I-Ad/IgG2b Fc二聚體融合蛋白的構建表達及鑒定①

羅智環(huán) 錢 航 徐成偉 閔新文 陳 俊

(湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院，十堰442008)

I-Ad/IgG2b Fc二聚體融合蛋白的構建表達及鑒定①

羅智環(huán) 錢 航 徐成偉 閔新文②陳 ?、?/p>

(湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院，十堰442008)

目的：構建I-Ad/IgG2b Fc桿狀病毒表達載體，使其在Sf9昆蟲細胞內表達。方法：利用RT-PCR從BALB/c小鼠淋巴細胞中擴增出I-Adα、I-Adβ和IgG2b Fc目的基因序列，運用重疊PCR將I-Adα和I-Adβ分別與Fos和Jun的亮氨酸拉鏈序列相連，形成I-Adα-Fos和I-Adβ-Jun；利用酶切位點XbaⅠ將I-Adα-Fos與IgG2b Fc段相連，形成I-Adα-Fos-IgG2b Fc重組序列；分別將I-Adα-Fos-IgG2b Fc和I-Adβ-Jun插入桿狀病毒表達載體pFastBacTMDual的PPH和PP10兩個啟動子的下游，構建出重組載體pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc]；采用PCR及限制性內切酶對所構建的載體進行鑒定并測序；將pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc]轉入DH10Bac感受態(tài)，使其在轉座子的作用下形成重組桿粒病毒Bacmid+[I-Ad/IgG2b Fc]，利用脂質體轉染試劑將重組表達載體轉染至Sf9昆蟲細胞，P4后大量感染Sf9昆蟲細胞，收集上清通過PEG20000濃縮可得到I-Ad/IgG2b Fc二聚體融合蛋白，通過雙抗體夾心ELISA及Western blot對表達的蛋白進行檢測。結果：PCR及酶切鑒定以及測序結果證實所構建的pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc]重組載體具有正確的序列；雙抗體夾心 ELISA和Western blot結果表明重組桿粒能成功感染Sf9昆蟲細胞，并且表達的融合蛋白具有正確構象。結論：成功構建pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc]桿狀病毒表達載體，并在Sf9昆蟲細胞中表達，為研究I-Ad限制性的T細胞奠定了基礎。

I-Ad；二聚體；昆蟲細胞；桿狀病毒表達載體

抗原肽/MHC 復合物(Peptide/major histocom-patibility complex,pMHC)是T細胞抗原受體(T-cell receptor,TCR)識別的配體，在抗原加工、處理、提呈以及T細胞活化過程中發(fā)揮重要的作用。主要組織相容性Ⅱ類抗原(MHC class Ⅱ)是一組具有高度多態(tài)性的、由兩條跨膜的肽鏈所組成的膜蛋白，其α鏈(35 kD)和β鏈(28 kD)非共價連接形成異源二聚體。MHCⅡ類分子通過pMHC形式與CD4+T 細胞的TCR結合，從而誘導特異性的細胞免疫反應的產生。小鼠的MHC抗原為H-2(Histocompatibility antigen-2,H-2)，H-2 Ⅱ類分子主要包括I-A和I-E兩個亞區(qū)。本研究構建并表達了I-Ad/IgG2b Fc二聚體，為研究抗原肽/I-Ad特異性的T細胞應答提供了有力的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株與細胞系 pFastBacTMDual質粒購自美國Invitrogen公司(10712024);DH10bac(CC2801)和DH5α(CC0203)購自上海超研生物;Sf9細胞購自武漢大學典藏中心。

1.1.2 試劑 所有PCR引物及全基因合成均由上海生工完成；總RNA提取、逆轉錄酶、dNTP、轉染試劑脂質體等購自美國Invitrogen公司；pfu DNA酶、限制性內切酶、T4連接酶、DNA Marker均購自Fermentas公司；膠回收試劑盒、DNA分子量Marker、質粒提取試劑盒(北京天根)；Grace′s完全培養(yǎng)基、Grace′s不完全培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(四季青)；氨芐青霉素、X-gal、IPTG、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素。

