益生菌大腸桿菌Nissle 1917抗逆性能、豬腸上皮細(xì)胞黏附率及抑菌效果研究

李金龍 鄧 歡 劉金艷 毛俊霞 王 瑤 唐志如

(西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，生物飼料與分子營(yíng)養(yǎng)室驗(yàn)室，重慶400715)

益生菌大腸桿菌Nissle 1917抗逆性能、豬腸上皮細(xì)胞黏附率及抑菌效果研究

李金龍 鄧 歡 劉金艷 毛俊霞 王 瑤 唐志如*

(西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，生物飼料與分子營(yíng)養(yǎng)室驗(yàn)室，重慶400715)

本試驗(yàn)旨在研究益生菌大腸桿菌Nissle 1917(EcN)抗逆性能、豬腸上皮細(xì)胞黏附率及抑菌效果。采用體外法對(duì)EcN進(jìn)行生長(zhǎng)曲線繪制和耐酸、耐膽鹽、耐熱性能的測(cè)定；以豬腸上皮細(xì)胞IPEC-J2細(xì)胞為體外細(xì)胞模型，考察了EcN對(duì)該細(xì)胞的黏附率以及對(duì)致病菌大腸桿菌K88的黏附抑制率；同時(shí)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了EcN對(duì)IPEC-J2細(xì)胞β-防御素-2和Toll樣受體4的水平的影響。結(jié)果表明：1)EcN對(duì)高酸、高膽鹽和高溫環(huán)境具有一定耐受能力。2)EcN對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的黏附作用以對(duì)數(shù)期最佳，黏附率達(dá)33.96%，顯著高于遲緩期、穩(wěn)定期和衰亡期(P<0.05)。3)EcN對(duì)致病菌大腸桿菌K88具有良好的抑制效果，黏附抑制率達(dá)87.84%。4)EcN還能上調(diào)IPEC-J2細(xì)胞β-防御素-2和Toll樣受體4水平。結(jié)果提示，益生菌EcN具有較好的抗逆性能，能夠良好地黏附豬腸上皮細(xì)胞，對(duì)致病菌大腸桿菌K88具有良好的抑制作用。

大腸桿菌Nissle 1917；豬腸上皮細(xì)胞；IPEC-J2細(xì)胞；黏附性能；抗逆性能；耐熱性能；抑菌效果

大腸桿菌Nissle 1917(EcN)(血清型為O6∶K5∶H1)是一株被德國(guó)醫(yī)生Alfred Nissle在一戰(zhàn)期間發(fā)現(xiàn)并分離得到的無(wú)致病性的革蘭氏陰性益生菌[1]。EcN的益生功能與其對(duì)腸道微生物的調(diào)控和腸道內(nèi)細(xì)胞因子引起免疫反應(yīng)存在關(guān)聯(lián)[2]。EcN通過(guò)調(diào)控抗菌肽的表達(dá)，增加免疫球蛋白A(IgA)和黏蛋白的分泌以及促進(jìn)抗炎癥免疫反應(yīng)[3]，在腸道中發(fā)揮重要的免疫功能。EcN也能通過(guò)上調(diào)緊密連接蛋白閉鎖小帶的表達(dá)以及促進(jìn)緊密連接蛋白上調(diào)和再分布[4-5]，對(duì)增強(qiáng)豬腸上皮細(xì)胞的緊密連接和提高黏膜屏障具有重要的作用?？诜﨓cN能顯著降低斷奶仔腹豬瀉率和競(jìng)爭(zhēng)性阻礙沙門氏菌入侵[6]，也能有效預(yù)防產(chǎn)毒素大腸桿菌的感染[7]。由此可見，EcN對(duì)提高動(dòng)物腸道免疫功能、保護(hù)腸道屏障具有重要的作用。益生菌在腸道內(nèi)存活并黏附于腸道上皮細(xì)胞表面，是其發(fā)揮益生作用的前提和基礎(chǔ)。因此，本試驗(yàn)旨在探明EcN的生長(zhǎng)特性，耐酸、耐膽鹽和耐熱的性能，對(duì)豬腸上皮細(xì)胞黏附性能，以及對(duì)致病菌的抑菌效果，為EcN在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考意義。

