亞硝基胍復(fù)制胃癌癌前病變大鼠模型的研究概況

陳曉東，潘華峰*，蔡甜甜，趙自明，趙金媛，林鐘宇（.廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東 廣州 50006；.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 50006; .廣州中醫(yī)藥大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，廣東 廣州 50006）

亞硝基胍復(fù)制胃癌癌前病變大鼠模型的研究概況

陳曉東1，潘華峰1*，蔡甜甜1，趙自明2，趙金媛3，林鐘宇3
（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東 廣州 510006；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510006; 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，廣東 廣州 510006）

N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG）是一種化學(xué)誘變劑及致癌劑，人類在長期攝入MNNG后易致慢性萎縮性胃炎甚至胃癌，許多學(xué)者將MNNG作為誘發(fā)胃癌癌前病變 （precancerous lesions of gastric cancer，PLGC）動物模型造模制劑，以制備出符合實驗要求的PLGC動物模型。本文通過搜索近年來使用MNNG復(fù)制PLGC動物模型的相關(guān)研究，根據(jù)使用MNNG造模過程中所涉及到的造模方式分類，比較構(gòu)建PLGC大鼠模型的多種方法，探尋更為簡單易行的PLGC動物模型造模方式，為深入開展該病的相關(guān)研究提供更符合科研與臨床實際要求的模型支撐。

N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍；胃癌癌前病變；大鼠模型；造模方式

胃癌癌前病變 （precancerous lesions of gastric cancer，PLGC）是指慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)胃黏膜萎縮伴一類容易發(fā)生癌變的胃黏膜病理組織學(xué)變化，包括腸上皮化生(intestinal metaplasia,IM)和異型增生（dysplasia），其中伴中度以上的異型增生和不完全大腸型化生則稱之為真正的PLGC。鑒于PLGC是CAG向胃癌轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵時期，及時有效的治療是CAG治療、預(yù)防胃癌、降低胃癌高發(fā)病率和高病死率的有效措施，而PLGC模型則是研究胃癌發(fā)生機(jī)制和評價CAG治療藥物必不可少的工具。由于N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）作用機(jī)理特性[1-2]，MNNG在誘導(dǎo)PLGC大鼠模型具有獨特優(yōu)勢，因此MNNG是目前公認(rèn)的較為理想的造模制劑，但MNNG法普遍存在造模周期長、誘發(fā)率低等缺點，如何復(fù)制出與臨床最相似、方法簡單、選框周期較短、成功率較高的PLGC模型仍是研究的重點，本文擬根據(jù)不同給藥途徑分類，對不同MNNG法復(fù)制PLGC模型進(jìn)行綜述。

1 MNNG法復(fù)制PLGC大鼠模型

1.1 MNNG自由飲用或聯(lián)合其他制劑進(jìn)食造模

MNNG采用自由飲用的給藥途徑方式造模，其操作簡單，可避免如灌胃、手術(shù)等操作對大鼠自身的傷害，但不能保證每只大鼠的飲用量，易致造模周期長、成功率低的結(jié)果。王茵萍等[3]取雄性SD大鼠自由飲用60 μg/mL MNNG造模，持續(xù)31周，期間不作任何治療及其他輔助造模方法，結(jié)果表明胃黏膜不同程度的萎縮、腸化生等，其中大鼠腸化生達(dá)100%，異型增生達(dá)46%。唐友明等[4]取Wistar雄性大鼠均自由飲用170 mg/L的MNNG液，造模期間不再給予其他飲水，共8周。劉靜等[5]取SD 大鼠，采用MNNG飲水結(jié)合饑飽失常12周,均成功復(fù)制CAG胃癌前變大鼠模型。有研究表明[6]，低酸環(huán)境易加速M(fèi)NNG誘發(fā)胃癌前病變的作用，因此有學(xué)者在飼料中加用雷尼替丁等抑制胃酸分泌以產(chǎn)生低酸環(huán)境，張艷等[7]選用雄性Wistar大鼠，給予濃度為55 μg/mL 的MNNG溶液，同時給于0.04%雷尼替丁粉末飼料，造模20周，大鼠胃黏膜萎縮，腸化生、異型增生，PLGC誘發(fā)率為83%。實驗中后期，因大鼠健康狀態(tài)下降，從而對造模制劑飲用量減少，若結(jié)合饑飽失常飲食造模，則可因禁食而導(dǎo)致飲水量降低，導(dǎo)致每天飲用量不一致，所以該給藥途徑受大鼠的身體狀況及習(xí)性影響較大，從而對實驗造成不利影響。

