苜蓿皂苷對(duì)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)基因三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1、清道夫受體BⅠ mRNA表達(dá)的影響

陳言言 劉伯帥 陳躍鵬 朱曉艷 袁德地 齊勝利 王成章 史瑩華

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州450002)

苜蓿皂苷對(duì)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)基因三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1、清道夫受體BⅠ mRNA表達(dá)的影響

陳言言 劉伯帥 陳躍鵬 朱曉艷 袁德地 齊勝利 王成章 史瑩華*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州450002)

本試驗(yàn)以大鼠肝臟和肝臟細(xì)胞(BRL細(xì)胞)及小鼠巨噬細(xì)胞(ANA-1細(xì)胞)為研究對(duì)象，從動(dòng)物和細(xì)胞水平上研究苜蓿皂苷對(duì)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)基因三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)、清道夫受體BⅠ(SR-BⅠ)mRNA表達(dá)的影響。取雄性健康SD大鼠32只，隨機(jī)分成4組，分別為正常對(duì)照組、苜蓿皂苷組、高脂模型組和高脂苜蓿皂苷組，每組8只。正常對(duì)照組和苜蓿皂苷組飼喂基礎(chǔ)飼糧，其余2組均飼喂高脂飼糧，飼喂4周后，苜蓿皂苷組和高脂皂苷組從第5周開(kāi)始每天灌胃240 mg/kg苜蓿皂苷，灌胃4周。采用胎牛血清作用于BRL細(xì)胞48 h，構(gòu)建脂變模型，將BRL細(xì)胞分為正常對(duì)照組(正常細(xì)胞)、苜蓿皂苷組(正常細(xì)胞)、脂變模型組(脂變細(xì)胞)和脂變?cè)碥战M(脂變細(xì)胞)，苜蓿皂苷組、脂變?cè)碥战M培養(yǎng)液中添加苜蓿皂苷(終濃度300 μg/mL)，培養(yǎng)24 h。采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)作用于ANA-1細(xì)胞48 h，構(gòu)建荷脂模型，將ANA-1細(xì)胞分為正常對(duì)照組(正常細(xì)胞)、苜蓿皂苷組(正常細(xì)胞)、荷脂模型組(荷脂細(xì)胞)和荷脂皂苷組(荷脂細(xì)胞)，苜蓿皂苷組、荷脂皂苷組培養(yǎng)液中添加苜蓿皂苷(終濃度300 μg/mL)，培養(yǎng)24 h。采用熒光定量PCR法測(cè)定大鼠肝臟、BRL細(xì)胞和ANA-1細(xì)胞中ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達(dá)量。結(jié)果表明：1)苜蓿皂苷顯著提高了正常大鼠肝臟ABCA1和SR-BⅠ mRNA表達(dá)量(P<0.05)，顯著提高了高脂大鼠肝臟ABCA1 mRNA的表達(dá)量(P<0.05)，對(duì)高脂大鼠肝臟SR-BⅠ mRNA表達(dá)量影響不顯著(P>0.05)；2)苜蓿皂苷顯著提高了正常BRL細(xì)胞ABCA1和SR-BⅠ mRNA的表達(dá)量(P<0.05)，而對(duì)脂變BRL細(xì)胞ABCA1和SR-BⅠ mRNA表達(dá)量影響不大(P>0.05)；3)苜蓿皂苷顯著降低正常ANA-1細(xì)胞ABCA1 mRNA表達(dá)量(P<0.05)。由此可見(jiàn)，苜蓿皂苷可通過(guò)上調(diào)大鼠肝臟和正常肝臟細(xì)胞ABCA1和SR-BⅠ mRNA的表達(dá)促進(jìn)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，增強(qiáng)肝臟膽固醇排泄，從而發(fā)揮其對(duì)高脂血癥的預(yù)防和治療作用。

苜蓿皂苷；BRL細(xì)胞；ANA-1細(xì)胞；大鼠；膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)；mRNA表達(dá)量