1 材料與方法

1.1 EcN生長(zhǎng)曲線的測(cè)定和菌液制備

EcN菌株購(gòu)自德國(guó)微生物菌種中心(編號(hào)為DSM 6601)。大腸桿菌K88菌株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察。采用比濁法繪制EcN和大腸桿菌K88生長(zhǎng)曲線，以培養(yǎng)時(shí)間(0～30 h)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的通過(guò)測(cè)定LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液的600 nm吸光度值(OD600 nm)， OD600 nm為縱坐標(biāo)繪出EcN的生長(zhǎng)曲線。采用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)EcN和大腸桿菌K88菌液，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)將菌液調(diào)整濃度約為1.0×108CFU/mL，用于體外抗逆性能、豬腸上皮細(xì)胞黏附性能和抑菌效果檢測(cè)。

1.2 IPEC-J2細(xì)胞的培養(yǎng)

豬空腸上皮細(xì)胞IPEC-J2細(xì)胞來(lái)自西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室的凍存細(xì)胞。將復(fù)蘇細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中，加入5 mL DMEM完全細(xì)胞培養(yǎng)液(含5%胎牛血清+1%雙抗)，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待貼壁率達(dá)85%時(shí)，胰酶消化，調(diào)整濃度約為2.0×105個(gè)/mL，置于六孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，生長(zhǎng)至單層后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 體外抗逆性能檢測(cè)

1.3.1 耐酸和耐膽鹽

取等體積EcN菌液分別置于pH 1.5、2.0和2.5的模擬胃液中，以pH 7.0模擬胃液為對(duì)照。再取等體積EcN菌液分別置于豬膽鹽濃度為0、0.30%、0.60%和0.90%的LB液體培養(yǎng)基中，每組3個(gè)重復(fù)。胃酸組和膽鹽組置于37 ℃ 200 r/min恒溫振蕩器中分別培養(yǎng)3和24 h。處理后與處理前細(xì)菌總數(shù)比值的百分?jǐn)?shù)為EcN存活率。

1.3.2 耐熱

取4份9 mL滅菌生理鹽水于試管中并預(yù)熱至80 ℃，再分別加入1 mL菌液，保溫30、40、50和60 s后，迅速冷卻，對(duì)不同保溫時(shí)間組菌液按10倍梯度進(jìn)行稀釋，吸取100 μL最佳稀釋濃度菌液均勻涂抹于LB固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后菌落計(jì)數(shù)，每組2個(gè)重復(fù)。調(diào)節(jié)水溫至70、65 ℃，重復(fù)上述試驗(yàn)，用1.3.1中的計(jì)算方法計(jì)算EcN存活率。

1.4 IPEC-J2細(xì)胞黏附和抑菌試驗(yàn)

試驗(yàn)組取2 mL DMEM不完全細(xì)胞培養(yǎng)液(不含雙抗)和1 mL各時(shí)期(遲緩、對(duì)數(shù)、平穩(wěn)和衰亡期)EcN菌液加入IPEC-J2細(xì)胞，以等體積無(wú)菌PBS替代EcN菌液作為對(duì)照組，每組重復(fù)3孔，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)2 h后，PBS漂洗5次，自然晾干，甲醇固定20 min，革蘭氏染色，油鏡下隨機(jī)選取25個(gè)視野，拍照和計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞上黏附的EcN菌數(shù)，細(xì)胞黏附細(xì)菌數(shù)與加入細(xì)菌總數(shù)比值的百分?jǐn)?shù)為EcN黏附率。

試驗(yàn)組取EcN菌液500 μL與IPEC-J2細(xì)胞預(yù)先培養(yǎng)2 h后，再加入大腸桿菌K88菌液500 μL和1 mL DMEM不完全細(xì)胞培養(yǎng)液，以未加EcN的大腸桿菌K88菌液作為對(duì)照組。37 ℃ 5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，PBS漂洗5次，裂解細(xì)胞并10倍梯度稀釋裂解液，再均勻涂抹于選擇性培養(yǎng)基紫紅膽汁瓊脂(VRBA)上，平板計(jì)數(shù)。每組重復(fù)4孔，取平均值。按以下公式計(jì)算EcN對(duì)致病菌的黏附抑制率：

