金銀花常用農(nóng)藥對其綠原酸含量影響的初步研究

李嘉欣，薛健*，金紅宇，馬雙成

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

金銀花常用農(nóng)藥對其綠原酸含量影響的初步研究

李嘉欣1，薛健1*，金紅宇2，馬雙成2

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

目的：研究防治金銀花病蟲害常用農(nóng)藥吡蟲啉、啶蟲脒、三唑酮對金銀花中綠原酸含量的影響，為三種農(nóng)藥的合理使用提供參考。方法：采用田間試驗的方法，噴施不同濃度的三種藥劑(吡蟲啉30 g/hm2、90 g/hm2；啶蟲脒3.75 g/hm2、18.75 g/hm2；三唑酮114 g/hm2、342 g/hm2)，于施藥后2 h、1、2、3、5、6、7、9、10、12 d分別采集金銀花樣品，使用藥典方法測定樣品中綠原酸含量，對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果：噴施不同濃度吡蟲啉與啶蟲脒的金銀花樣品與空白組樣品相比，綠原酸含量增加，而噴施不同濃度三唑酮的金銀花樣品綠原酸含量則降低，各施藥組測得綠原酸含量均符合藥典要求。三種農(nóng)藥對綠原酸含量的影響程度均隨施藥劑量的增加而增加，除啶蟲脒低劑量組對綠原酸含量無顯著影響外，其他施藥組均有極顯著影響。結(jié)論：吡蟲啉、啶蟲脒促進金銀花中綠原酸的積累，三唑酮則抑制綠原酸的積累，使用時應(yīng)有所注意。

金銀花；吡蟲啉；啶蟲脒；三唑酮；綠原酸

藥用植物作為一類生長特殊、成分復(fù)雜的特色小宗植物，在其栽培過程中常使用化學(xué)技術(shù)，尤其是農(nóng)藥來防治病蟲害。由于藥用植物的藥理作用與質(zhì)量取決于其所含有效成分的類別與積累量，因此不同于其它作物，在藥用植物的種植過程中更應(yīng)關(guān)注其所含的有效成分。任斌等[1]研究發(fā)現(xiàn)，噴施不同濃度吡蟲啉防治枸杞蚜蟲病時，枸杞果實中黃酮含量明顯升高，對枸杞類胡蘿卜素含量也有不同程度的影響。劉洪科[2]用多菌靈、代森錳鋅、世高處理龍膽褐斑病和斑枯病時發(fā)現(xiàn)，供試農(nóng)藥對龍膽苦苷含量有所影響但并不明顯。沈一行等[3]發(fā)現(xiàn)，噴施殺菌劑敵克松后，曼陀羅及毛曼陀羅的花和葉中所含生物堿的含量均顯著下降。由此可見，農(nóng)藥的施用會對藥用植物的有效成分造成一定的影響。然而現(xiàn)階段，對于農(nóng)藥在藥用植物上的研究，大多集中在農(nóng)藥對病蟲害的防治效果、農(nóng)藥殘留方面，農(nóng)藥對藥用植物中有效成分影響的研究才剛剛起步[4-8]。

金銀花作為中國傳統(tǒng)的藥食兩用中藥材之一，有著悠久的用藥歷史，其市場需求量龐大。河南省封丘縣為金銀花的主要產(chǎn)區(qū)之一，在對當(dāng)?shù)亟疸y花種植情況調(diào)研后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)亟疸y花在生產(chǎn)過程中病蟲害干擾嚴(yán)重，其中蟲害以蚜蟲為主，病害以白粉病為主。由于金銀花中尚無登記農(nóng)藥，所以當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶常根據(jù)農(nóng)藥銷售店的推薦或種植經(jīng)驗，選擇吡蟲啉、啶蟲脒防治蚜蟲病，三唑酮防治白粉病。綠原酸作為金銀花的主要藥用成分與次生代謝產(chǎn)物，是衡量金銀花質(zhì)量的指標(biāo)成分之一[9-10]。然而對于金銀花品質(zhì)的評價，主要集中在對不同采收期綠原酸含量的分析，農(nóng)藥的種類、施用劑量等因素是否對金銀花中綠原酸產(chǎn)生影響卻鮮有報道，所以有必要對農(nóng)藥在金銀花生長過程中對其藥用成分的影響進行研究[11-13]。本研究采用田間試驗的方法對以上三種常用農(nóng)藥進行研究，對農(nóng)藥在不同噴施劑量下金銀花中綠原酸的含量進行了測定，以考察不同農(nóng)藥與劑量對金銀花中綠原酸的影響，旨在為金銀花中農(nóng)藥的合理、安全、規(guī)范使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：甲醇(分析純，北京化工廠)；磷酸(分析純，天津市光復(fù)化工試劑廠)；乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；水(MiLLi-Q超純水)；綠原酸(中國食品藥品檢定研究院)。

