HCoV-OC43逃避人樹突狀細(xì)胞免疫清除機制的初步研究①

楊 權(quán) 庹玖玲 黃旭斌 羅洪嬌 周 凱 張 甜 曹開源 徐 霖

(廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣州511436)

·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

HCoV-OC43逃避人樹突狀細(xì)胞免疫清除機制的初步研究①

楊 權(quán) 庹玖玲②③黃旭斌④羅洪嬌②③周 凱②③張 甜②③曹開源②③徐 霖②③

(廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣州511436)

目的：了解人冠狀病毒OC43(Human coronavirus OC43，HCoV-OC43)逃避人樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)免疫監(jiān)視作用的初步機制。 方法：利用HCoV-OC43陽性病人的標(biāo)本感染BSC-1細(xì)胞分離OC43病毒，相差顯微鏡觀察細(xì)胞病變(Cytopathic effect,CPE)，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)進行鑒定；利用人細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4聯(lián)合體外誘導(dǎo)DC分化，于誘導(dǎo)7 d后用HCoV-OC43病毒感染DC。采用透射電鏡觀察DC感染后的形態(tài)，Real-time PCR檢測DC功能相關(guān)細(xì)胞因子的表達水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測DC比例及其功能相關(guān)共刺激分子的表達。結(jié)果：成功建立HCoV-OC43體外感染DC的體系。HCoV-OC43能感染DC并刺激其產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但培養(yǎng)上清中不能檢測到病毒核酸；HCoV-OC43感染會導(dǎo)致DC細(xì)胞表達IFN-α、IFN-β、CCL3和CCL5的量顯著下調(diào)，但其共刺激分子HLA-DR、CD1c和CD86的表達不受抑制。 結(jié)論：HCoV-OC43可感染人DC細(xì)胞并刺激其產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但不能產(chǎn)生活的子代病毒；HCoV-OC43可通過抑制宿主DC細(xì)胞IFN-α等相關(guān)炎癥因子和趨化因子的分泌，來實現(xiàn)免疫逃逸。