黏附抑制率(%)=100×(對(duì)照組-

試驗(yàn)組)/對(duì)照組。

取100 μL大腸桿菌K88菌液均勻涂抹于瓊脂培養(yǎng)基上，于無(wú)菌超凈臺(tái)上室溫晾干，再用牛津杯(直徑為8 mm)進(jìn)行打孔。取200 μL EcN菌液置于瓊脂板上孔中，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑，做3個(gè)重復(fù)，取平均值判定抑菌效果。

1.5 β-防御素-2和Toll樣受體水平的檢測(cè)

試驗(yàn)分為4組，試驗(yàn)組分別取1 mL EcN(EcN組)、大腸桿菌K88(大腸桿菌K88組)及EcN+大腸桿菌K88混合液(體積比1∶1，EcN+大腸桿菌K88組)置于IPEC-J2細(xì)胞已長(zhǎng)至單層的六孔培養(yǎng)板中，另以等體積PBS作為對(duì)照組，再加入2 mL DMEM不完全細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)3 h后，PBS漂洗5次，胰酶消化后轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管內(nèi)，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，棄上清，再漂洗、離心棄上清，然后加入1 mL蛋白質(zhì)裂解液，離心10 min取上清，采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測(cè)β-防御素-2和Toll樣受體水平。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SAS 9.1.3軟件的GLM程序進(jìn)行單因素方差分析，組間顯著性分析采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 EcN生長(zhǎng)曲線

EcN生長(zhǎng)曲線如圖1所示。接種4 h后呈快速上升趨勢(shì)，顯示其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段，培養(yǎng)10 h后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，18 h后逐漸出現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，24 h后此趨勢(shì)較明顯，逐漸進(jìn)入衰亡階段。

2.2 EcN體外抗逆性能

EcN耐酸試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。隨模擬胃液pH的降低，EcN存活率顯著下降(P<0.05)。當(dāng)pH為2.5時(shí)，EcN存活率為30.26%，較對(duì)照組減少51.58%。pH為2.0和1.5時(shí)，EcN存活率分別為17.69%、10.44%，強(qiáng)酸性環(huán)境抑制EcN的生長(zhǎng)。

圖1 EcN菌株生長(zhǎng)曲線

EcN耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。對(duì)照組存活率為84.95%，隨膽鹽濃度增加，EcN存活率顯著下降(P<0.05)。膽鹽濃度為0.30%時(shí)，其存活率迅速下降至27.34%。當(dāng)膽鹽濃度從0.30%增加至0.90%時(shí)，存活率下降趨勢(shì)較平緩。而膽鹽濃度在0.60%和0.90%時(shí)，EcN存活率分別為21.03%、15.21%。高膽鹽環(huán)境會(huì)抑制EcN的生長(zhǎng)。

EcN溫度耐受試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。隨水浴溫度升高和保持時(shí)間增加，EcN存活率逐漸降低。不同溫度保持30、40、50和60 s，在80 ℃時(shí)EcN存活率分別為15.86%、11.01%、5.29%和2.20%，除50和60 s差異不顯著(P>0.05)外,其余時(shí)間點(diǎn)差異顯著；在70 ℃時(shí)EcN存活率分別為59.03%、49.78%、43.61%和30.40%，各時(shí)間點(diǎn)差異顯著(P<0.05)；在65 ℃時(shí)EcN存活率分別為80.18%、73.57%、60.79%和49.34%，各時(shí)間點(diǎn)差異顯著(P<0.05)，存活率高于70和80 ℃。

表1 EcN耐酸試驗(yàn)結(jié)果

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表2和表3同。

Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as Table 2 and Table 3.

表2 EcN耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果

2.3 EcN對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的黏附作用

以測(cè)定的EcN生長(zhǎng)曲線作參考，選用培養(yǎng)2、8、16和26 h的EcN，分別代表其遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個(gè)生長(zhǎng)階段，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

EcN對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的黏附作用結(jié)果如圖3和表3所示。不同生長(zhǎng)階段的EcN對(duì)IPEC-J2細(xì)胞黏附率差異顯著(P<0.05)。以對(duì)數(shù)期EcN的黏附性能最佳，其每100個(gè)細(xì)胞黏附細(xì)菌數(shù)為3 056個(gè)，黏附率達(dá)33.96%；其次是穩(wěn)定期，每100個(gè)細(xì)胞黏附細(xì)菌數(shù)為2 043個(gè)，黏附率達(dá)22.70%；遲緩期和衰亡期的黏附性能分別居于第3和第4，每100個(gè)細(xì)胞黏附細(xì)菌數(shù)分別為1 174、661個(gè)，黏附率分別達(dá)13.04%、7.34%。