供試藥劑：吡蟲啉(10%可濕性粉劑，江蘇省吳縣市農(nóng)藥廠)；啶蟲脒(3%乳油，日本曹大株式會社)；三唑酮(20%乳油，江蘇建農(nóng)農(nóng)藥化工廠有限公司)。

儀器：高效液相色譜(Waters 2695)，配紫外檢測器；色譜柱Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent)；電子分析天平(PL203型，梅特勒-托利多儀器有限公司)；超聲波清洗機(T-310型，北京天鵬有限公司)。

1.2 田間試驗及樣品采集

田間試驗在河南省新鄉(xiāng)市封丘縣進行。參照農(nóng)業(yè)部制定的《農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》[14](NY/T 788-2004)，使用吡蟲啉、啶蟲脒、三唑酮進行金銀花綠原酸含量試驗。每種農(nóng)藥設(shè)低劑量、高劑量2個處理，每個處理設(shè)3個重復(fù)，另設(shè)1個空白對照組，共19個小區(qū)，每個小區(qū)種植面積為10 m2，種植金銀花13株，小區(qū)間設(shè)1行保護行，行距1 m。以《農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則》[15]所規(guī)定的每次施用劑量或稀釋倍數(shù)為參考，考慮到農(nóng)民在種植過程中可能要多次噴施且劑量高于農(nóng)藥說明書用量，故本實驗三種農(nóng)藥的具體用量為：吡蟲啉低劑量30 g/hm2，高劑量90 g/hm2；啶蟲脒低劑量3.75 g/hm2，高劑量18.75 g/hm2；三唑酮低劑量114 g/hm2，高劑量342 g/hm2。采用一次施藥多次采樣的方法進行試驗，按實際濃度配制農(nóng)藥，均勻地對每個小區(qū)進行噴霧施藥1次，分別于施藥后2 h、1、2、3、5、6、7、9、10、12 d在每個小區(qū)內(nèi)使用隨機法采集金銀花花蕾約100 g，55 ℃烘干15 h后，放入-20 ℃冰箱中保存。

1.3 樣品分析方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫Extend-C18填充柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；紫外檢測器；流動相：乙腈:0.4%磷酸溶液(13:87)；流速：1 mL/min；檢測波長：327 nm；進樣量：5 μL；外標(biāo)法定量。

1.3.2 樣品制備

采用《中國藥典》金銀花項下綠原酸含量測定方法[16]。精密稱取混勻的金銀花粉末0.5 g(過四號篩)于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(250 W，35 kHz)30 min，放冷后再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL于25 mL量瓶中，用50%甲醇定容，搖勻，即得。

1.3.3 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品2.08 mg，用50%甲醇溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，搖勻，制得41.6 μg/mL的溶液(10 ℃以下保存)。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

按照1.2、1.3所述方法對采集樣品進行測定，得到不同采樣時間、不同施藥劑量下金銀花中綠原酸的含量，繪制綠原酸含量隨采樣時間的變化曲線，并用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0對三種農(nóng)藥的測定結(jié)果進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種農(nóng)藥處理的金銀花中綠原酸含量測定結(jié)果