人冠狀病毒OC43；人樹突狀細(xì)胞；細(xì)胞因子；免疫逃逸

冠狀病毒(Coronavirus， CoV)是目前已知的基因組最大的RNA病毒， 1937年首次從雞身上分離得到，由于其病毒包膜上有形似皇冠的棘突而命名為冠狀病毒[1]。動物感染了冠狀病毒可引起一系列的疾病，包括支氣管炎、腸胃炎、腦炎、腹瀉、腹膜炎和呼吸道疾病等[2]。目前發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒(Human coronavirus，HCoV)主要有6個亞型：HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和MERS-CoV，其傳播分布于世界各地[1,3-5]。HCoV感染通常不會引起嚴(yán)重的疾病，但SARS-CoV和MERS-CoV的爆發(fā)[6-9]，提示高致病性CoV可傳播到人群當(dāng)中并對人類生命健康造成嚴(yán)重的威脅。目前對HCoV的致病性及機體抗病毒感染的研究較少，其機制尚未完全清楚。已有研究表明，病毒與宿主固有免疫細(xì)胞之間的相互作用是病毒致病的重要環(huán)節(jié)，對于病毒感染及免疫反應(yīng)至關(guān)重要。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)是體內(nèi)最重要的固有免疫細(xì)胞之一[10]，作為功能最強的專職性抗原提呈細(xì)胞，擔(dān)負(fù)著激發(fā)免疫應(yīng)答，聯(lián)結(jié)固有免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要功能，是產(chǎn)生抗病毒免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是抗病毒感染最重要的“哨兵”，能啟動天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗病毒免疫反應(yīng)[11]。病毒可通過多種機制來干擾DC的作用，從而實現(xiàn)免疫逃逸，包括抑制DC的發(fā)生發(fā)展、成熟以及功能等[12-14]。但是目前HCoV-OC43與宿主DC之間的相互作用少見報道。為此，本研究通過利用HCoV-OC43體外感染人DC細(xì)胞，檢測感染體系中CD11c+DC的比例、細(xì)胞因子表達量以及共刺激分子的表達情況，初步了解HCoV-OC43免疫逃逸的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HCoV-OC43陽性病人咽拭子標(biāo)本由十二五國家科技重大專項“傳染病監(jiān)測技術(shù)平臺”華南監(jiān)測實驗室提供；猴腎細(xì)胞系BSC-1由香港大學(xué)惠贈；健康人外周血由廣東省血液中心提供；MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自Hyclone公司；RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素、DEPC水和Trizol Reagent購自Invitrogen 公司； Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(密度1.077/ml)購自天津市灝洋生物制品科技有限公司；Hu-GM-CSF和Hu-IL-4購自PeproTech公司；LPS購自Sigma-Aldrich 公司；QIAamp? minElute? Virus Spin RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 購自Thermo公司；iQ Supper MIX購自BIO-RAD 公司；Premix Ex Taq? Version 2.0、pMD?18-T Vector和SYBR? Premix Ex TaqTM購自寶生物工程(大連)有限公司；抗人CD11c、CD1c、HLA-DR和CD86購自ebioscience公司；Mastercycler PCR儀和Mastercycler ep realplex 2購自Eppendorf公司；凝膠成像系統(tǒng)和電泳儀購自BIO-RAD 公司；細(xì)菌培養(yǎng)箱和CO2培養(yǎng)箱購自Thermo公司；倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司；10色分析型流式細(xì)胞儀購自Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 HCoV-OC43分離培養(yǎng) 取生長狀態(tài)好的BSC-1細(xì)胞，接種到6孔板中進行培養(yǎng)，接種密度約50%。待細(xì)胞長到70%～80%時進行病毒感染，感染MOI=0.1。用MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基補足感染標(biāo)本體積至200 μl，緩慢加入細(xì)胞表面，對照組加入200 μl MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后，加入2 ml的MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)病變細(xì)胞達80%左右時將細(xì)胞和上清一起收集，反復(fù)凍融3次制成病毒液，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 HCoV-OC43鑒定 取200 μl病毒液，用QIAamp?minElute?Virus Spin RNA提取試劑盒提取病毒RNA。取10 μl病毒RNA，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。隨后，利用Real-time PCR對HCoV-OC43進行鑒定，上游引物:5′-CGATGAGGCTATTCCG-ACTAGGT-3′；下游引物:5′-CCTTCCTGAGCCTTCAATATAGTAACC-3′；探針:FAM-TCCGCCTGGCACGGTACTCCCT-TAMAR。反應(yīng)體系為：10 μl 2×iQ Supper MIΧ，0.25 μmol/L引物和探針各0.5 μl，2 μl cDNA模板和6.5 μl DEPC水。反應(yīng)程序為：94℃ 5 min，94℃ 15 s，55℃ 1 min，第二步開始45個循環(huán)，第三步收集熒光。

1.2.3 病毒拷貝數(shù)計算標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 利用HCoV-OC43鑒定的上下游引物對其高度保守的NP基因進行擴增。擴增體系為：10 μl Premix Ex Taq，10 μmol/L上下游引物各1 μl，2 μl 病毒cDNA，6 μl DEPC水。擴增程序為：95℃ 5 min，95℃ 30 s，52℃ 40 s，72℃ 1 min，72℃ 10 min，第2～4步35個循環(huán)。擴增產(chǎn)物鑒定純化后進行轉(zhuǎn)化，挑取陽性菌落送至上海英駿公司進行測序。對測序通過的菌液進行質(zhì)粒抽提，以不同濃度的質(zhì)粒為模板進行Real-time PCR檢測。根據(jù)如下公式計算相應(yīng)濃度下質(zhì)粒的拷貝數(shù)：(6.02×1 023)×(ng/μl×10-9)/(DNA length×660)=copies/μl，根據(jù)拷貝數(shù)及相應(yīng)CT值讀數(shù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 人DC體外誘導(dǎo)分化 用人淋巴細(xì)胞分離液對健康人外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)進行分離，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進行。成功分離后，加入1 ml RPMI1640培養(yǎng)液重懸PBMC，計數(shù)。按細(xì)胞數(shù)量計算接種孔數(shù)，每孔接種4×106細(xì)胞，4 ml培養(yǎng)基；按比例加入各種培養(yǎng)因子，使終濃度為：10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗(鏈霉素和青霉素)、50 ng/ml Hu-GM-CSF和10 ng/ml Hu-IL-4；用RPMI1640 培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至1×106cells/ml，混勻，接種；每隔3 d更換新鮮培養(yǎng)液：吸棄3 ml舊培養(yǎng)液，加入3 ml含各種培養(yǎng)因子的新的完全培養(yǎng)液。