2.4 EcN對(duì)大腸桿菌K88的抑制作用

EcN對(duì)大腸桿菌K88的黏附抑制試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。EcN對(duì)大腸桿菌K88的黏附抑制率達(dá)到87.84%。抑菌試驗(yàn)測(cè)得抑菌圈直徑為4.73 mm。結(jié)果表明，EcN對(duì)大腸桿菌K88具有良好的抑制效果。

同折線數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Values of the same curve with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

圖2 EcN溫度耐受試驗(yàn)結(jié)果

Fig.2 Test results of temperature tolerance of EcN

2.5 EcN對(duì)IPEC-J2細(xì)胞 β-防御素-2和Toll樣受體4水平的影響

EcN對(duì)IPEC-J2細(xì)胞 β-防御素-2和Toll樣受體4水平的影響如圖4所示。對(duì)照組β-防御素-2水平顯著低于EcN組和EcN+大腸桿菌K88組(P<0.05)，而與大腸桿菌K88組差異不顯著(P>0.05)，對(duì)照組Toll樣受體4水平顯著低于其他3組(P<0.05)。EcN組的β-防御素-2和Toll樣受體4水平低于EcN+大腸桿菌K88組，但差異不顯著(P>0.05)。此外，大腸桿菌K88組β-防御素-2和Toll樣受體4水平略低于EcN組和EcN+大腸桿菌K88組，但差異均不顯著(P>0.05)。

A：對(duì)照 control；B：2 h；C：8 h；D：16 h；E：26 h。

表4 EcN對(duì)大腸桿菌K88的黏附抑制試驗(yàn)結(jié)果

“+”代表抑菌圈直徑在0～3 mm；“++”代表抑菌圈直徑在3～6 mm。

“+” means antibacterial diameter in 0 to 3 mm; “++” means antibacterial diameter in 3 to 6 mm.

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Data columns with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

圖4 EcN對(duì)IPEC-J2細(xì)胞β-防御素-2和Toll樣受體4水平的影響

Fig.4 Effects of EcN on β-defensins-2 and TLR-4 levels of IPEC-J2 cells

3 討 論

3.1 EcN的體外抗逆性能

研究表明，EcN擁有6種獨(dú)特的鐵攝取系統(tǒng)能產(chǎn)生鐵螯合劑[腸菌素(enterobactin)、沙門菌螯鐵蛋白(salmochelin)、耶爾森桿菌素(yersiniabactin)、產(chǎn)氣菌素(aerobactin)、枸櫞酸鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(ferric dicitrate transport system)和楚血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)位點(diǎn)(the chu heme transport locus)]，攝取環(huán)境中的鐵離子(Fe3+)，用于代謝時(shí)能量的產(chǎn)生。而中性偏酸性條件更有利于EcN鐵攝取系統(tǒng)產(chǎn)生4種鐵螯合劑(enterobactin、salmochelin、aerobactin和yersiniabactin)[8]。由此推測(cè)，中性偏酸性環(huán)境更適宜EcN生存。雖然本試驗(yàn)EcN存活率隨模擬胃液pH的降低而降低，但仍保持一定的存活，可見EcN對(duì)胃酸環(huán)境具有一定的耐受能力。豬胃內(nèi)pH一般在2.0～3.5，飼糧變化會(huì)使胃酸pH在1.5～5.0波動(dòng)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，在pH 2.5的模擬胃液中EcN也能存活，提示其能通過(guò)胃酸環(huán)境，進(jìn)入腸道發(fā)揮益生作用。EcN除需要耐受胃酸環(huán)境外，還應(yīng)耐受腸道中膽鹽形成的高滲透壓環(huán)境。豬腸道內(nèi)膽鹽含量一般在0.03%～0.50%內(nèi)波動(dòng)，而本試驗(yàn)顯示高膽鹽濃度(0.90%)環(huán)境下的EcN也依然能存活，可見EcN對(duì)腸道中的膽鹽環(huán)境也具有一定的耐受能力。此外，EcN在高溫環(huán)境中也能保持存活，表明其對(duì)溫度具有一定的耐受能力。關(guān)于益生菌耐酸、耐膽鹽、耐熱性能的具體機(jī)制，Hatice等[9]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌能產(chǎn)生胞外多糖，能耐受較低的pH和高膽鹽環(huán)境，Turpin等[10]從分子水平發(fā)現(xiàn)益生菌乳酸片球菌(P.acidilactici)存在多種與耐酸、耐膽鹽、耐熱相關(guān)基因，如熱休克蛋白(groEL)基因、D-丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(dltD)基因、clpL(一種ATP酶)基因和膽汁酸水解酶(bsh)基因等。因此，關(guān)于益生菌EcN耐受強(qiáng)酸高膽鹽高溫環(huán)境是否也存在上述相關(guān)或者其他潛在機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

