微波提取山楂中黃酮類化合物的工藝優(yōu)化

施 昶，黃海飛，李夢(mèng)園，沈詩(shī)偲，韓 偉,2

(1.華東理工大學(xué)藥學(xué)院中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237； 2.上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237)

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微波提取山楂中黃酮類化合物的工藝優(yōu)化

施 昶1，黃海飛1，李夢(mèng)園1，沈詩(shī)偲1，韓 偉1,2

(1.華東理工大學(xué)藥學(xué)院中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237； 2.上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237)

以總黃酮得率為指標(biāo)，采用微波法輔助提取山楂葉中的總黃酮，選取浸提時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波輻射時(shí)間、液固比等參數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，選擇影響較大的因素，利用Design-Expert 8.0.5b進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到優(yōu)化的提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)56%，液固比51 mL/g，微波輻射時(shí)間3.7 min，在此條件下，山楂葉中總黃酮得率為8.923%。

微波提??；山楂葉；總黃酮；響應(yīng)面分析

山楂葉為薔薇科植物山里紅(CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br)或山楂(GrataeguspinnatifidaBge.)的干燥葉[1]，主要用于理氣通脈、活血化瘀。它的有效活性化學(xué)成分主要有三萜和黃酮兩大類，目前對(duì)黃酮類成分研究較多[2]。黃酮類成分在降血壓、調(diào)血脂、增大心臟血流量和清除體內(nèi)自由基等方面療效顯著[3]。山楂葉與山楂果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)及藥用成分非常相近，但其黃酮類化合物的含量高達(dá)2%，為果實(shí)含量的20～120倍[4]。

山楂總黃酮常見的提取方法有水提取法[5]、超聲波法[6]和醇浸提法[7]等，這些方法在不同程度上存在提取不完全、操作繁瑣、耗時(shí)過長(zhǎng)、設(shè)備復(fù)雜等缺陷。微波法是一項(xiàng)新型提取技術(shù)，具有選擇性強(qiáng)、加熱均勻、快速高效、綠色節(jié)能等特點(diǎn)。

本文以總黃酮得率為指標(biāo)，采用微波法輔助提取山楂葉中的黃酮類化合物，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行方差分析，并通過Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(BBD)——響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件，以期為山楂葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂葉，產(chǎn)自廣西桂林；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，含量>98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH(分析純)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；去離子水，上海華震科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GYFS06型多功能粉碎機(jī)，江西贛云食品機(jī)械有限公司；UV1900PC型紫外-可見分光光度計(jì)，上海亞研電子科技有限公司；AL104型分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；ER-692型微波爐(輸出功率為650 W，頻率為2 450 MHz)，中國(guó)電子器件工業(yè)總公司；SHZ-DIII型循環(huán)水式多用真空泵，上海予華儀器設(shè)備有限公司；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，上虞市滬南電爐烘箱廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總黃酮的測(cè)定

1)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。精確稱取已干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品9.8 mg，用適量無水乙醇將其溶解，待其充分溶解后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容、搖勻，得到質(zhì)量濃度為0.196 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液。

2)最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定。量取2 mL已配好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于25 mL容量瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液1 mL，靜置6 min；再加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al(NO3)3溶液，靜置6 min；然后加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液，用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液定容，搖勻，靜置15 min。在400～750 nm范圍內(nèi)，用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為510 nm。

3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、4、6、8和10 mL于6個(gè)25 mL容量瓶中，按上述NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法的步驟完成操作后，于510 nm波長(zhǎng)處分別進(jìn)行比色測(cè)定，參比為空白試劑。以吸光度A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度ρ(mg/mL)為橫坐標(biāo)，用最小二乘法作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A=10.14ρ+0.020，R2=0.997。

1.3.2 總黃酮的單因素提取實(shí)驗(yàn)