1.2.5 Real-time檢測細(xì)胞因子的表達 DC培養(yǎng)第7天，將2×106(MOI=0.5)HCoV-OC43顆粒均勻加入DC培養(yǎng)體系中，對照組加入同體積的病毒顆粒溶劑。分別收集HCoV-OC43感染人DC后6 h和24 h的細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清。利用Trizol Reagent提取細(xì)胞總RNA。取0.5 μg RNA，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Real-time PCR反應(yīng)檢測實驗組與對照組中與DC功能相關(guān)的細(xì)胞因子的表達，引物序列如表1所示。反應(yīng)體系如下：10 μl SYBR Green Mix，2 μmol/L上下游引物各2 μl，2 μl cDNA，4 μl DEPC水。反應(yīng)程序如下：95℃ 3 min，95℃ 10 s，60℃ 35 s，第二步開始40個循環(huán)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表型 DC培養(yǎng)第5天，加入LPS(1 μg/ml)刺激DC成熟。LPS加入后48 h，將2×106(MOI=0.5)HCoV-OC43顆粒均勻加入DC培養(yǎng)體系中，對照組加入同體積的病毒顆粒溶劑。共培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清；按說明書用量將適量抗體加入100 μl PBS中，混勻，加入細(xì)胞沉淀中，渦旋混勻，4℃ 避光孵育30 min；加入3 ml PBS緩沖液終止染色，2 000 r/min離心5 min，棄上清；向細(xì)胞沉淀中加入500 μl含2%多聚甲醛的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，渦旋混勻后用流式細(xì)胞儀進行檢測，讀取50 000個細(xì)胞，結(jié)果在CellQuest(Becton Dickinson,Mountain View,CA)軟件上進行分析。

1.2.7 電子顯微鏡觀察DC細(xì)胞 DC培養(yǎng)第7天，將2×106(MOI=0.5)HCoV-OC43顆粒均勻加入DC培養(yǎng)體系中，對照組加入同體積的病毒顆粒溶劑。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)上清，加入2 ml PBS緩沖液洗滌2次。向培養(yǎng)體系中加入原細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，吹打收集半懸浮細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，收集上清Real-time PCR檢測HCoV-OC43核酸，細(xì)胞沉淀經(jīng)2.5%戊二醛-鋨酸固定，送至中山醫(yī)學(xué)院電鏡室進行超薄切片和透射電鏡觀察。

表1 Real-time PCR 檢測細(xì)胞因子引物序列

Tab.1 Primers for Real-time PCR detection of cytokines

GeneForwardprimer(5′-3′)Reverseprimer(5′-3′)IL?1βTCCAGGGACAGGATATGGAGTCATCTTTCAACACGCAGGAIL?6ATGAGGAGACTTGCCTGGTGGGGTCAGGGGTGGTTATTGIL?8CAAACCTTTCCACCCCAAAGCCCTCTTCAAAAACTTCTCCIL?10GCTGAGAACCAAGACCCAGAGCATTCTTCACCTGCTCCACIL?12TCACAAAAGATAAAACCAGCACAGCACAGGGCCATCATAAAAGIFN?αCTCCTGGCACAGATGAGGAGATGGTTTCAGCCTTTTGGAIFN?βTCTCCTGTTGTGCTTCTCCAGATGTCAAAGTTCCTCCTGTCCTNFCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTCTTGATGGCAGAGAGGACCL?3TGCAACCAGTTCTCTGCATCTTTCTGGACCCACTCCTCACCCL?5ATCTGCCTCCCCATATTCCTACACACTTGGCGGTTCTTTCMIP?1αCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACTGTGGAATCTGCCGGGAGGTGTAGMCP?1CATTGTGGCCAAGGAGATCTGCTTCGGAGTTTGGGTTTGCTTIP?10CTGACTCTAAGTGGCATTTGATGGCCTTCGATTCTGβ?actinCCCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG

2 結(jié)果

2.1 HCoV-OC43分離培養(yǎng)和鑒定 HCoV-OC43陽性標(biāo)本接種靶細(xì)胞BSC-1后第6天，大部分細(xì)胞發(fā)生病變，出現(xiàn)CPE(圖1A)，與陰性對照組相比，接種病毒的細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓和細(xì)胞融合等現(xiàn)象，符合HCoV-OC43典型細(xì)胞病變的表現(xiàn)。通過構(gòu)建陽性質(zhì)粒(圖1B)，制作得到病毒拷貝數(shù)計算公式：Y=-0.986 2X+42.822(X：CT值讀數(shù)，Y：log2拷貝數(shù)/μl)。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，收集的病毒培養(yǎng)液CT值讀數(shù)為19.76，通過計算得出與陰性對照相比，實驗組培養(yǎng)體系中病毒拷貝數(shù)擴增了105倍，說明HCoV-OC43分離培養(yǎng)成功。

