酸漿苦素抗日本血吸蟲作用研究

張?zhí)K，李冀*，楊世林，李笑然，許瓊明

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

酸漿苦素抗日本血吸蟲作用研究

張?zhí)K1，李冀1*，楊世林2，李笑然2，許瓊明2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

目的：考察酸漿苦素(Physalins)對(duì)日本血吸蟲病的治療效果。方法：將ICR小鼠隨機(jī)分為11組，在感染后1天、14天、35天后采用灌胃法給予不同劑量(60，30，15 mg/kg)酸漿苦素治療，感染后第49天處死小鼠，觀察不同給藥組小鼠的總蟲數(shù)、雌蟲數(shù)、體質(zhì)量、脾指數(shù)及肝臟肉芽腫變化。結(jié)果：與對(duì)照組相比，在感染日本血吸蟲1天給予低劑量酸漿苦素及35天給予高、中、低劑量酸漿苦素能明顯降低小鼠體內(nèi)總蟲數(shù)及雌蟲數(shù)(P<0.01)。在感染1天給予酸漿苦素治療能明顯增加小鼠體質(zhì)量，其中1天中劑量給藥組小鼠體質(zhì)量和脾指數(shù)明顯降低(P<0.01)。并且，在感染1天給予高、中、低劑量酸漿苦素治療及35天給予低劑量酸漿苦素能明顯降低小鼠肝臟中蟲卵肉芽腫的直徑，與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01)。結(jié)論：酸漿苦素對(duì)感染早期的日本血吸蟲病有一定的治療效果。

酸漿苦素；日本血吸蟲；總蟲數(shù)；雌蟲數(shù)；肉芽腫；殺蟲效果

血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人類健康、影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的人畜共患寄生蟲病，在全球76個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行[1]，它嚴(yán)重影響著人類的身體健康和國(guó)家、地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。血吸蟲病目前仍然是困擾全球的公共衛(wèi)生問題，我國(guó)是日本血吸蟲病流行的主要國(guó)家之一[2-3]。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直在尋找一種能夠有效控制并消滅血吸蟲的方法，目前而言，血吸蟲病的治療藥物仍將會(huì)是控制血吸蟲病的主要手段[4]。近年來(lái)，中草藥的抗血吸蟲作用的研究在中國(guó)已取得一些進(jìn)展，在抗血吸蟲病的工作中起到了一定的輔助作用。如紫草、金銀花、板藍(lán)根、防風(fēng)、五加皮、菊花、正柴胡飲等能明顯抑制血吸蟲尾蚴鉆穿皮膚[5]，并且很多中草藥具有逆轉(zhuǎn)肝纖維化、緩解治療血吸蟲病晚期肝硬化腹水等療效，如中藥軟肝散結(jié)湯治療血吸蟲病肝纖維化患者，具有較好的阻止及逆轉(zhuǎn)肝纖維化和提高血漿白蛋白水平的作用[6]，溫陽(yáng)活血湯配合西藥治療治療晚期血吸蟲病肝硬化患者也具有較好的療效[7]。

姑娘果(CalyxseuFructusPhysalis)，又叫錦燈籠，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為茄科多年生草本植物，野生于中國(guó)各地，尤為東北最多。據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》記載，其味酸、苦，性寒，具有清熱解毒、利咽化痰、利尿等作用，臨床可用于痰熱咳嗽、咽痛音啞、小便不利；外治天皰瘡、濕疹[8-9]。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道表明，錦燈籠中含有一系列酸漿苦素類化合物及其衍生物[10]，具有抗炎、抗癌和抑菌作用，但其抗日本血吸蟲的作用尚未明確。因此，本實(shí)驗(yàn)欲探究酸漿苦素的抗日本血吸蟲活性。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與釘螺

ICR小鼠，雌性，6～8 周齡，體質(zhì)量(25±5)g，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于可控環(huán)境中，可自由獲取食物水。陽(yáng)性釘螺購(gòu)自江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

酸漿苦素粉劑，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院楊世林教授課題組提供。

1.3 儀器

電子天平FA2104S(上海精工產(chǎn)品)；數(shù)字式移液器槍(上海Finnpipette Thermo)；Olympus CX31顯微鏡(Olympus)；高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；YQ-DSX-280A型壓力蒸汽滅菌器(上海中安醫(yī)療器械廠)；超低溫冰箱(Sanyo產(chǎn)品)；電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-927(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；解剖顯微鏡SZX12(Olympus)。