1.2 MNNG單藥灌胃造模

灌胃給藥方式可以保證每只大鼠對造模制劑的攝入量，減少因大鼠生活習(xí)性而引起的實驗困難，但不能排除灌胃的操作方式對胃黏膜刺激或藥物理化性質(zhì)的影響。有外國文獻(xiàn)報道[8]，通過比較灌胃與其他給藥方式（食品添加）在造胃癌模型的實驗差異，發(fā)現(xiàn)在復(fù)制成功的模型中，灌胃給藥方式有12%的胃癌發(fā)生在前胃，而食品添加方式則只有2%發(fā)生在前胃，推測灌胃給藥方式對造模劑的理化性質(zhì)產(chǎn)生影響。目前MNNG單藥灌胃方式給藥相關(guān)報道較少，復(fù)制PLGC模型效果仍待探討，但因為單藥仍是一種相對廉價的造模方式，經(jīng)過對造模制劑的濃度、給藥頻次等進(jìn)行調(diào)整，則能較好的復(fù)制出滿意的動物模型。如陳飛松等[9]對Wistar大鼠用400 μg/mL 的MNNG短期連續(xù)灌胃10 d后，正常飼養(yǎng)26周，有45%大鼠出現(xiàn)不同程度異型增生。

1.3 MNNG灌胃，聯(lián)合其他制劑進(jìn)食造模

魏玥等[10]采用雄性Wistar大鼠，給予120 μg/mL 的MNNG溶液灌胃，0.1%氨水溶液自由飲用及進(jìn)食含0.03%雷尼替丁飼料，造模28周，結(jié)果顯示模型組中大鼠60%出現(xiàn)中重度異型增生。賀梅娟等[11]選用雄性Wistar大鼠，每日給予120 μg/mL的MNNG溶液灌胃，同時每日自由飲用濃度為0.05%氨水溶液，自由進(jìn)食0.03%雷尼替丁飼料，持續(xù)28周，造模成功率為66%。氨水的作用主要是模擬動物感染幽門螺桿菌(Hp)，雷尼替丁可在胃部營造低酸環(huán)境，配合MNNG使大鼠處于持續(xù)胃炎狀態(tài)。目前，許多學(xué)者接受使用MNNG、氨水及雷尼替丁三聯(lián)制劑造模法，可以有效促進(jìn)胃癌前病變的發(fā)生。該造模方式相對于MNNG單藥灌胃，優(yōu)勢在于合用其他制劑造模，通過不同的制劑組合能加強(qiáng)對胃黏膜的刺激，從而提高PLGC動物模型的復(fù)制成功率。

1.4 MNNG自由飲用，聯(lián)合其他制劑灌胃造模

崔儒濤等[12]給大鼠自由飲用100 μg/mL MNNG 液24周，同時用無水乙醇于第1、3、5、7周灌胃（2 mL/只）,胃癌前病變動物模型誘發(fā)率高達(dá)73.3%。謝晶日等[13]給予100 μg/mL MNNG自由飲用，熱鹽水和雷尼替丁混合灌胃，第14周造模成功，誘變率為50%。周杰等[14]建立實驗大鼠時采用自由飲用150 μg/mL MNNG溶液,每周2次灌胃給予40%的酒精,連續(xù)12周，并結(jié)合饑飽失常復(fù)制CAG模型，造模病理結(jié)果提示符合胃癌前病變診斷并具有統(tǒng)計學(xué)意義。李海文等[15]給予200 μg/mL MNNG溶液自由飲用、小承氣湯灌胃及聯(lián)合饑飽失常法復(fù)制PLGC大鼠模型，連續(xù)造模18周，亦達(dá)到預(yù)期造模效果。