將山楂葉洗凈后自然曬干，然后將其用粉碎機(jī)粉碎，篩分得到粒度為0.25 mm的山楂葉粗粉，裝袋于陰涼處備用。精確稱取1 g山楂葉粗粉于錐形瓶中，加入一定液固比(20∶ 1、30∶ 1、40∶ 1、50∶ 1和60∶ 1 mL/g)的乙醇溶液浸泡一段時(shí)間(5、10、15、20和25 min)。微波裝置由于功率固定，這里采用對(duì)時(shí)間的調(diào)節(jié)改變輻射強(qiáng)度，提取一定時(shí)間(2、3、4、5和6 min)后，自然冷卻，抽濾并洗滌，定容至100 mL容量瓶。搖勻后精密量取已定容的稀釋液1 mL于25 mL容量瓶中，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。

1.3.3 總黃酮得率的測(cè)定

由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，按式(1)計(jì)算總黃酮的得率。

(1)

式中：ρ為總黃酮的質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為提取液體積(mL)；n為總稀釋倍數(shù)；m為山楂葉粗粉的質(zhì)量(g)。

1.3.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇對(duì)黃酮得率影響較大的因素，采用3因素3水平的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、微波時(shí)間(B)、液固比(C)為變量，每個(gè)變量分別以-1、0、1表示，進(jìn)行17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(5個(gè)中心點(diǎn))的二次回歸組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定提取的最佳工藝條件，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與討論

2.1 微波法輔助提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 浸提時(shí)間的影響

采用微波法輔助提取樣品前一般需要將其浸潤(rùn)，浸潤(rùn)是否充分由浸提時(shí)間決定。在固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、液固比50 mL/g、微波輻射時(shí)間3 min時(shí)，考察浸提時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著浸提時(shí)間的增大，黃酮得率持續(xù)上升。但當(dāng)時(shí)間達(dá)到15 min后，得率升高速度減緩，說明15 min以后，浸提時(shí)間對(duì)得率的影響很小。綜合考慮時(shí)間成本與黃酮得率，選取浸提時(shí)間為15 min。

圖1 浸提時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of dipping time on the yield of total flavonoids from hawthorn leaves

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

一般情況下，增加乙醇的用量可以促進(jìn)總黃酮的溶解，乙醇體積分?jǐn)?shù)越大，黃酮溶解越充分。在液固比50 mL/g、浸提時(shí)間15 min、微波輻射時(shí)間3 min的條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出：在20%～60%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，黃酮得率隨之升高；乙醇體積分?jǐn)?shù)到達(dá)60%以后，得率反而下降。這可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)過大，會(huì)造成混合溶劑極性減小，不利于黃酮的溶解[8]，因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇為40%～60%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the yield of total flavonoids from hawthorn leaves

2.1.3 液固比的影響

液固比是影響得率的重要因素之一，通常情況下，藥材用量固定，改變?nèi)軇┑挠昧?。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、浸提時(shí)間15 min、微波輻射時(shí)間3 min的條件下，考察不同液固比對(duì)提取的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知：當(dāng)其他條件不變時(shí)，液固比為20～50 mL/g時(shí)，黃酮得率隨液固比的增加而增大，液固比為50 mL/g時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)液固比繼續(xù)增加時(shí)得率反而下降。這主要是因?yàn)槿軇┯昧窟^大會(huì)影響微波輻射的效果，極性較大的溶劑能有效吸收微波能，導(dǎo)致細(xì)胞液對(duì)微波能的吸收減少，總黃酮不能從細(xì)胞中充分溶出[5]，因此，液固比選取為50 mL/g。

圖3 液固比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids from hawthorn leaves

2.1.4 微波輻射時(shí)間的影響

微波輻射時(shí)間直接影響提取溫度，是微波法輔助提取過程的關(guān)鍵。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、液固比50 mL/g、浸提時(shí)間15 min的條件下，考察微波輻射時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：當(dāng)其他條件不變時(shí)，隨著微波時(shí)間的增加，黃酮得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)槲⒉ㄝ椛鋾r(shí)間太短，有效成分無法充分溶出；而微波時(shí)間過長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致溶液因溫度過高而暴沸，甚至?xí)茐挠行С煞?。綜上，微波輻射時(shí)間選擇為3 min。