3.2 EcN的黏附性能和抑菌性能

本試驗(yàn)對(duì)比研究了4個(gè)時(shí)期的EcN對(duì)IPEC-J2細(xì)胞黏附能力的大小，其黏附效果以對(duì)數(shù)期最佳。熊濤等[11]發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞黏附羅伊氏乳桿菌數(shù)隨菌齡增大呈先增后減的趨勢(shì)。這提示EcN能良好地黏附于IPEC-J2細(xì)胞表面可能與其生長(zhǎng)階段存在關(guān)聯(lián)。菌毛是細(xì)菌附著于動(dòng)物消化道黏膜上皮細(xì)胞表面的重要結(jié)構(gòu)，EcN自身基因組編碼的F1A、F1C和卷曲菌毛能幫助其定植于IPEC-J2細(xì)胞上，并形成生物被膜抵御致病菌入侵。若缺乏F1C菌毛和鞭毛的表達(dá)，則會(huì)降低黏附性能和削弱對(duì)沙門氏菌入侵的抑制作用[12]。也有文獻(xiàn)報(bào)道，EcN通過(guò)F1C菌毛調(diào)控對(duì)細(xì)胞的黏附作用以及對(duì)致病菌的抑菌作用。EcN誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞分泌β-防御素-2和促進(jìn)T細(xì)胞中Toll樣受體4的表達(dá)，對(duì)抑制病原菌入侵和減輕腸道炎癥具有重要作用，同時(shí)EcN誘導(dǎo)β-防御素-2的分泌可能與鞭毛存在關(guān)聯(lián)；若EcN缺失編碼F1C菌毛和鞭毛基因，黏附率分別降低99.9%和50.0%，同時(shí)降低抑菌能力[13]。此外，EcN在IPEC-J2細(xì)胞上黏附和生長(zhǎng)期間會(huì)形成鞭毛，其鞭毛長(zhǎng)度和數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加[14]。由此可見，EcN良好地黏附于細(xì)胞表面發(fā)揮益生作用，F(xiàn)1C菌毛和鞭毛起著重要的作用。本試驗(yàn)關(guān)于EcN誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞對(duì)β-防御素-2和Toll樣受體4的表達(dá)以及黏附作用機(jī)理只作了初步探究，而更深層次的黏附性能和抗菌機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)中，用大腸桿菌K88感染預(yù)先與EcN培養(yǎng)一段時(shí)間的IPEC-J2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)EcN對(duì)大腸桿菌K88黏附抑制率達(dá)87.84%。Boudeau等[15]先將IPEC-J2細(xì)胞與EcN預(yù)先培養(yǎng)一段時(shí)間后再加入致病性大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)和直接將2種菌同時(shí)加入IPEC-J2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)比研究EcN對(duì)致病性大腸桿菌的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者的抑制率為97.2%～99.9%，后者為78.0%～99.9%。Klete等[16]和Malchow等[17]也報(bào)道了預(yù)先將EcN與IPEC-J2細(xì)胞培養(yǎng)，能降低致病性大腸桿菌對(duì)細(xì)胞的感染機(jī)率，并影響致病菌對(duì)細(xì)胞的黏附和侵襲能力，而將EcN與沙門氏菌同時(shí)加入時(shí)，僅減少沙門氏菌入侵率為70%[18]。推測(cè)EcN對(duì)細(xì)胞的黏附作用以及其生理功能的發(fā)揮可能存在時(shí)間效應(yīng)。研究表明，增加EcN與細(xì)胞的預(yù)先培養(yǎng)時(shí)間有利于抑制病原菌的入侵，同時(shí)提高EcN的劑量，抑制效果更好[12]。EcN預(yù)先培養(yǎng)和較高劑量使用也有利于提高腸道黏蛋白mRNA的表達(dá)水平[19]。綜上研究，EcN制劑在生產(chǎn)實(shí)踐中盡早并高劑量使用，可能會(huì)更好的發(fā)揮益生作用。