2.2 電子顯微鏡觀察HCoV-OC43感染后人DC形態(tài) 病毒感染24 h后收集細(xì)胞進行電子顯微鏡觀察，同時收集上清進行Real-time PCR檢測。結(jié)果表明(圖2)，與對照組相比，病毒感染組的DC細(xì)胞突觸變短變粗，并可觀察到胞漿內(nèi)形成的病毒顆粒與囊泡，表明OC43可被DC識別、攝取、加工和提呈。但培養(yǎng)上清中未能檢測到病毒核酸的存在，表明OC43雖可感染DC，但不能釋放出成熟的子代病毒。

2.3 HCoV-OC43感染抑制DC功能相關(guān)細(xì)胞因子表達 分別收集病毒感染6 h和24 h后的DC細(xì)胞，檢測與DC功能相關(guān)的細(xì)胞因子的表達。病毒感染初期，DC表達IFN-α的量顯著上升(P<0.01，圖3)，隨著感染時間的推移,IL-1β、IL-8及趨化因子IP-10的表達顯著增強(P<0.01，圖3)。但隨著時間的延長，Ⅰ型干擾素(IFN-α及IFN-β)和趨化因子CCL3和CCL5(P<0.01，圖3)的表達顯著下降。這些結(jié)果表明HCoV-OC43能快速刺激DC發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，但感染一段時間后，DC部分功能細(xì)胞因子的表達會受到顯著抑制。

圖1 HCoV-OC43分離培養(yǎng)CPE觀察和病毒拷貝數(shù)計算標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 CPE of BSC-1 cells inoculated with HCoV-OC43 and standard curve for calculation of HCoV-OC43 copiesNote：Isolation and CPE observation of HCoV-OC43 on BSC-1 cells.A and standard curve for calculation of OC43 copies B.

圖2 電子顯微鏡觀察HCoV-OC43感染的人樹突狀細(xì)胞Fig.2 Electron microscope observation of human DC infected by HCoV-OC43

圖3 Real-time PCR檢測OC43病毒感染6 h和24 h后DC功能相關(guān)細(xì)胞因子的表達Fig.3 Expression level analysis of DC function related cytokines after infected with OC43 virus for 6 h and 24 h using Real-time PCRNote：**.P<0.01 vs control group.

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測DC的比例及共刺激分子的表達Fig.4 Flow cytometry analysis of DC proportion and expression level of costimulatory molecules

2.4 HCoV-OC43感染不影響DC 共刺激分子的表達 DC培養(yǎng)第5天，加入LPS刺激其成熟，48 h后加入HCoV-OC43共培養(yǎng)。病毒感染72 h后，收集細(xì)胞進行流式細(xì)胞術(shù)檢測。結(jié)果表明我們的體系誘導(dǎo)出來的是CD11c+CD1c-HLA-DR+DC，其CD86呈弱陽性表達(圖4A)。與對照組相比，HCoV-OC43感染能顯著促進成熟DC細(xì)胞HLA-DR平均熒光強度(P<0.05，圖4B)，同時CD86的表達也發(fā)生上調(diào)，說明HCoV-OC43能激活成熟DC產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng)，其共刺激分子的表達并不受病毒感染的影響。此外， HCoV-OC43感染成熟DC可導(dǎo)致CD1c呈弱陽性表達，說明病毒感染可能會改變培養(yǎng)體系中DC的分化和亞型分布。