1.4 試劑

氯化鈉、二水合檸檬酸鈉、氫氧化鉀(KOH)、羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium,CMC)國(guó)藥分析純；0.9%氯化鈉注射液(0.9%NS)山東齊都藥業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 小鼠感染模型的建立及分組

采用腹部貼片法感染小鼠，每鼠(60±5)條日本血吸蟲尾蚴，感染小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組，每組10只，感染后第49天解剖。1D高中低劑量組分別于感染日本血吸蟲后第1天，以60 mg/kg、30 mg/kg、15 mg/kg灌胃，每日1次，連續(xù)5天；14D高中低劑量組分別于感染日本血吸蟲后第14天，以60 mg/kg、30 mg/kg、15 mg/kg灌胃，每日1次，連續(xù)5天；35 D高中低劑量組分別于感染日本血吸蟲后第35天，以60 mg/kg、30 mg/kg、15 mg/kg 灌胃，每日1次，連續(xù)5天[11]。

2.2 收集蟲體，觀察殺蟲效果

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠均于感染后49天解剖小鼠，仔細(xì)檢查肝門靜脈和腸系膜靜脈，收集蟲體計(jì)數(shù)，計(jì)算減蟲率和減雌率[12-13]。

減蟲率(%)=

減雌率(%)=

2.3 酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲感染小鼠體質(zhì)量和脾指數(shù)的影響

將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠于感染后49天(感染日本血吸蟲)稱取小鼠體質(zhì)量，剖殺小鼠，摘取脾臟，稱重，計(jì)算脾指數(shù)[14]。

2.4 酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲感染小鼠肝臟病理變化的影響

肝臟置于8%甲醛溶液內(nèi)固定，組織石蠟切片及蘇木素伊紅染色(hematoxylin and eosin staining，HE染色)操作觀察，測(cè)定小鼠肝臟中肉芽腫的平均直徑，隨機(jī)取3個(gè)肝臟切片，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野拍照(×100倍)，通過(guò)圖像分析軟件(ImageJ-NIH，Bethesda)測(cè)量肉芽腫的平均直徑(μm)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 酸漿苦素對(duì)體內(nèi)不同發(fā)育階段日本血吸蟲的作用結(jié)果

感染日本血吸蟲后1、14、35D給予60 mg/kg，30 mg/kg及15 mg/kg酸漿苦素，連續(xù)5天，灌胃治療。結(jié)果如下：感染血吸蟲第1天，高中低劑量組減蟲率分別為24.1%、26.5%、33.4%；減雌率分別為29.0%、27.9%、44.0%。感染血吸蟲第14天高中低劑量組減蟲率分別為27.8%、23.4%、25.1%；減雌率分別為23.3%、22.1%、20.3%。感染血吸蟲第35天，高中低劑量組減蟲率分別為37.8%、36.0%、36.6%；減雌率分別為48.7%、34.6%、34.6%(見表1)。在感染日本血吸蟲第1天對(duì)低劑量酸漿苦素及第35天對(duì)高、中、低劑量酸漿苦素更為敏感，減蟲率及減雌率均較第14天劑量組有所增加。體內(nèi)不同發(fā)育階段的日本血吸蟲對(duì)酸漿苦素的敏感程度也具有一定差別，隨著發(fā)育進(jìn)程，不同劑量酸漿苦素治療組小鼠體內(nèi)總蟲數(shù)及雌蟲數(shù)如圖所示(見圖1、圖2)。感染血吸蟲后，第1、14、35天給予酸漿苦素各劑量組其總蟲數(shù)均有明顯差異(P<0.05)。感染血吸蟲后，第1天和第35天給予酸漿苦素各劑量組其雌蟲數(shù)均有明顯差異(P<0.05)。而感染第1天給予低劑量酸漿苦素以及感染35天給予高、中、低劑量酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲總蟲數(shù)及雌蟲數(shù)的降低更為顯著(P<0.01)。

