度-高DO)；□：誘導策略Ⅱ(高甲醇濃度-低DO)圖7 與甲醇代謝相關基因轉錄水平變化Fig.7 Transcriptional analysis of genes relate to methanol metabolism

2.5.2 與TCA代謝路徑轉錄水平

輔助碳源山梨醇被攝入酵母細胞后，通過TCA循環(huán)完成其代謝過程。TCA循環(huán)中所產生的中間物代謝可以作為其他代謝途徑的前體，如氧化磷酸化，氨基酸合成，脂肪酸以及其它生物大分子的合成。山梨醇的添加，能夠明顯緩解甲醇的供能壓力，并為HSA-GCSFm的合成提供充足的碳源。轉錄組學分析發(fā)現(xiàn)，在誘導策略Ⅰ條件下，有部分TCA循環(huán)中的關鍵酶基因顯著上調(圖8)。檸檬酸合酶由CIS基因編碼，是TCA循環(huán)中最關鍵的限速酶，對TCA循環(huán)的整體活性有調節(jié)作用。CIS基因的上調可以提高TCA循環(huán)的整體代謝活性。IDH2基因編碼編碼異檸檬酸脫氫酶； KDL基因編碼催化α-酮戊二酸生成琥珀酰CoA的復合酶系；MDHC基因編碼蘋果酸脫氫酶。IDH2，KDH和MDHC在誘導策略Ⅰ條件下均有不同程度的上調。由此可知，采用誘導策略Ⅰ時，細胞代謝山梨醇的能力更強，能夠為蛋白合成提供更加充足的能量和碳源。

：誘導策略Ⅰ(低甲醇濃度-高DO)；□：誘導策略Ⅱ(高甲醇濃度-低DO)圖8 與TCA循環(huán)相關基因轉錄水平變化Fig.8 Transcriptional analysis of genes relate to tricarboxylic acid cycle

2.5.3 與蛋白酶體代謝途徑基因轉錄水平

蛋白酶體由2個19S調節(jié)蛋白和1個20S核心蛋白組成。Rpn11是19S的蛋白PA700中Lid的成員，Rpn11是調節(jié)蛋白的關鍵亞基，能夠直接影響調節(jié)蛋白的活性[18]。Rpn2、Rpn13、Rpt3分別參與編碼26S蛋白酶的調節(jié)亞基N2、N13、T3。PSB3和PSB5分別編碼20S核心蛋白的β3和β5亞基。上述基因編碼的蛋白主要參與ATP依賴的蛋白水解，其在誘導策略Ⅰ條件下均明顯下調(圖9)。這說明在采用誘導策略Ⅰ進行發(fā)酵時，細胞內的蛋白酶含量減少，錯誤折疊的蛋白數(shù)減少，蛋白合成效率提高。

：誘導策略Ⅰ(低甲醇濃度-高DO)；□：誘導策略Ⅱ(高甲醇濃度-低DO)圖9 與蛋白酶體代謝基因轉錄變化Fig.9 Transcriptional analysis of genes relate to proteasome

2.5.4 與過氧化物酶體代謝轉錄水平

過氧化物酶體在O2代謝起到十分重要的作用，它能夠調節(jié)O2濃度，降低O2對細胞造成的傷害[19]。一旦溶氧上升，細胞內過氧化物酶體氧化應激反應上調，用于緩解高濃度氧給細胞帶來的毒害作用。PXMP4編碼過氧化物酶體上的膜蛋白酶4，主要參與蛋白轉運和催化功能。SODM編碼超氧化物歧化酶(SOD)，SOD能夠催化體內的O2-發(fā)生歧化反應，從而將其清除。PMP20基因的編碼產物則屬于抗氧化蛋白超家族，主要起到還原過氧化物的作用。SPS19和LCF1的編碼產物則主要編碼參與不飽和脂肪酸的氧化。CACM編碼肉毒堿-O-乙酰基轉移酶，它也是參與清除過氧化物的酶類之一。如圖10所示，上述與O2代謝相關的基因在誘導策略Ⅰ下均有不同程度的上調。這是由于誘導策略Ⅰ下的DO水平明顯高于誘導策略Ⅱ，大量O2通過自由擴散進入胞內，引起O2-等有毒副產物的生產。而細胞本身則通過上調上述基因，合成相關酶，降解O2代謝中的有毒副產物，保證細胞生理活動的正常進行。

：誘導策略Ⅰ(低甲醇濃度-高DO)；□：誘導策略Ⅱ(高甲醇濃度-低DO)圖10 與過氧化物酶體相關基因轉錄變化Fig.10 Transcriptional analysis of genes relate to peroxisome

3 結論

本研究在甲醇/山梨醇共混誘導條件下，對比了“低甲醇濃度-高DO”和“高甲醇濃度-低DO”2種誘導策略。結果表明，“低甲醇濃度-高DO”條件更有利于HSA-GCSFm的高效表達。利用轉錄組學分析技術揭示產生上述現(xiàn)象的分子機制，結果發(fā)現(xiàn)：“低甲醇濃度-高DO”條件下甲醇代謝途徑、TCA循環(huán)和過氧化物酶體相關的部分基因發(fā)生不同程度的上調，而與蛋白水解相關的部分基因則發(fā)生了不同程度的下調。這說明“低甲醇濃度-高DO”條件下甲醇和山梨醇代謝的活性更高，細胞抗高DO沖擊的能力更強，錯誤折疊的蛋白減少，蛋白合成效率更高。

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Enhanced HSA-GCSFmproduction byPichiapastorisunder “l(fā)ow methanol concentration-high dissolved oxygen” induction strategy and its transcriptome analysis

TU Ting-yong, JIA Lu-qiang, SUN Jiao-wen, CHEN Shan-shan, SHI Zhong-ping*

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In the process of producing HSA-GCSFmwith methanol/sorbitol co-induction byPichiapastoris, the consumptions of methanol and O2couple with each other, making it difficult to maintain methanol concentration and dissolved oxygen (DO) at high level simultaneously. In this study, induction strategies of “high methanol concentration-low DO” and “l(fā)ow methanol concentration-high DO” were adopted, and the performances of HSA-GCSFmproduction were investigated. As a result, the titer of HSA-GCSFmunder “high methanol concentration-low DO” and “l(fā)ow methanol concentration-high DO” strategies were 587.5 mg/L and 106 mg/L, respectively. The molecular mechanism of the two induction strategies causing different HSA-GCSFmexpression level was revealed by transcriptome analysis. Under the “l(fā)ow methanol concentration-high DO” strategy, the partial genes correlated with methanol metabolic pathway, TCA cycle and peroxisome were up-regulated, while the partial genes involved in proteolysis were down-regulated. That indicated the higher metabolic activities of methanol and sorbitol, the enhanced resistance to the shock of high DO and reduced protein misfolding.

Pichiapastoris; methanol concentration; dissolved oxygen; transcriptome analysis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703001

碩士研究生(史仲平教授為通訊作者,E-mail:jnbioprocess@163.com)。

國家自然科學基金(21606106)；江蘇省自然科學基金(BK20150127)

2016-09-05，改回日期：2016-11-23