隨著社會(huì)現(xiàn)代化的發(fā)展，人們的生活質(zhì)量得到不斷的提高，但是也帶來(lái)了不利的影響。血脂異常，尤其是血液中膽固醇含量的升高是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和冠狀動(dòng)脈心臟疾病發(fā)生的主要因素。在正常情況下，大部分膽固醇是細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)成分，其余是通過(guò)血流運(yùn)至肝臟、腎上腺、卵巢、睪丸、皮膚等組織和器官，之后被合成為膽汁酸、激素和維生素D。膽固醇和其他脂質(zhì)以及各種載脂蛋白共同組成數(shù)種脂蛋白[1]。人類(lèi)80%膽固醇在肝外組織合成，極少一部分來(lái)源于血漿中的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。為防止肝外組織膽固醇的積聚，肝外組織合成的膽固醇由高密度脂蛋白(HDL)攜帶經(jīng)血流轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，合成膽汁酸[2]。在膽固醇從肝外組織向肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中，HDL具有重要的作用。大規(guī)模臨床試驗(yàn)證實(shí)，HDL含量與心血管疾病呈負(fù)相關(guān)。而HDL的代謝是相當(dāng)復(fù)雜的，它涉及許多代謝通路，HDL作為膽固醇受體不斷地移走細(xì)胞膜上的膽固醇，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多余膽固醇的外流，這一過(guò)程是由識(shí)別載脂蛋白A1(apoA-1)和清道夫受體BⅠ(SR-BⅠ)介導(dǎo)的。最近，路倩等[3]報(bào)道了非受體介導(dǎo)的方式，即通過(guò)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)清除外周組織膽固醇的方式。ABCA1屬于三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABC)基因家族一員，ABCA1編碼的蛋白參與生物膜間物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，ABCA1編碼的蛋白質(zhì)稱(chēng)作膽固醇外流調(diào)節(jié)蛋白(CERP)，參與膽固醇外流，促使膽固醇轉(zhuǎn)移到apoA-1和HDL。

目前，在植物中發(fā)現(xiàn)具有降低膽固醇作用的主要活性成分有皂苷類(lèi)、酮類(lèi)、萜類(lèi)等。其中皂苷具有多種生物學(xué)功能，是植物中降低機(jī)體膽固醇含量的重要有效成分。因此，苜蓿皂苷成為植物提取物中降血脂藥物研究和開(kāi)發(fā)的一個(gè)重點(diǎn)。

苜蓿皂苷是從苜蓿中提取的具有獨(dú)特生物學(xué)活性的物質(zhì)，是由糖中羥基或非糖類(lèi)化合物的羥基以縮醛鏈脫水縮合而成的環(huán)狀縮醛鏈物，其結(jié)構(gòu)為五環(huán)三萜烯類(lèi)化合物[4]。早在20世紀(jì)50年代，國(guó)外就開(kāi)始研究苜蓿皂苷，主要在提取、分離、結(jié)構(gòu)鑒定方面做了大量的工作，有關(guān)這方面的研究報(bào)道很多。近年來(lái)，我國(guó)學(xué)者對(duì)苜蓿皂苷的研究也取得一定的成績(jī)。王先科等[5]研究了苜蓿皂苷通過(guò)促進(jìn)肝臟膽固醇7-羥化酶(CYP7A1)和低密度脂蛋白受體(LDL-R)的表達(dá)，增強(qiáng)肝臟膽固醇的排泄，發(fā)揮其對(duì)高脂血癥的預(yù)防和治療作用。Liang等[6]以大鼠肝臟細(xì)胞(BRL細(xì)胞)為對(duì)象，研究苜蓿皂苷對(duì)膽固醇代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，從而探究苜蓿皂苷在細(xì)胞水平上對(duì)膽固醇代謝的調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)通過(guò)苜蓿皂苷在大鼠肝臟和BRL細(xì)胞及小鼠巨噬細(xì)胞(ANA-1細(xì)胞)中對(duì)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport,RCT)相關(guān)基因ABCA1和SR-BⅠ mRNA的表達(dá)，初步探討苜蓿皂苷對(duì)RCT的影響及其機(jī)制，為其在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苜蓿皂苷(河北寶恩公司，由苜蓿草粉經(jīng)醇提法與大孔樹(shù)脂柱分離純化得到，經(jīng)薄層層析法檢測(cè)其主要成分為苜蓿皂苷，經(jīng)紫外分光光度法檢測(cè)其中總皂苷含量為51%)、32只雄性健康SD無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)大鼠(河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)、全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI7170A，HITACHI公司)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)、總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)、總膽汁酸測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、酶標(biāo)儀(Multiskan GO 1.00.40，Thermo公司)、HDL和低密度脂蛋白(LDL)測(cè)定試劑盒(廣州達(dá)爾斯科生物科技有限公司)、甘油三酯(TG)檢測(cè)試劑盒(寧波美康生物科技股份有限公司)、大鼠BRL細(xì)胞和ANA-1細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)、噻唑藍(lán)(MTT)(Solarbio公司)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)(北京協(xié)生生物科技有限責(zé)任公司)、高糖DMEM培養(yǎng)液(Solarbio公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、RPMI-1640培養(yǎng)液(Solarbio公司)、胰酶(Solarbio公司)、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)、25 cm2培養(yǎng)瓶(Coming公司)、6孔板和96孔板(Coming公司)、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司)、總RNA提取試劑(Invitrogen公司)、熒光定量PCR試劑盒[東洋紡(上海)生物科技有限公司]、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]、2×Taq PCR Master Mix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、瓊脂糖(Invitrogen公司)。