圖1 三種農(nóng)藥處理的金銀花中綠原酸含量曲線注：a為吡蟲啉，b為啶蟲脒，c為三唑酮

測定結(jié)果表明，空白小區(qū)金銀花樣品中綠原酸含量為2.85～3.34%；吡蟲啉低、高劑量小區(qū)的綠原酸平均含量分別為3.26～3.73%、3.32～3.90%；啶蟲脒低、高劑量小區(qū)的綠原酸平均含量分別為2.90～3.40%、2.90～3.61%；三唑酮低、高劑量小區(qū)的綠原酸平均含量分別為2.58～2.94%、2.18～2.90%。《中國藥典》中規(guī)定，金銀花中綠原酸含量不得少于1.5%，樣品均符合要求[16]。

從圖1中可以看出，三種農(nóng)藥對金銀花中綠原酸的含量均有一定程度的影響。噴施吡蟲啉、啶蟲脒后金銀花中綠原酸含量均升高，結(jié)合上述數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)啶蟲脒處理的樣品與吡蟲啉相比綠原酸含量升高程度較??；而噴施三唑酮后綠原酸含量降低。三種農(nóng)藥不同噴施劑量樣品中綠原酸含量的變化趨勢相似，且三種農(nóng)藥對綠原酸含量的影響程度均隨噴施劑量的增加而增加。另外，如圖1(b)所示，啶蟲脒施藥組測定結(jié)果的波動性較大，出現(xiàn)了施藥組含量比空白組低的情況，可能與采集樣品的均勻性有關(guān)。

2.2 方差分析

表1 三種農(nóng)藥對金銀花中綠原酸含量影響的顯著性

如表1所示，試驗結(jié)果的方差分析表明：低、高劑量吡蟲啉均對金銀花中綠原酸含量具有極顯著的影響，但施藥劑量的不同對綠原酸含量的影響不顯著；低劑量啶蟲脒對綠原酸含量無顯著影響，高劑量則有極顯著的影響，施藥劑量的差異對綠原酸含量的影響極顯著；低、高劑量三唑酮均對綠原酸含量有極顯著的影響，且不同施藥劑量對綠原酸含量的影響顯著。

3 討論

3.1 吡蟲啉及啶蟲脒促進金銀花中綠原酸的積累

綠原酸是金銀花中具有抗菌、抗病毒藥理活性的主要次生代謝產(chǎn)物之一，也是金銀花的保護素之一。據(jù)報道，當(dāng)金銀花受到異物侵?jǐn)_后，會提高自身綠原酸的含量，發(fā)揮其生物活性，從而抗御傷害進行自我保護[8]。吡蟲啉、啶蟲脒為新型氯代煙堿類超高效殺蟲劑，具有廣譜、高效、低毒、對環(huán)境安全等特點，并且具有良好的內(nèi)吸傳導(dǎo)性[17-18]。當(dāng)二者噴施到金銀花上后，通過在植物體內(nèi)的吸收及傳導(dǎo)，對植物產(chǎn)生了一定的刺激，可能參與到綠原酸生物合成的一系列酶促反應(yīng)中，從而導(dǎo)致綠原酸含量增加[1,19]。由圖1(a)、(b)可以看出，隨著施藥劑量的升高，綠原酸含量也有所增加，可能是因為高濃度的農(nóng)藥對綠原酸的生物合成具有更強的刺激作用。有研究發(fā)現(xiàn)，硝態(tài)氮的存在有利于綠原酸的積累[19]。吡蟲啉含有硝基亞胺藥效基團，啶蟲脒含有氰基亞胺藥效基團，可能由于硝基亞胺在植物體內(nèi)能代謝得到硝態(tài)氮，而氰基亞胺不能，因此吡蟲啉比啶蟲脒更能刺激綠原酸的合成[17,20]。此外，啶蟲脒在植物體內(nèi)的降解動態(tài)是前期緩慢，中期加快，后期減緩，這使得啶蟲脒施藥組對綠原酸合成產(chǎn)生了不同的刺激效應(yīng)，從而導(dǎo)致綠原酸含量隨采樣時間出現(xiàn)了一定的波動，出現(xiàn)了含量比空白對照低的情況[18]。