此類型造模方式，一方面，合用理化損傷制劑進(jìn)行動物模型制備，一般情況下能提高造模的成功率；另一方面，相對于單獨使用MNNG造模，能縮短造模時間，提高誘發(fā)率。但灌胃方式本身會對實驗參與人員的操作手法有一定的要求，且越到實驗后期，大鼠健康狀態(tài)下降，甚至反復(fù)灌胃導(dǎo)致大鼠胃食管損傷或引起胃腸道脹氣等疾病時，大鼠的死亡率可能會提高，給實驗帶來不良的影響。

1.5 MNNG與其他制劑聯(lián)合灌胃造模

石宇等[16]利用100 μg/mL MNNG分別與60%乙醇、0.2%去氧膽酸鈉組合灌胃給藥，造模周期45周，成功復(fù)制出胃癌前病變模型，結(jié)果顯示：MNNG單藥誘發(fā)率33.3%，MNNG+乙醇誘發(fā)率88.8%，MNNG+支氧膽酸鈉誘發(fā)率60%，MNNG+乙醇+支氧膽酸鈉誘發(fā)率25%，總體死亡率14%。該實驗雖可成功復(fù)制胃癌前病變，但造模時間長，實驗方法仍需改進(jìn)。岳雙冰等[17]采用MNNG、乙醇、雷尼替丁聯(lián)合灌注的綜合造模法,造模時長20周,觀察兩組大鼠一般狀況、舌質(zhì)、胃重、胃黏膜病理等變化，結(jié)果顯示實驗組一般狀況較差,舌質(zhì)表現(xiàn)明顯的血瘀征象,病理觀察胃黏膜形態(tài)有典型的CAG癌前病理改變，該胃癌前病變血瘀證動物模型與胃癌前病變患者臨床表現(xiàn)有較好的一致性,為中醫(yī)藥研究治療胃癌前病變,提供了較為合適的動物模型支撐。

灌胃給藥途徑最主要的缺點就是灌胃次數(shù)多，孔祥茹等[1]發(fā)現(xiàn)相對于自由飲用方式給藥，MNNG灌胃方式可使胃癌前病變的誘變率降低、動物死亡率上升，且灌胃方式誘發(fā)前胃病變多見。因此，灌胃方式雖然可保證攝入量并能加強(qiáng)對胃黏膜的刺激，但實際造模效果仍有待探討。

1.6 MNNG聯(lián)合手術(shù)方式造模

此造模方式常見有2種，第一種是利用手術(shù)方法使十二指腸液反流入胃，因其含有膽汁腸液和胰液等堿性物質(zhì)，可引起長期直接的胃黏膜損傷，進(jìn)而引起胃黏膜炎性反應(yīng)并造成固有腺體萎縮，從而復(fù)制CAG[18]。如張旭晨等[19]在無菌條件下在幽門環(huán)處置入一金屬彈簧并予縫線固定,然后逐層縫合胃及腹壁切口。術(shù)后一周給予自由飲用100 μg/mL MNNG 4個月。結(jié)果顯示16周時已出現(xiàn)典型的癌前期病變。第二種方式是手術(shù)方法直接在胃部注射某種藥物，直接并持續(xù)損傷胃黏膜，以達(dá)到造模目的。如周本杰等[20]打開大鼠腹腔暴露胃后，將醋酸注入到腺胃部前壁竇體交界處漿膜下，再用自由飲用法和灌胃法分別進(jìn)行MNNG造模14周和8周，能成功復(fù)制出胃癌前病變模型。此方法優(yōu)點在于造模時間短，但也存在不少缺點，如手術(shù)技術(shù)難度較高，需要較好的技術(shù)人員及相關(guān)設(shè)備，同時需密切觀察大鼠的術(shù)口情況，防止傷口感染及縫線松動。第一種方法相對適合于研究膽汁反流在胃病方面的研究，而第二種方法相對適合于潰瘍或胃癌方面的研究。目前在胃癌前病變的相關(guān)文獻(xiàn)中，手術(shù)方式造模的報道較少，其可行性仍需等待相關(guān)科研人員的進(jìn)一步探究。