1.2 動(dòng)物試驗(yàn)

預(yù)試期(1周)結(jié)束后，將32只雄性健康SD大鼠[體重(191.41±16.01) g]隨機(jī)分為2組，分別為正常組、高脂組，各組之間血清TC含量和體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。采用飼喂高脂飼糧的方法建立大鼠高脂模型。正常組飼喂基礎(chǔ)飼糧(表1)，高脂組飼喂高脂飼糧。高脂飼糧組成：1.0%膽固醇、0.1%豬膽鹽、10.0%豬油、5.0%蛋黃粉、5.0%全脂奶粉、78.9%基礎(chǔ)飼糧。建模時(shí)間為4周。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

建模結(jié)束后，根據(jù)血清TC含量和體重分別將正常組和高脂組各隨機(jī)分為2組，分組情況及具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下。正常對(duì)照組：飼喂基礎(chǔ)飼糧，每天09:00灌胃2 mL蒸餾水；苜蓿皂苷組：飼喂基礎(chǔ)飼糧，每天09:00灌胃240 mg/kg苜蓿皂苷2 mL；高脂模型組：飼喂高脂飼糧，每天09:00灌胃2 mL蒸餾水；高脂皂苷組：飼喂高脂飼糧，1～4周每天09：00灌胃2 mL蒸餾水，從第5周開(kāi)始，每天09：00灌胃240 mg/kg苜蓿皂苷，連續(xù)灌胃4周。各組大鼠均自由飲水、采食。

樣本的采集與制備：試驗(yàn)結(jié)束后，所有大鼠禁食過(guò)夜，麻醉后沿大鼠腹部中部剖開(kāi)，取肝臟相同部位，吸干血跡用錫箔紙包裝好后，迅速置于液氮中冷凍，并保存于-80 ℃冰箱待測(cè)。

1.3 BRL細(xì)胞試驗(yàn)

1.3.1 脂變BRL細(xì)胞模型的建立[7]

BRL細(xì)胞接種于50 mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿瓶底，胰酶消化，計(jì)數(shù)后接種于6孔板中，每孔接種約1.5×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%后，更換新鮮培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中加入50%胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h至出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)脂滴或泡沫樣物沉積，即制成脂變細(xì)胞模型。將所得細(xì)胞改置于含0.1%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，使其靜止24 h，再做相應(yīng)的處理。

1.3.2 試驗(yàn)分組

細(xì)胞用六孔板培養(yǎng)，試驗(yàn)分為4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，具體分組情況如下。

正常對(duì)照組：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，置于含0.1%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

苜蓿皂苷組：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，置于含0.1%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL的300 μg/mL(終濃度為100 μg/mL)苜蓿皂苷溶解液，培養(yǎng)24 h。

脂變模型組：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后換成含50%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，置于含0.1%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

脂變?cè)碥战M：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后換成含50%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，置于含0.1%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL的300 μg/mL(終濃度為100 μg/mL)苜蓿皂苷溶解液，培養(yǎng)24 h。

1.4 ANA-1細(xì)胞試驗(yàn)

將ANA-1細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，鋪滿瓶底即可，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。注意更換新鮮培養(yǎng)液。細(xì)胞密度達(dá)到2×106個(gè)/mL更換培養(yǎng)液，定期將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4.1 荷脂ANA-1細(xì)胞模型的建立

試驗(yàn)前以無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞12 h，使細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。用50 mg/L的ox-LDL作用于細(xì)胞48 h，制成荷脂ANA-1細(xì)胞模型。

1.4.2 試驗(yàn)分組

細(xì)胞用六孔板培養(yǎng)，試驗(yàn)分為為4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，具體分組情況如下。