3 討論

病毒與宿主固有免疫細(xì)胞之間的相互作用是病毒致病的重要環(huán)節(jié)，對于病毒感染及免疫反應(yīng)至關(guān)重要，其中又以IFN在抗病毒感染的固有免疫中的作用最為關(guān)鍵。病毒進入機體后，可被DC模式識別受體識別，并通過一系列級聯(lián)反應(yīng)引起IFN-α、IFN-β的分泌，這是機體天然免疫系統(tǒng)應(yīng)對病毒感染的第一道防線[15]。迄今為止已報道了來自于93種不同病毒的超過170種由病毒編碼產(chǎn)生的干擾素拮抗物質(zhì)，作用于干擾素環(huán)路中的誘導(dǎo)活化、信號傳導(dǎo)、效應(yīng)發(fā)揮的不同環(huán)節(jié)[16]。研究病毒的免疫逃逸機制已經(jīng)成為闡明病毒致病性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，具有十分重要的科學(xué)和實踐意義。自1967年Mclntosh等[6]用人胚氣管培養(yǎng)法從感冒病人中分離出HCoV-OC43病毒株以來，已證實人感染HCoV-OC43的癥狀主要為普通感冒，約占普通感冒的15%～30%，且基本都不屬于下呼吸道感染[7]，表明其致病力較低，但其在人群中的高感染率和反復(fù)感染性提示OC43可能已經(jīng)較好地適應(yīng)了人免疫力，具有一定的免疫逃逸機制。目前已有學(xué)者對HCoV-229E和HCoV-SARS的致病性及免疫逃逸機制進行了研究，但HCoV-OC43與人DC相互作用及其免疫逃逸機制目前尚不清楚。

Kuri等[17]研究發(fā)現(xiàn)HCoV-229E和HCoV-SARS等多種HCoV均具有抗干擾素反應(yīng)的作用，HCoV-229E可感染肺泡巨噬細(xì)胞，并抑制其IFN-α和IFN-β的產(chǎn)生，但不抑制其CCL3和CCL4的分泌[18]。目前，HCoV-OC43在DC中是否能產(chǎn)生類似的抗干擾素的免疫逃逸效應(yīng)少見相關(guān)文獻報道。本研究首先在體外分離得到HCoV-OC43，并建立體外感染體系，對HCoV-OC43的致病性及免疫逃逸機制進行了初步研究。HCoV-OC43并不能像HCoV-229E一樣殺死DC細(xì)胞[19]，培養(yǎng)上清中也檢測不到HCoV-OC43的核酸，但是我們發(fā)現(xiàn)與Law等[20]對HCoV-SARS的研究結(jié)果相似，HCoV-OC43感染后，DC細(xì)胞突觸會變短變粗，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，并可觀察到胞漿及囊泡內(nèi)攝取和加工的病毒顆粒。本研究結(jié)果表明HCoV-OC43可感染人DC細(xì)胞但不能釋放成熟子代病毒，DC胞漿內(nèi)的病毒可被其加工提呈，刺激產(chǎn)生相應(yīng)的抗病毒免疫應(yīng)答。

對DC功能相關(guān)細(xì)胞因子表達分析的結(jié)果顯示，在病毒與DC接觸的初期(感染6 h)，IFN-α的表達迅速增多，到24 h時，IL-1β、IL-8及IP-10產(chǎn)量也相繼增多，說明HCoV-OC43入侵后，DC會迅速分泌包括IFN-α在內(nèi)的相關(guān)的炎癥因子，刺激自身的成熟及遷移到外周啟動后續(xù)免疫反應(yīng)。但是在病毒感染24 h時，我們發(fā)現(xiàn)Ⅰ型干擾素(IFN-α和IFN-β)的表達出現(xiàn)了顯著下調(diào)，同時趨化因子CCL3和CCL5表達也明顯下降。Ⅰ型干擾素及其他一些炎癥因子(如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等)產(chǎn)生后，可激活下游信號通路，從而引發(fā)更多抗病毒反應(yīng)，抑制病毒的復(fù)制與增殖[21]：干擾素可干擾病毒本身的復(fù)制，誘導(dǎo)NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞殺死或吞噬已被病毒感染的細(xì)胞，從而增強DC對T細(xì)胞的抗原提呈能力，對抗病毒感染等[22]。趨化因子CCL3可募集及激活中性粒細(xì)胞；CCL5可募集白細(xì)胞到炎癥位點，同時誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖與活化[23,24]。這些結(jié)果說明HCoV-OC43可能通過抑制Ⅰ型干擾素及趨化因子CCL3和CCL5分泌的相關(guān)信號通路，損害DC、中性粒細(xì)胞及NK細(xì)胞等相關(guān)免疫細(xì)胞的功能，實現(xiàn)免疫逃逸，干擾機體的抗病毒反應(yīng)，這些免疫逃逸機制可能是HcoV-OC43感染后不能產(chǎn)生持久有效的免疫力的原因之一。