2 不同造模給藥方式效果評價

選擇何種造模方式，需根據(jù)具體實驗條件與時空限制進(jìn)行選擇。若允許造模時間長，可選擇MNNG自由飲用或聯(lián)合其他制劑進(jìn)食方式。若需要造模時間短，實驗室人力條件充足，可嘗試選擇MNNG聯(lián)合手術(shù)方式。若要求穩(wěn)定的造模效果，可選擇MNNG灌胃，聯(lián)合其他制劑進(jìn)食的方式。不同造模給藥方式的優(yōu)缺點具體見表1。

表1 不同造模給藥方式效果對比表

3 其他相關(guān)因素

3.1 實驗動物選擇

建立胃癌前病變動物模型時對動物一般要求其誘發(fā)率高，飼養(yǎng)方便。經(jīng)查詢相關(guān)文獻(xiàn)資料，可見目前普遍使用Wistar或SD大鼠作為實驗動物。主要原因是大鼠成本低，易于飼養(yǎng)。而其他動物如犬或裸鼠，因成本高或感染致死率高等缺點而不被普遍使用。但不同種系、性別乃至不同鼠齡的大鼠均會直接影響胃癌前病變誘發(fā)率及造模時間。有研究表明[21]，鼠齡12周以內(nèi)，體質(zhì)量120 g以下的大鼠，胃癌前病變的誘發(fā)率明顯高于年齡更大、體質(zhì)量更高的大鼠。由于激素水平差異，雄性大鼠對致癌物質(zhì)的敏感性較強(qiáng)[5]。SD大鼠相對于Wistar大鼠較為適合于藥理、藥效方面的研究，但SD大鼠成本較高。因此，目前大多數(shù)科研者選擇用Wistar系雄性幼齡大鼠。

3.2 影響因素

MNNG濃度、給藥途徑、頻次、周期、合用藥物等的不同所復(fù)制PLGC大鼠模型存在較大差異。自由飲用還是灌胃給藥法復(fù)制PLGC大鼠模型，MN-NG合理濃度均為50～100 μg/mL[22]，濃度過低則模型復(fù)制周期長,成功率低;濃度過高則易出現(xiàn)如結(jié)腸癌等其他腫瘤；灌胃方式相對于自由飲用方式，可使誘變率降低、動物死亡率上升，且灌胃方式誘發(fā)前胃病變多見[1]。MNNG合用不同藥物時產(chǎn)生不同的造模效果，合用藥物可有雷尼替丁、氨水、乙醇等，且合用藥物的劑量、頻次等亦有差別，具體選擇應(yīng)根據(jù)不同的實驗需求及所處的實驗環(huán)境綜合考慮。

3.3 PLGC大鼠模型評價標(biāo)準(zhǔn)

病理組織診斷為PLGC評定的金標(biāo)準(zhǔn)，在胃黏膜萎縮基礎(chǔ)上伴中、重度的異型增生和不完全大腸型化生則為嚴(yán)格意義上PLGC?？紤]到造模實驗的難度及不確定性，部分學(xué)者將在慢性萎縮性胃炎基礎(chǔ)上伴發(fā)的不完全型腸上皮化生和(或)中、重度異型增生視為PLGC，以放寬納入標(biāo)準(zhǔn)。PLGC大鼠模型的復(fù)制，目的在于在大鼠體內(nèi)呈現(xiàn)人胃癌前病變的病理狀態(tài)，因此筆者認(rèn)為大鼠模型的評價標(biāo)準(zhǔn)必須按照嚴(yán)格意義上PLGC評價標(biāo)準(zhǔn)，才能達(dá)到嚴(yán)謹(jǐn)合理的研究要求。