1.2 方法

1.2.1 重組載體的構建 分離BALB/c小鼠脾臟淋巴細胞，應用Trizol試劑提取總RNA，經(jīng)逆轉錄PCR得到cDNA，作為后續(xù)擴增I-Adα、I-Adβ和IgG2b Fc以及亮氨酸拉鏈Fos和Jun序列的模板。參照文獻[1]，利用表1中的引物及擴增條件，分別擴增出目的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物后回收純化目的片段，再利用重疊PCR(Overlapping PCR)的方法將I-Adα和I-Adβ分別與Fos和Jun的亮氨酸拉鏈序列相連；在I-Ad和Fos及Jun的中間加入序列中含SalⅠ酶切位點的柔性Linker(VDGGGGG)，即I-Ad和Fos及Jun通過Sal Ⅰ酶切位點連接，分別形成I-Adα-Fos和I-Adβ-Jun；利用酶切位點Xba Ⅰ將I-Adα-Fos與IgG2b Fc段相連，形成I-Adα-Fos-IgG2b Fc重組序列；將I-Adα-Fos-IgG2b Fc和I-Adβ-Jun插入pFastBacTMDual的 PPH和PP10兩個啟動子的下游，轉化DH5α感受態(tài)細胞后挑取陽性克隆，用質粒提取試劑盒提取質粒后經(jīng)PCR及酶切鑒定正確，再進行雙向測序鑒定(由上海生工完成)，最終形成一個PPH方向含I-Adα-Fos-Fc序列，PP10方向含I-Adβ-Jun序列的pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc]質粒(圖1A)。將鑒定正確的pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc]質粒轉化DH10 BacTM感受態(tài)細胞后挑取陽性克隆，按照Bac to Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)說明書提取含I-Ad/IgG2b Fc的穿梭質粒Bacmid(138 kb)，經(jīng)PCR鑒定后測序。

1.2.2 重組載體的鑒定 對pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc]質粒進行酶切鑒定，根據(jù)所使用的酶切位點，主要對I-Adα、I-Adβ和IgG2b Fc分別用BamHⅠ和SalⅠ、XhoⅠ和SalⅠ以及XbaⅠ和Hind Ⅲ進行酶切鑒定，所使用酶切條件以試劑公司提供的條件為準；同時利用菌液PCR對I-Adα、I-Adβ和

表1 各目的基因所用引物

Tab.1 Primers used for amplification of each targeted gene

PrimersSequenceofeachprimer(5′?3′)DescriptionoflineationProduct(bp)I?Adα?FGCGCGGATCCATGCCGTGCAGCAGABamHⅠsite802I?Adα?RCCCACCTCCTCCGCCGTCGACTCATAAAGGCCCTGGVDGGGGGlinkerAdβ?FGCGCCTCGAGATGGCTCTGCAGATCXhoⅠsite823I?Adβ?RCCCACCTCCTCCGCCGTCGACTCACTGCAGGAGCCCVDGGGGGlinkerIgG2bFc?FGCGCTCTAGAAGCCCAGCGGGCCCAXbaⅠsite739IgG2bFc?RGCGCAAGCTTTCATTTACCCGGAGAHindⅢsiteFos?FGTCGACGGCGGAGGAGGTGGGCTGACTGATACACTCCVDGGGGGlinker151Fos?RGCGCTCTAGAGTGAGCTGCCAGGATGAACXbaⅠsiteJun?FGTCGACGGCGGAGGAGGTGGGAGAATCGCCCGGCTGGVDGGGGGlinker151Jun?RGCGCGCTAGCTCAGTGGTTCATGACTTTCTNheⅠsite

IgG2b Fc片段進行鑒定；經(jīng)酶切和菌液PCR 鑒定正確的質粒送上海生工進行雙向測序鑒定，測序結果與Genbank中檢索到的各目的序列進行比對。

1.2.3 融合蛋白的表達、濃縮及檢測 用含4%～8%胎牛血清的Grace′s培養(yǎng)液，在27℃無CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Sf9昆蟲細胞，待細胞處于對數(shù)生長期時，用重組桿粒Bacmid+[I-Ad/IgG2b Fc]和Cellfection脂質體轉染試劑按照說明書進行轉染，待Sf9昆蟲細胞形態(tài)由梭形變?yōu)閳A形，且胞內顆粒增多、直徑變大時，收集含有攜帶I-Ad/IgG2b Fc基因的病毒，再對此病毒進行擴增，待擴增到P4時大量感染Sf9昆蟲細胞，5～6 d后收集上清，即得到大量含有I-Ad/IgG2b Fc融合蛋白上清(圖1B)；將收集的上清置于透析袋中，用PEG20000進行濃縮，隨后利用ELISA和Western blot對濃縮產物進行檢測。

2 結果

2.1 目的基因片段的獲取 如圖2所示，通過RT-PCR擴增出小鼠I-Ad的胞外段基因I-Adα、I-Adβ以及IgG2b Fc段基因，并獲取亮氨酸拉鏈Fos和Jun序列，各目的片段大小均與預期理論值一致。