3.2 三唑酮抑制金銀花中綠原酸的積累

三唑酮是一種高效、低毒、低殘留、內(nèi)吸性強的三唑類殺菌劑，殺菌機理極為復(fù)雜，主要是通過抑制菌體麥角固醇的生物合成，從而發(fā)揮抗菌作用，對于治療白粉病具有特效[21]。如圖1(c)所示，在本實驗中發(fā)現(xiàn)，兩劑量處理的金銀花中綠原酸含量均有所下降，且施藥劑量越高，綠原酸含量下降越明顯。由于綠原酸具有抗菌活性，當(dāng)噴施三唑酮后，可能借助三唑酮對白粉真菌的殺滅作用，金銀花自身對抗白粉病的作用下降，導(dǎo)致綠原酸含量下降。另一方面，綠原酸含量的降低可能是因為三唑酮內(nèi)吸進入植物體后，經(jīng)過復(fù)雜的酶促反應(yīng)抑制了綠原酸的合成。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的三唑酮對植物生長具有一定的抑制作用[22]。而在田間試驗過程中發(fā)現(xiàn)，噴施高劑量三唑酮的金銀花植株與空白對照小區(qū)相比長勢緩慢，新鮮花蕾和嫩葉發(fā)出較慢。金銀花在二白期、大白期綠原酸含量較高，當(dāng)使用三唑酮后，可能由于三唑酮抑制了金銀花的生長從而干擾金銀花的花期，使得綠原酸的含量出現(xiàn)了下降[9]。

3.3 三種農(nóng)藥的使用建議

《中國藥典》規(guī)定金銀花中綠原酸含量不得少于1.5%[16]，所以在金銀花的實際種植過程中，可按說明書使用吡蟲啉與啶蟲脒，而三唑酮應(yīng)謹(jǐn)慎使用。

綜上所述，由于農(nóng)藥對藥用植物次生代謝產(chǎn)物的影響比較復(fù)雜，所以其具體作用機制還需更為細致地探討。此外，金銀花所含有效成分的種類繁多且含量各異，除綠原酸外，還含有木樨草苷、蘆丁、槲皮素等，而農(nóng)藥是否對這些次生代謝產(chǎn)物有所影響，有待借助中藥指紋圖譜等技術(shù)進行深入研究。

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Preliminary Study on the Effect of Commonly Uesd Pesticides onthe Content of Chlorogenic Acid in Loincerae Japonicae Flos

LI Jia-xin1，XUE Jian1，JIN Hong-yu2，MA Shuang-cheng2

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalScience&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China;2.NationalInstitutesforFoodandDrugControl，Beijing100050，China)

Objective: To research the effect on the content of chlorogenic acid in Loincerae Japonicae Flos processed by commonly used pesticides imidacloprid, acetamiprid, triadimefon, which can control diseases and pests, and to provide reference for the rational use of three pesticides.Methods: A field experiment was conducted. The filed plots were sprayed with different concentrations of three pesticides, and the flowers were picked after 2 hours, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10 and 12 days of the application of the pesticides. The pharmacopoeia method was used to determine the content of chlorogenic acid in the samples,and then the results were analyzed by statistical method.Results: Compared with the blank group, the content of chlorogenic acid in the samples with different concentrations of imidacloprid and acetamiprid was increased, while in the samples with different concentrations of triadimefon it was reduced. The impacts of three pesticides on the content of chlorogenic acid were increased with the increasing dose administration. Except the low dose group of acetamiprid, other administration groups all had a significant effect on the content of chlorogenic acid. Conclusion: Imidacloprid and acetamiprid can promote the accumulation of chlorogenic acid in Loincerae Japonicae Flos. However, triadimefon inhibits it. Therefore, we should pay attention when we use them.

Loincerae Japonicae Flos; Imidacloprid; Acetamiprid; Triadimefon; Chlorogenic acid

2016-05-05

2016-11-09

國家重大新藥創(chuàng)制專項(2014ZX09304307-002)

李嘉欣(1993-)， 女，碩士研究生，研究方向：中藥分析。

*通訊作者：薛健(1964-)，女，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥有效成分分析及質(zhì)量控制、中藥有害物質(zhì)研究。

R284.1

A

1002-2392(2017)02-0054-04