正常對(duì)照組：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后置于含0.1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

苜蓿皂苷組：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后置于含0.1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL 300 μg/mL(終濃度為100 μg/mL)苜蓿皂苷溶解液培養(yǎng)24 h。

荷脂模型組：六孔板每孔添加2.8 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，100 μL 1.45 μg/μL的ox-LDL(終濃度50 mg/L)培養(yǎng)48 h后，置于含0.1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

荷脂皂苷組：六孔板每孔添加2.8 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，100 μL 1.45 μg/μL的ox-LDL(終濃度50 mg/L)培養(yǎng)48 h后，置于含0.1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL 300 μg/mL(終濃度為100 μg/mL)苜蓿皂苷溶解液的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.5 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.5.1 MTT法測(cè)定苜蓿皂苷對(duì)BRL和ANA-1細(xì)胞活性的影響

用濃度為2×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后加入不同劑量的苜蓿皂苷，終濃度分別為0(對(duì)照)、50、100、200、250 μg/mL。每組6個(gè)重復(fù)孔，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h，顯微鏡觀察其效果，去上清液，加入90 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT孵育，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μL振蕩10 min，以無(wú)細(xì)胞空白孔為零點(diǎn)，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)各孔吸光度值(OD)。

1.5.2 大鼠肝臟、BRL細(xì)胞和ANA-1細(xì)胞基因mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

1.5.2.1 肝臟和細(xì)胞總RNA提取

Trizol法提取總RNA，保存于-80 ℃，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.5.2.2 總RNA濃度的測(cè)定

采用Thermo微量紫外分光光度計(jì)260 nm處測(cè)定總RNA濃度，并記錄OD260 nm/OD280 nm，結(jié)果在1.8～2.0的樣本滿足要求。

1.5.2.3 總RNA的質(zhì)量檢測(cè)

用1%瓊脂糖凝膠膠電泳鑒定總RNA的完整性。

1.5.2.4 總RNA反轉(zhuǎn)錄

采用大連寶生物工程公司提供的Reverse Transcriptase M-MLV(Rnase H-)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，得到cDNA產(chǎn)物。

1.5.2.5 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、ABCA1、SR-BⅠ DNA序列，小鼠β肌動(dòng)蛋白(β-actin)、ABCA1、SR-BⅠ DNA序列運(yùn)用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列及參數(shù)見(jiàn)表2。

1.5.2.6 熒光定量PCR

本試驗(yàn)采用SYBR qPCR Mix為熒光染料，經(jīng)過(guò)摸索確定最佳反應(yīng)體系如下：SYBR-qPCR Mix 5 μL，焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水3.8 μL，模板cDNA 1 μL，上、下游引物各0.1 μL，總體系為10 μL。按照以下條件進(jìn)行熒光定量PCR：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，此步驟40個(gè)循環(huán)；溶解曲線，產(chǎn)物20 ℃保存10 min。根據(jù)本試驗(yàn)條件，采用2-△△Ct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較，以P<0.05表示差異顯著，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿皂苷對(duì)BRL細(xì)胞、ANA-1細(xì)胞活性的影響

由表3可知，苜蓿皂苷添加終濃度為50、100 μg/mL時(shí)，BRL細(xì)胞活性與對(duì)照組相比差異不大，而200、250 μg/mL時(shí)BRL細(xì)胞活性升高，且與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。苜蓿皂苷添加終濃度為50、100、200、250 μg/mL時(shí)ANA-1細(xì)胞活性與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。苜蓿皂苷濃度在100 μg/mL以下時(shí)對(duì)BRL細(xì)胞和ANA-1細(xì)胞都未見(jiàn)毒性。

表2 引物序列及參數(shù)

表3 苜蓿皂苷對(duì)BRL細(xì)胞、ANA-1細(xì)胞活性的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無(wú)小寫(xiě)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same column, values with the same or no small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 苜蓿皂苷對(duì)大鼠肝臟ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達(dá)量的影響

由表4可知，與正常對(duì)照組相比，苜蓿皂苷組、高脂模型組、高脂皂苷組ABCA1 mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，分別是正常對(duì)照組的8.34、3.86、9.57倍；與正常對(duì)照組相比，苜蓿皂苷組SR-BⅠ mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，分別是正常對(duì)照組的12.07、2.77、2.94倍;與高脂模型組相比較，高脂皂苷組ABCA1 mRNA表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，SR-BⅠ mRNA表達(dá)量則變化不大，差異不顯著(P>0.05)。