圖4 微波輻射時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of radiation time on the yield of total flavonoids from hawthorn leaves

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)的方差分析

由單因素實(shí)驗(yàn)可得，每個(gè)因素對(duì)黃酮得率的影響程度不同。為了減少BBD響應(yīng)面優(yōu)化法的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，提高優(yōu)化效率，對(duì)各因素進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表2所示。由表2可知：方差數(shù)值越低，則相應(yīng)黃酮得率的波動(dòng)幅度越小，表明該因素對(duì)黃酮得率的影響越少。

表2 單因素方差分析

從表2可以發(fā)現(xiàn)，以黃酮得率為指標(biāo)，各因素的方差由大到小依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波時(shí)間、液固比、浸提時(shí)間。浸提時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響最小。因此，可以確定影響得率的主要因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波時(shí)間以及液固比。

2.3 BBD響應(yīng)面法優(yōu)化工藝

2.3.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇影響山楂葉中總黃酮得率的主要因素——乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比以及微波輻射時(shí)間，以黃酮得率(Y)為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.5b軟件對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以優(yōu)化提取工藝參數(shù)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，回歸模型的方差分析見表4，回歸模型的可信度分析見表5。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 回歸模型的方差分析

注：*表示影響顯著(P<0.05)； **表示影響極顯著(P<0.01)。

表5 回歸模型的可信度分析

對(duì)表4結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合、方差分析及顯著性檢驗(yàn)，得到各條件編碼值的二元回歸方程為

Y=8.85+0.096A+0.076B+0.078C+0.052AB-0.045AC-8.500×10-3BC-0.49A2-0.075B2-0.12C2

由表5結(jié)果可知：回歸模型極顯著(P<0.01)，而誤差項(xiàng)不顯著，說明回歸方程與實(shí)際情況擬合程度較好，可用此模型對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。R2=0.986 9，這說明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性，說明模型能解釋0.986 9的響應(yīng)值變化。顯著性檢驗(yàn)表明，一次項(xiàng)、交互項(xiàng)、二次項(xiàng)均表現(xiàn)出了顯著水平，且各因素對(duì)總黃酮得率的影響程度由強(qiáng)到弱依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、微波時(shí)間。

2.3.2 各因素交互作用對(duì)總黃酮得率響應(yīng)面分析

一般情況下，響應(yīng)面分析中會(huì)把其他因素固定在零水平，選取2個(gè)交互的因素進(jìn)行分析。當(dāng)?shù)雀呔€趨于圓形時(shí)，兩因素的交互作用較弱，當(dāng)?shù)雀呔€呈現(xiàn)橢圓形時(shí)，兩因素的交互作用較強(qiáng)[9]。而響應(yīng)面可以對(duì)比各方向的曲率大小來比較各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，其直觀性主要體現(xiàn)在曲率的變化。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)及微波輻射時(shí)間對(duì)黃酮得率的響應(yīng)面分析Fig.5 Response surface plot analysis of the radiation time and ethanol volume fraction to the yield

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)及液固比對(duì)黃酮得率的響應(yīng)面分析Fig.6 Response surface plot analysis of the liquid-solid ratio and ethanol volume fraction to the yield

圖7 微波輻射時(shí)間及液固比對(duì)黃酮得率的響應(yīng)面分析Fig.7 Response surface plot analysis of the liquid-solid ratio and radiation time to the yield

根據(jù)回歸方程可得各因素對(duì)黃酮得率影響的等高線及響應(yīng)面，如圖5～7所示。由圖5～7可以發(fā)現(xiàn)：

1)圖5與圖6的等高線呈橢圓形，而圖7的等高線則更接近圓形的弧度。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)與微波輻射時(shí)間(B)之間以及乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)與液固比(C)之間的交互作用均比微波輻射時(shí)間(B)與液固比(C)之間的交互作用更顯著，這與回歸模型的方差分析結(jié)果相一致。