表1 不同濃度酸漿苦素對(duì)體內(nèi)不同發(fā)育階段日本血吸蟲的作用

圖1 不同劑量酸漿苦素對(duì)小鼠體內(nèi)不同發(fā)育階段日本血吸蟲作用后的作用效果 注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 不同劑量酸漿苦素對(duì)小鼠體內(nèi)不同發(fā)育階段日本血吸蟲作用后的雌蟲作用效果 注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.2 酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲感染小鼠體質(zhì)量及脾指數(shù)的影響

肝脾腫大是日本血吸蟲病的主要特征表現(xiàn)之一，偶見有脾臟寄生蟲卵的報(bào)道，日本血吸蟲可破壞脾臟內(nèi)的淋巴細(xì)胞，前期研究發(fā)現(xiàn)酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲造成的脾臟損傷有一定的治療效果，因此對(duì)其展開研究。如圖3所示，與未給藥的對(duì)照組相比，在感染后第1天給予高、中、低劑量酸漿苦素(60 mg/kg，30 mg/kg及15 mg/kg)治療，小鼠體質(zhì)量均比對(duì)照組有很顯著升高(P<0.01)，感染第14天和第35天給予酸漿苦素各劑量組小鼠體質(zhì)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異。與體質(zhì)量差異趨勢(shì)相似，感染后第1天給予高、中、低劑量酸漿苦素(60 mg/kg，30 mg/kg及15 mg/kg)治療，小鼠脾指數(shù)相較于對(duì)照組均有降低(P<0.05)，其中第1天的中劑量組有很顯著的差異(P<0.01)。感染后期其余組別小鼠脾指數(shù)比相較于對(duì)照組均無(wú)明顯差異(見圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在感染血吸蟲1天后給予酸漿苦素對(duì)的小鼠體質(zhì)量和脾臟有一定的改善作用。

3.3 酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲感染小鼠肝臟病理變化的影響

感染日本血吸蟲小鼠不同時(shí)期給予不同劑量酸漿苦素治療后于感染后第49天檢測(cè)的小鼠肝臟組織的病理學(xué)變化，如下圖5所示。正常小鼠肝小葉完整，肝細(xì)胞呈規(guī)則排列，可見中央靜脈及放射狀肝細(xì)胞索。未給藥組小鼠肝臟可見明顯的蟲卵沉積，并有大量淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分蟲卵聚集成簇，肝組織灶性壞死。感染第1天給予酸漿苦素低劑量組小鼠肝臟組織可見少量蟲卵沉積，并且給予酸漿苦素治療后肝細(xì)胞呈規(guī)則排列形態(tài)接近于正常，出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象。而感染第14天給藥組則出現(xiàn)嚴(yán)重的肉芽腫免疫反應(yīng)。感染第35天給予酸漿苦素治療后相比于未給藥對(duì)照組，蟲卵較少并且僅匯管大量蟲卵沉積，周圍有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)肉芽腫組織增生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酸漿苦素對(duì)由日本血吸蟲引起的早期和晚期肝臟病理變化有一定的改善。

由圖6可以看出，在第1天給予高、中、低劑量酸漿苦素及第35天給予低劑量組酸漿苦素，均能顯著的降低肝臟蟲卵肉芽腫的平均直徑(P<0.01)。說(shuō)明酸漿苦素對(duì)抗血吸蟲病的童蟲期療效顯著，對(duì)于成蟲期也有一定的療效。

圖5 酸漿苦素對(duì)感染日本血吸蟲小鼠的肝臟肉芽腫形成影響(×100)(N: normal untreated group; NC: Negative control)

圖6 酸漿苦素對(duì)感染日本血吸蟲小鼠的肝臟肉芽腫直徑的影響 注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