2.3 苜蓿皂苷對(duì)BRL細(xì)胞ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達(dá)量的影響

由表5可知，與正常對(duì)照組相比，苜蓿皂苷組、脂變模型組、脂變?cè)碥战MABCA1 mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，分別是正常對(duì)照組的5.97、1.46、1.47倍；與脂變模型組相比，脂變?cè)碥战MABCA1 mRNA表達(dá)量沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。與正常對(duì)照組相比，苜蓿皂苷組SR-BⅠ mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，是正常對(duì)照組的1.69倍，脂變模型組和脂變?cè)碥战M顯著降低(P<0.05)，分別是正常對(duì)照組的0.17、0.35倍；與脂變模型組相比較，脂變?cè)碥战MSR-BⅠ mRNA的表達(dá)量略有升高，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 苜蓿皂苷對(duì)大鼠肝臟ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達(dá)量的影響

表5 苜蓿皂苷對(duì)BRL細(xì)胞ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達(dá)量的影響

2.4 苜蓿皂苷對(duì)ANA-1細(xì)胞ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達(dá)量的影響

由表6可知，與正常對(duì)照組相比較，苜蓿皂苷組、荷脂模型組、荷脂皂苷組ABCA1 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，是正常對(duì)照組的0.59、0.24、0.26倍。與正常對(duì)照組相比，苜蓿皂苷組SR-BⅠ mRNA表達(dá)量略有下降(P>0.05)，是正常對(duì)照組的0.60倍，荷脂模型組和荷脂皂苷組則顯著提高(P<0.05)，分別是正常對(duì)照組的4.56、4.07倍；與荷脂模型組相比較，荷脂皂苷組ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達(dá)量均沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。

表6 苜蓿皂苷對(duì)ANA-1細(xì)胞ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達(dá)量的影響

3 討 論

血脂是血液中所含各類(lèi)脂質(zhì)的總稱(chēng)，包括膽固醇、TG、磷脂(PL)和游離脂肪酸(FFA)等。本課題組前期研究表明，苜蓿皂苷可以能降低高脂血癥大鼠血清中TC、TG和LDL-C含量，表明苜蓿皂苷具有良好的降血脂效應(yīng)[8]。

HDL的抗動(dòng)脈粥硬化性疾病作用主要基于HDL參與的RCT過(guò)程。而苜蓿皂苷具有溶血作用，將其水溶液注射入血液，低濃度時(shí)即可使紅細(xì)胞破裂。一般認(rèn)為溶血作用與皂苷和紅細(xì)胞膜中膽固醇的相互作用有關(guān)。本試驗(yàn)用MTT法檢測(cè)苜蓿皂苷對(duì)BRL細(xì)胞、ANA-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以確定苜蓿皂苷對(duì)這2種細(xì)胞是否具有毒性，并確定細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中苜蓿皂苷的添加量，為后續(xù)試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，苜蓿皂苷濃度小于100 μg/mL時(shí)對(duì)BRL細(xì)胞的活性并無(wú)影響，苜蓿皂苷各個(gè)劑量對(duì)ANA-1細(xì)胞的影響差異均不顯著，但濃度高于100 μg/mL時(shí)，ANA-1細(xì)胞活性有下降趨勢(shì)，故選取100 μg/mL作為細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中苜蓿皂苷的添加量。

組成生物膜系統(tǒng)的重要成分——膽固醇的攝取、合成以及排出之間存在著動(dòng)態(tài)平衡，這個(gè)平衡是維持細(xì)胞膜系統(tǒng)與細(xì)胞基本生命活動(dòng)的關(guān)鍵。RCT是指新生的圓盤(pán)狀HDL從外周細(xì)胞(包括動(dòng)脈壁細(xì)胞)中攝取過(guò)剩的膽固醇，在血漿中經(jīng)卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(lecithin cholesterolacyl transferase,LCAT)酯化后，游離膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懝檀贾⑾騂DL的內(nèi)核轉(zhuǎn)移，最終形成球狀的成熟HDL，將膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，主要通過(guò)生成膽汁酸的形式排出體外的過(guò)程[9-10]。機(jī)體通過(guò)這一過(guò)程阻斷泡沫細(xì)胞的形成，是HDL抗動(dòng)脈粥樣硬化的最主要機(jī)制之一。目前已知有3條膽固醇流出通路，分別為apoA-1/ABCA1通路、SR-BⅠ途徑和液相擴(kuò)散途徑。本試驗(yàn)選取了RCT過(guò)程中的2種關(guān)鍵基因ABCA1、SR-BⅠ，從個(gè)體和細(xì)胞水平研究苜蓿皂苷對(duì)其mRNA表達(dá)的影響，初步探討苜蓿皂苷對(duì)RCT的調(diào)控機(jī)制。