2.2 I-Ad重組載體PCR及酶切鑒定 對所構建的pFastBacTMDual +[I-Ad/IgG2b Fc]重組載體運用菌液PCR及酶切進行鑒定。菌液PCR結果如圖3A所示，I-Adα、I-Adβ和IgG2b Fc各片段大小與預期一致；分別用BamHⅠ和SalⅠ、XhoⅠ和SalⅠ以及XbaⅠ和HindⅢ對pFastBacTMDual +[I-Ad/IgG2b Fc]質粒進行酶切鑒定，酶切下來的小片段大小與預期一致，結果如圖3B所示。經(jīng)過菌液PCR和酶切鑒定正確的質粒送上海生工進行雙向測序鑒定，測序結果與Genbank中檢索到的各目的序列完全一致，且無突變。

圖1 I-Ad/IgG2b Fc表達載體結構圖及二聚體結構模擬圖Fig.1 Structure of pFastBacTMDual + [I-Ad/IgG2b Fc] plasmid and simulation structure of I-Ad dimerNote：A.The structure of pFastBacTMDual + [I-Ad/IgG2b Fc] plasmid;B.Simulation structure of I-Ad dimer.

2.3 融合蛋白的檢測及鑒定 M5/114 (M5/114.15.2)是一種可以識別MHCⅡ的單克隆抗體。用mAb M5/114與HRP標記的羊抗小鼠IgG 2b進行雙抗體夾心ELISA檢測，結果如圖 4所示，I-Ad桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞后，其培養(yǎng)上清的A492值與正常Sf9昆蟲細胞培養(yǎng)上清的A492值相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而陰性對照組與正常Sf9昆蟲細胞培養(yǎng)上清的A492值相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明I-Ad桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞所表達的I-Ad具有正確的天然構象，并且IgG2b的Fc段也正確表達；取濃縮后的二聚體蛋白，經(jīng)β-巰基乙醇還原處理后進行SDS變性聚丙烯凝膠電泳，用抗小鼠IgG Fc抗體可檢測到一條位于40 kD和60 kD之間的蛋白質條帶，與預期的大小(56 kD)相符(圖 5)。

圖2 目的基因片段的獲取Fig.2 Acquisition of target gene fragmentNote：M.DNA marker;1,2.Signal peptide and extracellular region fragment of I-Ad α and I-Ad β,respectively;3.IgG2b Fc fragment;4,5.Lucine zipper sequence of Fos and Jun,respectively.

圖3 重組載體菌液PCR及酶切鑒定Fig.3 PCR and enzyme digestion of recombinant bacteria carrierNote：M.DNA marker;1,2,3.I-Ad α，I-Ad β and IgG2b Fc fragment,respectively;4.pFastBacTMDual +[I-Ad/IgG2b Fc] plasmid;5.pFastBacTMDual +[I-Ad/IgG2b Fc] plasmid digested by BamHⅠ and SalⅠ (the length of the small fragment was 771 bp );6.pFastBacTMDual +[I-Ad/IgG2b Fc] plasmid digested by XhoⅠ and SalⅠ(the length of the small fragment was 792 bp );7.pFastBacTMDual +[I-Ad/IgG2b Fc] plasmid digested by Xba Ⅰ and Hind Ⅲ (the length of the small fragment was 719 bp).

圖4 ELISA檢測I-Ad Sf9細胞I-Ad/IgG2b Fc融合蛋白的表達Fig.4 I-Ad/IgG2b Fc fusion protein expression in I-Ad Sf9 cells detected by ELISANote：The plate was coated by 1 μg/ml Rat anti mouse I-Ad antibody M5/114,and goat anti mouse IgG2b antibody labeled by HRP(4 000×diluted) was used as the second antibody.

圖5 Western blot 檢測I-Ad/IgG2b Fc融合蛋白Fig.5 I-Ad/IgG2b Fc fusion protein expression in I-Ad Sf9 cells analyzed by Western blotNote：1.Protein marker;2.I-Ad dimer.