與Law等[20]對HCoV-SARS的研究結(jié)果相似，本研究對DC表面標(biāo)志物的分析發(fā)現(xiàn)HCoV-OC43感染能顯著增加成熟DC的HLA-DR的表達(P<0.05)，CD86的表達也發(fā)生上調(diào)。此外，與對照組相比， HCoV-OC43感染成熟DC可導(dǎo)致CD1c呈弱陽性表達，說明HCoV-OC43共培養(yǎng)可能會影響培養(yǎng)體系中DC的分化和亞型分布。本研究結(jié)果顯示，HCoV-OC43與DC相互作用并不抑制DC的成熟及共刺激能力，盡管Ⅰ型干擾素及部分趨化因子的表達受到抑制，DC在HCoV-OC43感染和抗原刺激后仍可產(chǎn)生抗病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)，此發(fā)現(xiàn)也可從一定程度上解釋HcoV-OC43感染人后并不能導(dǎo)致嚴(yán)重的呼吸道疾病的特點。

綜上所述，本課題對HCoV-OC43致病性及免疫逃逸機制的初步研究結(jié)果顯示，HCoV-OC43與DC相互作用后并不抑制DC的成熟及共刺激能力，DC在受到感染和抗原刺激后仍可產(chǎn)生抗病毒免疫應(yīng)答；但HCoV-OC43能顯著抑制DC細(xì)胞的Ⅰ型干擾素及趨化因子CCL3和CCL5的表達，產(chǎn)生免疫逃逸，其作用可能與其致病特點有關(guān)。本研究結(jié)果為進一步闡明HCoV-OC43的致病性及免疫逃逸機制奠定了基礎(chǔ)，為HCoV與免疫系統(tǒng)相互作用的研究提供了重要的參考依據(jù)，為HCoV的疫苗制備和抗病毒藥物的研究提供了新的線索及思路。

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[收稿2016-08-21 修回2016-10-25]

(編輯 許四平)

Preliminary mechanism study of HCoV-OC43 escape from human dendritic cell immune elimination

YANGQuan,TUOJiu-Ling,HUANGXu-Bin,LUOHong-Jiao,ZHOUKai,ZHANGTian,CAOKai-Yuan,XULin.

DepartmentofPathogenBiology&Immunology,CollegeofBasicSciences,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China

Objective:To study the possible immune escape mechanisms of HCoV-OC43 from human dendritic cells(DC).Methods：HCoV-OC43 was isolated from clinical specimen using BSC-1 cells and identified by Real-time PCR,and the cytopathic effect was observed by phase contrast microscope.DCs were induced in vivo using hu-GM-CSF and IL-4 cytokines,and after 7 days of differentiation,DCs were infected by HCoV-OC43.The morphology of HCoV-OC43 infected DC was observed by transmission electron microscope,and the cytokines related to DC functions were detected by Real-time PCR after infection.DC proportion and function related co-stimulatory molecules were analyzed by flow cytometry.Results：In vitro HCoV-OC43 infected human DC model was successfully built.HCoV-OC43 can infect DC and generate immune response of DC in vitro,but no virus nucleonic acid could be detected in culture supernatant.The DC expression of IFN-α,IFN-β,CCL3 and CCL5 were significant decreased when infected with HCoV-OC43,but the expression of costimulatory molecules including HLA-DR,CD1c and CD86 were not affected by HCoV-OC43 infection.Conclusion：Human DC could be infected by HCoV-OC43 and generate immune response,but could not produce progeny virus.HCoV-OC43 may escape from immune response by suppressing the expression of IFN-α and other inflammatory cytokines and chemokines in DC.

Human coronavirus OC43;Human dendritic cells;Cytokine;Immune escape

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.002

①本文受國家傳染病防治科技重大專項(No.2012ZX10004-213)、國家自然科學(xué)基金項目(No.81000230)和廣東省自然科學(xué)基金青年項目(No.A030310282)資助。

楊 權(quán)(1985年-)，男，博士，講師，主要從事髓系細(xì)胞分化機制方面的研究，E-mail：yquangy2015@163.com。

及指導(dǎo)教師：徐 霖(1976年-)，女，博士，副教授，主要從事病毒和腫瘤學(xué)相關(guān)研究，E-mail：xulin@mail.sysu.edu.cn。

R373.1 R392.12

A

1000-484X(2017)04-0488-06

②中山大學(xué)熱帶病防治研究教育部重點實驗室，廣州510080。

③中山大學(xué)香港大學(xué)粵港傳染病監(jiān)測聯(lián)合實驗室，廣州510080。

④中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院MICU室，廣州510080。