ABCA1是ABC超家族的成員之一，能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出而參與RCT過(guò)程,從而清除組織過(guò)量的膽固醇[11]。它是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流、形成HDL、增加RCT的關(guān)鍵因子，ABCA1介導(dǎo)RCT的第1步，也是限速步驟，對(duì)脂質(zhì)代謝和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展具有重要影響。大量研究表明，高表達(dá)ABCA1的轉(zhuǎn)基因小鼠可以通過(guò)升高血清中HDL含量，降低LDL含量，加速體內(nèi)膽固醇的流出[12-14]；同時(shí)，ABCA1在巨噬細(xì)胞清除過(guò)多的膽固醇，阻止動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展方面發(fā)揮重要作用[15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加苜蓿皂苷后正常和高脂大鼠肝臟中ABCA1 mRNA表達(dá)量均顯著升高，正常BRL細(xì)胞中ABCA1 mRNA表達(dá)量也顯著升高，說(shuō)明苜蓿皂苷可通過(guò)上調(diào)ABCA1 mRNA的表達(dá)來(lái)增加RCT。而添加苜蓿皂苷后脂變BRL細(xì)胞中ABCA1 mRNA的表達(dá)量變化不大，推測(cè)苜蓿皂苷對(duì)大鼠肝臟ABCA1的影響是代償性的而非直接作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。添加苜蓿皂苷后正常ANA-1細(xì)胞中ABCA1 mRNA表達(dá)量下降，荷脂ANA-1細(xì)胞中ABCA1 mRNA的表達(dá)量變化并不大。這說(shuō)明苜蓿皂苷并不能促進(jìn)巨噬細(xì)胞中RCT。對(duì)比大鼠肝臟、BRL細(xì)胞和ANA-1細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，苜蓿皂苷主要是促進(jìn)肝臟細(xì)胞中RCT，而對(duì)巨噬細(xì)胞中RCT影響不大。

SR-BⅠ屬于CD36超家族成員，主要分布及發(fā)揮重要作用的組織器官是肝臟，還有如腎上腺、卵巢、睪丸等產(chǎn)生甾體類(lèi)激素的組織中，而且在選擇性攝取HDL-C的組織中SR-BⅠ含量較多，此外在一些組織細(xì)胞中有低水平表達(dá)。SR-BⅠ是HDL受體，而且同時(shí)具有多個(gè)配體的結(jié)合位點(diǎn)。SR-BⅠ與HDL結(jié)合后，介導(dǎo)膽固醇脂選擇性攝取，在該過(guò)程中SR-BⅠ作為HDL受體，可直接將HDL-C選擇性攝取。HDL流出速率與細(xì)胞SR-BⅠ mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，SR-BⅠ在肝臟中過(guò)表達(dá)同時(shí)伴隨著血漿中HDL-C含量的降低和膽汁中膽固醇含量的升高；相反，對(duì)SR-BⅠ基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，血液循環(huán)中TC含量增加，尤其HDL-C含量。故而認(rèn)為，SR-BⅠ基因可參與RCT途徑，將血液及組織細(xì)胞中過(guò)多的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝及其他可利用的器官形成膽汁酸和類(lèi)固醇類(lèi)激素從而達(dá)到清除過(guò)多血脂，防止動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的作用[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，苜蓿皂苷主要影響正常大鼠肝臟和正常BRL細(xì)胞中SR-BⅠ mRNA表達(dá)，而對(duì)高脂大鼠和脂變BRL細(xì)胞中SR-BⅠ mRNA表達(dá)影響不大，推測(cè)苜蓿皂苷參與調(diào)節(jié)正常肝臟細(xì)胞SR-BⅠ mRNA表達(dá)，對(duì)脂變肝臟細(xì)胞中SR-BⅠ mRNA表達(dá)調(diào)節(jié)較少。這說(shuō)明血脂水平的高低影響體內(nèi)膽固醇的代謝，因此研究苜蓿皂苷對(duì)膽固醇代謝的影響時(shí)應(yīng)考慮血脂水平的差異。苜蓿皂苷對(duì)正常和荷脂ANA-1細(xì)胞中SR-BⅠ mRNA表達(dá)量的影響均不大，推測(cè)苜蓿皂苷對(duì)巨噬細(xì)胞中SR-BⅠ參與調(diào)節(jié)RCT無(wú)影響，具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究[17]。