3 討論

小鼠的H-2復合體即主要組織相容性復合體，位于17號染色體上，是一組具有遺傳多態(tài)性的基因群。根據(jù)結構和功能可以分為三類，但通常所說的主要是與抗原提呈相關的Ⅰ類和Ⅱ類基因[2]。I-Ad是來源于BALB/c小鼠(H-2d)的MHCⅡ類分子，能將抗原肽提呈給CD4+T細胞(Th1和Th2)，在細胞免疫和體液中具有極為重要的作用。

單價可溶性的pMHC與TCR 之間的結合能力較低，且解離快、穩(wěn)定性差，限制了其在相應研究中的應用；多價pMHC分子可與特異性T細胞表面的多個TCR有效結合，且解離慢、穩(wěn)定性高[3,4]。MHC多聚體技術是根據(jù)T細胞活化的雙識別原理，利用生物工程技術將MHC單體在體外組裝成多聚體，應用于特異性T細胞檢測、分選、活化等研究中，是新疫苗設計、篩選及臨床評價的關鍵技術手段。該技術為腫瘤、自身免疫、移植排斥及病毒性疾病的臨床診斷試劑及生物治療新藥的開發(fā)提供了技術支持[5]。MHCⅡ類分子多聚體的制備方法很多，尚無一種統(tǒng)一的方法，但眾多方法基本上都是基于兩種模式，一是采用類似于MHCⅠ類分子多聚體的制備方法，利用基于生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)的方法[6-10]，其中MHCⅡ類分子的α鏈和β鏈可借助Fos-Jun亮氨酸拉鏈進行連接(9834080)，二是利用免疫球蛋白的結構，將MHCⅡ類分子的α鏈和β鏈分別連接到免疫球蛋白的輕鏈和重鏈[11]，或者借助Fos-Jun亮氨酸拉鏈將MHCⅡ類分子連接到Ig Fc段的鉸鏈區(qū)[12]。

本研究將I-Adα和I-Adβ分別與Fos和Jun的亮氨酸拉鏈序列相連，形成I-Adα-Fos和I-Adβ-Jun，二者可通過Fos和Jun的亮氨酸拉鏈結合，形成I-Ad分子；利用酶切位點Xba I將I-Adα-Fos與IgG2b Fc段相連，形成I-Adα-Fos-IgG2b Fc重組序列，兩個同源的I-Ad分子可通過IgG2b Fc段的二硫鍵結合形成二聚體，最終由Sf9昆蟲細胞表達出利用Fc連接的I-Ad二聚體。

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[收稿2016-11-25]

(編輯 張曉舟)

Construction,expression of I-Ad/IgG2b Fc dimer fusion protein and its identification

LUOZhi-Huan,QIANHang,XUCheng-Wei,MINXin-Wen,CHENJun.

DongfengHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442008,China

Objective:To construct I-Ad/IgG2b Fc baculovirus expression vector and express I-Ad/IgG2b Fc dimer fusion protein in Sf9 insect cells.Methods：I-Adα,I-Adβ and IgG2b Fc gene sequences were amplified from BALB/c mouse lymphocytes by RT-PCR.I-Adα and I-Adβ were connected with the leucine zipper sequence Fos and Jun respectively by overlapping PCR to form I-Adα-Fos and I-Adβ-Jun.I-Adα-Fos and IgG2b Fc fragments were ligated by restriction sites Xba I to form I-Adα-Fos-IgG2b Fc recombination sequence.I-Adα-Fos-IgG2b Fc and I-Adβ-Jun fragments were inserted to PPHand PP10,which were the downstream of the promoters in the plasmid pFastBacTMDual,to form pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc] recombinant plasmids.The constructed vector was identified by PCR,restriction endonuclease and sequencing.The recombinant plasmids pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc] was transferred into the DH10Bac competent cell to form recombinant baculovirus Bacmid+[I-Ad/IgG2b Fc].The recombinant baculovirus was transfected into Sf9 insect cells by liposome transfection reagent.After infected with Sf9 insect cells,the supernatant was collected and concentrated by PEG20000 to obtain I-Ad/IgG2b Fc dimer fusion protein.The fusion protein was detected by double-antibody sandwich ELISA and Western blot.Results：PCR，restriction enzyme digestion and sequencing confirmed that the recombinant vector pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc] had the correct sequence.The double antibody sandwich ELISA and Western blot showed that recombinant bacmid could successfully infect Sf9 insect cells,and the expressed fusion protein had the correct conformation.Conclusion：The pFastBacTMDual+[I-Ad/IgG2b Fc] baculovirus expression vector was successfully constructed and expressed in Sf9 insect cells,laying a foundation for the study of I-Ad-restricted T cells.

I-Ad;Dimer;Insect cell;Baculovirus expression vector

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.004

①本文受國家自然科學基金青年項目(81400288)和湖北省教育廳科學研究計劃(B2015495)資助。

羅智環(huán)(1991年-)，女，在讀碩士，主要從事心血管免疫的研究,E-mail：13451265001@163.com。

R392.1

A

1000-484X(2017)04-0498-05

②通訊作者，E-mail：minxinwen@163.com;E-mail：chenjun0121@126.com。