血吸蟲病是由血吸蟲成蟲寄生于人體所引起的地方性疾病，主要流行于亞、非、拉美的73個(gè)國(guó)家，據(jù)記載，世界上共有76個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行這種寄生蟲疾病，其中超過(guò)2億人已受感染，近8億人處在受感染的風(fēng)險(xiǎn)之中。經(jīng)過(guò)多年的積極防治，雖然我國(guó)血吸蟲病防治工作已取得了一定的成績(jī)，但目前形勢(shì)仍十分嚴(yán)峻。到了20世紀(jì)70年代中期，吡喹酮(praziquantel，PZQ)的問世使血吸蟲病化療達(dá)到了一個(gè)新的高度[15]。PZQ因其出色的療效和廣泛的適應(yīng)性在全球范圍內(nèi)成為抗血吸蟲病藥物的首選(WHO，2002)[16]，具有適應(yīng)廣、療效高、毒性低、療程短、給藥方便等優(yōu)點(diǎn)。但隨著一種抗蠕蟲藥物的過(guò)度使用，往往會(huì)使寄生蟲產(chǎn)生一定的抗藥性[17]。在血吸蟲重度流行區(qū)內(nèi)，PZQ的頻繁使用誘導(dǎo)血吸蟲產(chǎn)生抗藥性的問題已引起了國(guó)內(nèi)外眾多研究人員的關(guān)注，因此，尋找代替吡喹酮治療血吸蟲病的備選藥物亟待解決。

酸漿苦素類化合物是酸漿屬植物的主要藥用成分，研究表明酸漿苦素類化合物有一定的抗炎作用，但其抗血吸蟲作用尚未有研究[18]。在本研究中我們初步探討了酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲體內(nèi)發(fā)育不同時(shí)期的作用，觀察到酸漿苦素對(duì)小鼠體內(nèi)不同發(fā)育階段的日本血吸蟲有一定程度的殺傷作用。酸漿苦素給藥后小鼠體內(nèi)血吸蟲總蟲數(shù)相較于未給藥對(duì)照組明顯減少，說(shuō)明其對(duì)各種發(fā)育階段的血吸蟲均有一定的殺滅作用。其中以1D高中低劑量組給藥對(duì)于日本血吸蟲的效果比較理想，由此可見，酸漿苦素對(duì)于日本血吸蟲童蟲期比較敏感。35D高劑量組減雌率高于減蟲率，說(shuō)明酸漿苦素對(duì)成蟲期有一定效果。通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)，酸漿苦素對(duì)肝臟的增殖性肉芽腫有一定的抑制作用，提示酸漿苦素可以拮抗日本血吸蟲造成的肝臟損傷，但其確切殺蟲和抗炎機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，酸漿苦素對(duì)日本血吸蟲童蟲期和成蟲期具有一定的殺滅作用且對(duì)其產(chǎn)生的肝臟炎癥有一定的抑制作用。酸漿苦素有待成為治療日本血吸蟲病的候選藥物，尤其是早期感染階段。

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Antischistosomal Activity of Physalins against Schistosomajaponicum

ZHANG Su1，LI Ji1，YANG Shi-lin2,LI Xiao-ran2,XU Qiong-ming2

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.CollegeofPharmaceuticalSciences,SoochowUniversity,Suzhou215123,China)

Objective: To investigate the effect of Physalins on schistosomiasis. Methods ICR mice were randomly divided into eleven groups. We treated 1-day-old,14-day-old and 35-day-old Schistosoma japonicum infected mice with 60, 30, 15 mg/kg Physalins, respectively, with orally once a day for five consecutive days. The mice were sacrificed on the 49thday of post-infection. Observe the changes of the number of total worms, the number of female worms, body weight, spleen index and granuloma of different groups. Results:Administration of 15 mg/kg Physalins to the 1st day or administration of 60, 30 and 15 mg/kg Physalins to the 35th day post-infected mice could significantly reduce the total worms and female worms compared with those in the control group (P<0.01). Physalins for 1-day-old Schistosoma japonicam infected mice could significantly improve the body weight and reduce the spleen index (P<0.01). In addition, administration of 60, 30 and 15 mg/kg Physalins to the 1st day or administration of 15 mg/kg Physalins to the 35th day post-infected mice could significantly reduce the diameter of granuloma. Conclusion: Physalins has a therapeutic effect on early infectious schistosomiasis.

Physalins; Schistosoma japonicum; Total number of worms; Number of female worms; Granuloma; Schistosomicidal effect

2016-06-24

2016-11-09

張?zhí)K(1989-)，女，碩士研究生,主要研究方向：方劑配伍規(guī)律及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

*通訊作者：李冀(1960-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事方劑配伍規(guī)律及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0025-04