本試驗(yàn)只對(duì)EcN相關(guān)機(jī)理只作了初步的探索，關(guān)于EcN黏附機(jī)理和對(duì)致病菌黏附抑制作用以及抗逆性能的研究，還需要從分子水平進(jìn)行更深入的探索。

4 結(jié) 論

① EcN對(duì)豬腸上皮細(xì)胞黏附效果以對(duì)數(shù)期最佳，并對(duì)致病菌大腸桿菌K88存在較強(qiáng)的抑制作用。

② EcN面對(duì)高酸、高膽鹽環(huán)境也呈現(xiàn)一定的抗逆性能，有利于其在胃腸道內(nèi)發(fā)揮生理作用。

[1] JACOBI C A,MALFERTHEINER P.EscherichiacoliNissle 1917 (Mutaflor):new insights into an old probiotic bacterium[J].Digestive Diseases,2011,29(6):600-607.

[2] VAARALA O.Immunological effects of probiotics with special reference to Lactobacilli[J].Clinical & Experimental Allergy,2003,33(12):1634-1640.

[3] TREBICHAVSKY I,SPLICHAL I,RADA V,et al.Modulation of natural immunity in the gut byEscherichiacolistrainNissle 1917[J].Nutrition Reviews,2010,68(8):459-464.

[4] UKENA S N,SINGH A,DRINGENBERG U,et al.ProbioticEscherichiacoliNissle 1917 inhibits leaky gut by enhancing mucosal integrity[J].PLoS One,2007,2(12):e1308.

[5] HERING N A,RICHTER J F,FROMM A,et al.TcpC protein fromE.coliNissle improves epithelial barrier function involving PKCζ and ERK1/2 signaling in HT-29/B6 cells[J].Mucosal Immunology,2014,7(2):369-378.

[6] SPLICHALOVA A,TREBICHAVSKY I,RADA V,et al.Interference ofBifidobacteriumchoerinumorEscherichiacoliNissle 1917 withSalmonellaTyphimurium in gnotobiotic piglets correlates with cytokine patterns in blood and intestine[J].Clinical & Experiment Immunology,2011,163(2):242-249.

[7] SCHROEDER B,DUNCKER S,BARTH S,et al.Preventive effects of the probioticEscherichiacolistrain Nissle 1917 on acute secretory diarrhea in a pig model of intestinal infection[J].Digestive Diseases and Sciences,2006,51(4):724-731.

[8] VALDEBENITO M,CRUMBLISS A L,WINKELMANN G,et al.Environmental factors influence the production of enterobactin,salmochelin,aerobactin,and yersiniabactin inEscherichiacolistrain Nissle 1917[J].International Journal of Medical Microbiology,2006,296(8):513-520.

[9] HATICE B,BELMA A,GULCIN A.The role of resistance to bile salts and acid tolerance of exopolysaccharides (EPSS) produced by yogurt starter bacteria[J].Archives of Biological Sciences,2010,62(2):323-328.

[10] TURPIN W,HUMBLOT C,GUYOT J P.Genetic screening of functional properties ofLacticacidbacteriain a fermented pearl millet slurry and in the metagenome of fermented starchy foods[J].Applied and Environmental Microbiology,2011,77(24):8722-8734.

[11] 熊濤,鄧耀軍,黃濤,等.羅伊氏乳桿菌NCU801對(duì)病原菌的粘附抑制性能[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)，2015,39(2):179-183.

[12] SCHIERACK P,KLETA S,TEDIN K,et al.E.coliNissle 1917 affectsSalmonellaadhesion to porcine intestinal epithelial cells[J].PLoS One,2011,6(2):e14712.

[13] SEO E J,WEIBEL S,WEHKAMP J,et al.Construction of recombinantE.coliNissle 1917 (EcN) strains for the expression and secretion of defensins[J].International Journal of Medical Microbiology,2012,302(6):276-287.