4 結(jié) 論

苜蓿皂苷可通過(guò)上調(diào)大鼠肝臟和正常肝臟細(xì)胞ABCA1和SR-BⅠ mRNA的表達(dá)促進(jìn)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，增強(qiáng)肝臟膽固醇排泄，從而發(fā)揮其對(duì)高脂血癥的預(yù)防和治療作用。

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*Corresponding author, professor, E-mail: annysyh@126.com

(責(zé)任編輯 王智航)

Effects of Alfalfa Saponins mRNA Expressions of Reverse Cholesterol Transport Genes: ATP-Binding Cassette Transporter A1 and Scavenger Receptor Class B Type Ⅰ

CHEN Yanyan LIU Boshuai CHEN Yuepeng ZHU Xiaoyan YUAN Dedi QI Shengli WANG Chengzhang SHI Yinghua*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002，China)

Rat liver, rat liver cells (BRL cells) and mouse macrophages (ANA-1 cells) were used to investigate the effects of alfalfa saponins (AS) on mRNA expressions of reverse cholesterol transport genes, which were ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) and scavenger receptor class B type Ⅰ(SR-BⅠ), and discuss the effects of AS from animal and cellular levels. Thirty two healthy male SD rats were randomly divided into four groups: normal control group, AS group, hyperlipidemic model group and hyperlipidemic saponins group, and each group had 8 rats. Rats in normal control group and AS group were fed a basal diet, and those in the other two groups were fed a high-fat diet. After 4 weeks feeding, AS [240 mg/(kg·d)] was intragastric administered to rats in AS group and hyperlipidemic saponins group from weeks 5 to 8. BRL cells were incubated with fetal bovine serum for 48 h to constitute hyperlipidemic model. BRL cells were divided into four groups, which were normal control group (normal cells), AS group (normal cells), hyperlipidemic model group (hyperlipidemic cells) and hyperlipidemic saponins group (hyperlipidemic cells), and AS (final concentration 300 μg/mL) was added to culture medium in AS group and hyperlipidemic saponins group to culture for 24 h. ANA-1 cells were incubated with oxidized low density lipoprotein for 48 h to constitute lipid-loaded model. ANA-1 cells were divided into four groups, which were normal control group (normal cells), AS group (normal cells), lipid-loaded model group (lipid-loaded cells) and lipid-loaded saponins group (lipid-loaded cells), and AS (final concentration 300 μg/mL) was added to culture medium in AS group and lipid-loaded saponins group to culture for 24 h. The mRNA expressions ofABCA1 andSR-BⅠ in rat liver, BRL cells and ANA-1 cells were determined by fluorescent quantitative PCR. The results showed as follows: 1) AS significantly increased the mRNA expressions ofABCA1 andSR-BⅠ in liver of normal rats and ofABCA1 in liver of hyperlipidemic rats (P<0.05)， but had no significant effects on that ofSR-BⅠ in liver of hyperlipidemic rats (P>0.05); 2)AS significantly increased the mRNA expressions ofABCA1 andSR-BⅠ in normal BRL cells(P<0.05), but had no significant effects on those in hyperlipidemic BRL cells (P>0.05); 3) AS significantly reduced the mRNA expression ofABCA1 in normal ANA-1 cells (P<0.05). In conclusion, AS might promote reverse cholesterol transport by up-regulating the mRNA expressions ofABCA1 andSR-BⅠin rat liver and normal BRL cells, promote the excretion of liver cholesterol, and play prevention and curing effects on hyperlipidemia.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(4)：1446-1454]

alfalfa saponins; BRL cells; ANA-1 cells; rat; cholesterol reverse transport; mRNA expression

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.04.044

2016-10-14

國(guó)家自然科學(xué)基金(31301983)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-35)；河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(30600968)

陳言言(1989—),女，河南商丘人，碩士研究生，從事牧草營(yíng)養(yǎng)與利用研究。E-mail: 1220675190@qq.com

*通信作者：史瑩華，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: annysyh@126.com

S816.7

A

1006-267X(2017)04-1446-09