4 結(jié)語

探尋一種簡便易行且成功率高的復(fù)制PLGC大鼠模型方式具有重要意義，從初始的單一因素造模方式到現(xiàn)在普遍使用的多因素復(fù)合造模方式的轉(zhuǎn)化，體現(xiàn)了造模水平的提高以及對合適的動物模型的迫切需求。在造模過程的各個環(huán)節(jié)上，通過不斷的改進(jìn)，不斷的完善，以得到更符合需求的動物模型。MNNG自由飲用、聯(lián)合其他造模制劑灌胃或結(jié)合手術(shù)方式等方法或周期過長或技術(shù)難度高，未能明顯縮短造模時間以及提高胃癌前病變的成功率，但其造模相關(guān)創(chuàng)新點的提出以及所引發(fā)的思考，對科研者造模技術(shù)的改進(jìn)產(chǎn)生一定的啟發(fā)，許多學(xué)者仍在積極探求更為合適的造模方式。目前穩(wěn)定制作出PLGC大鼠模型的造模方式尚無公認(rèn)定論，未來PLGC大鼠造模方式的創(chuàng)新，可在MNNG濃度的選擇、大鼠品種上進(jìn)行探索。選擇的多樣性也提示我們實驗的靈活性，我們在實驗的設(shè)計過程中，應(yīng)根據(jù)我們自身實驗的要求及實驗條件，選擇合適的造模方式，才能達(dá)到最為理想的實驗?zāi)康摹?/p>

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（本文編輯 匡靜之）

Research Status of MNNG in Building PLGC Model Rats

CHEN Xiaodong1,PAN Huafeng1*,CAI Tiantian1,ZHAO Ziming2,ZHAO Jinyuan3,LIN Zhongyu3
(1.Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou,Guangdong 510006,China；2.Research Institute of Chinese Medicine Engineering and Technology in Guangdong Province,Guangzhou,Guangdong 510006,China；3.School of Economics and Management,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou,Guangdong 510006,China)

N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)is a kind of chemical mutagen and carcinogenic agents.Longterm intake of MNNG easily cause the occurrence of chronic atrophic gastritis and gastric cancer of humans.Many scholars regard MNNG as the preparation of making precancerous lesions of gastric cancer(PLGC)animal model which fit in with experimental requiments.In this paper,we searched about the studies that using MNNG to make PLGC animal model in recent years.The methods of building PLGC animal models were compared to seeking the more simple and high success rate way, which provide more meet the requirements of the scientific research and clinical practice model for in-depth development of the related research of this disease.

N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine;precancerous lesions of gastric cancer；rat model；building model method

R573.9

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2017.04.031

2016-11-21

國家自然科學(xué)基金（81473620、81673946）；廣州市哲學(xué)社會科學(xué)發(fā)展"十三五"規(guī)劃2016年度課題（2016GZJ07）；四川醫(yī)事衛(wèi)生法治研究中心2016年度項目（YF16-Q17）；廣州市公共衛(wèi)生服務(wù)體系建設(shè)研究基地2016年度課題；廣州市社科聯(lián)羊城青年課題（16QNXR16）；四川醫(yī)事衛(wèi)生法治研究中心2016年度項目（YF15-Y09）。

陳曉東，男，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治胃癌前病變。

*潘華峰，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：13711588328@126.com。

本文引用：陳曉東，潘華峰，蔡甜甜，趙自明，趙金媛，林鐘宇.亞硝基胍復(fù)制胃癌癌前病變大鼠模型的研究概況[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37 （4）：457-460.