2)固定液固比為50(mL/g)，比較乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波輻射時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響，由圖5可以看出，曲率在乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波輻射時(shí)間的方向上都為先增大后減??；然而，在乙醇體積分?jǐn)?shù)方向上的曲率變化更為明顯，曲線更陡，而微波輻射時(shí)間方向的曲線則相對(duì)平緩，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響更加顯著，這與圖5和圖6的響應(yīng)面、顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果以及王婷婷等[10]所闡述的現(xiàn)象相一致。

2.3.3 提取工藝的優(yōu)化及驗(yàn)證

通過Design-Expert 8.0.5b軟件響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)56.16%，液固比為51.83 mL/g，微波輻射時(shí)間3.70 min。在此條件下，預(yù)測(cè)可得到總黃酮得率為8.968%。為便于實(shí)際實(shí)驗(yàn)，將參數(shù)修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)56%，液固比為51 mL/g，微波輻射時(shí)間3.7 min。按照修正后的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次平行實(shí)驗(yàn)的總黃酮得率的平均值為8.923%，與理論預(yù)測(cè)值較為接近，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的數(shù)學(xué)模型可行。

3 與其他提取方法的比較

曹樂民等[11]以水提取法研究山楂葉總黃酮的提取工藝，并通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定采用最優(yōu)浸提條件(提取時(shí)間3 h)所得到的黃酮提取得率為1.038%。

趙永福[12]采用超聲輔助法提取山楂葉總黃酮，結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到優(yōu)化的工藝條件，超聲時(shí)間30 min，提取次數(shù)2次，提取得率為2.43%。

周海旭等[13]對(duì)乙醇浸提法提取山楂總黃酮的工藝條件進(jìn)行了研究，利用Design-Expert 7軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，得到最佳提取工藝條件下的提取得率為0.744%，提取時(shí)間60 min。

通過上述3種方法的比較可以看出，本文采用的微波法輔助提取山楂葉總黃酮的提取效率最高。

4 結(jié)論

1)采用微波法輔助提取山楂葉中的總黃酮，首先進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，在4個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響較大的3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，得到最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)56%，液固比為51 mL/g，微波輻射時(shí)間3.7 min。在該條件下，山楂葉中總黃酮的平均得率為8.923%。

2)山楂葉中總黃酮的微波提取工藝操作簡(jiǎn)便、條件溫和、高效節(jié)能、安全無污染，與常見的水提取法、超聲法輔助提取法以及醇浸提法相比，得率最高，提取時(shí)間最短。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Optimization of microwave extraction of flavonoids from hawthorn leaves

SHI Chang1,HUANG Haifei1,LI Mengyuan1,SHEN Shisi1,HAN Wei1,2

(1.Engineering Center for Traditional Chinese Medicine Modernization,School of Pharmacy,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China; 2.Shanghai Key Laboratory of New Drug Design,Shanghai 200237,China)

The microwave extraction was applied to extract flavonoids from hawthorn leaves, selecting flavonoid yield as indicator.Extraction time,ethanal volume fraction,radiation time,and liquid-solid ratio for single factor experiment were selected.Influencing factors of the extraction yield of total flavonoids were chosen using the Design-Expert 8.0.5b for response surface analysis test.The optimum extracting parameters were as follows:microwave ethanol volume fraction 56%,liquid-solid ratio 51 mL/g,radiation time 3.7 min. Under this condition, the yield of flavonoids from hawthorn leaves was 8.923%.

microwave extraction; hawthorn leaves; total flavonoids; response surface analysis

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.01.007

2016-05-13

上海市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(s14036)

施 昶(1994—)，女，浙江德清人，研究方向：中藥制藥工程；韓 偉(聯(lián)系人)，教授，E-mail:whan@ecust.edu.cn

Q684； TQ464.1

A

1672-3678(2017)01-0043-06