[14] KLETA S,NORDHOFF M,TEDIN K,et al.Role of F1C fimbriae,flagella,and secreted bacterial components in the inhibitory effect of probioticEscherichiacoliNissle 1917 on atypical enteropathogenic E. coli infection[J].Infection and Immunity,2014,82(5):1801-1812.

[15] BOUDEAU J,GLASSER A L,JULIEN S,et al.Inhibitory effect of probioticEscherichiacolistrain Nissle 1917 on adhesion to and invasion of intestinal epithelial cells by adherent-invasiveE.colistrains isolated from patients with Crohn’s disease[J].Alimentary Pharmacology and Therapeutics,2003,18(1):45-56.

[16] KLETA S,STEINRüCK H,BREVES G,et al.Detection and distribution of probioticEscherichiacoliNissle 1917 clones in swine herds in Germany[J].Journal of Applied Microbiology,2006,101(6):1357-1366.

[17] MALCHOW H A.Crohn’s disease andEscherichiacoli:a new approach in therapy to maintain remission of colonic Crohn’s disease?[J].Journal of Clinical Gastroenterology,1997,25(4):653-658.

[18] ALTENHOEFER A,OSWALD S,SONNENBORN U,et al.The probioticEscherichiacolistrain Nissle 1917 interferes with invasion of human intestinal epithelial cells by different enteroinvasive bacterial pathogens[J].FEMS Immunology & Medical Microbiology,2004,40(3):223-229.

[19] HAFEZ M M.Upregulation of intestinal mucin expression by the probiotic bacteriumE.coliNissle 1917[J].Probiotics and Antimicrobial Proteins,2012,4(2):67-77.

*Corresponding author, associate professor, E-mail： tangzhiru2326@sina.com

(責(zé)任編輯 王智航)

ProbioticsEscherichiacoliNissle 1917: Stress Resistance, Swine Intestinal Epithelial Cell Adhesion Rate and Antimicrobial Effects

LI Jinlong DENG Huan LIU Jinyan MAO Junxia WANG Yao TANG Zhiru*

(KeyLaboratoryforBio-FeedandAnimalNutrition,CollegeofAnimalScienceandTechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China)

This experiment was conducted to investigate stress resistance, swine intestinal epithelial cell adhesion rate and antimicrobial effects of probioticsEscherichiacoliNissle 1917 (EcN). The growth curve, acid, bile salt and heat tolerance were analyzed usinginvitromethods; IPEC-J2 cells of swine intestinal epithelial cells were selected as theinvitrocell model to investigate the effects of EcN on adhesion rate and inhibition rate of adhesion to an pathogenic bacteriumEscherichiacoliK88; meanwhile, the effects of EcN on levels of β-defensin-2 and toll-like receptor 4 of IPEC-J2 cells were identified by Western blot. The results showed as follows: 1) EcN could survive in strong acid, high concentration of bile salt and high temperature. 2) EcN in logarithmic phase had the highest intestinal epithelial cell adhesion effect and its adhesion rate was 33.96%, which was significantly higher than that in retardation phase, stationary phase and decline phase (P<0.05). 3) EcN had good inhibitory effect on pathogenic bacteriumEscherichiacoliK88 and its inhibition rate of adhesion was 87.84%. 4) EcN could up-regulate the levels of β-defensins-2 and toll-ike receptor 4. In conclusion, the probiotics EcN presents stress resistance, has great swine intestinal epithelial cells adhesion capacity, and prevents attack from pathogenic bacteriaEscherichiacoliK88.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(4)：1241-1247]

EscherichiacoliNissle 1917; swine intestinal epithelial cell; IPEC-J2 cell; adhesion property; stress resistance; heat tolerance; antimicrobial effects

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.04.020

2016-10-09

重慶市自然科學(xué)基金(cstc2016jcyjA1414)；西南大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(XDJK2015D005)；國(guó)家973重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013CB127303)；國(guó)家948項(xiàng)目(2015Z74)

李金龍(1992—)，男，重慶人，碩士研究生，從事分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)與生物飼料資源開發(fā)利用研究。E-mail: 812453072@qq.com

*通信作者:唐志如，副研究員，E-mail： tangzhiru2326@sina.com

S816.7

A

1006-267X(2017)04-1241-07