快速冰凍免疫組化染色診斷陰道惡性黑色素瘤1例及其應(yīng)用價(jià)值

宋劍嬋　司婧文　陳凌　張新瑩　師宜荃　劉易欣

摘要：陰道惡性黑色素瘤是一類非常罕見，但惡性程度高且復(fù)發(fā)率高的腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅了女性的生命健康。本文報(bào)道一例天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院快速冰凍切片免疫組化染色診斷陰道惡性黑色素瘤的病例。該患者為老年女性，19年前因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)，現(xiàn)因陰道分泌物增多伴出血就診，陰道鏡檢查發(fā)現(xiàn)宮頸黑色病變，TCT檢測(cè)見部分含有黑色素的細(xì)胞，患者術(shù)中送檢組織進(jìn)行冰凍檢測(cè)，但因送檢組織小，不具備診斷惡性黑色素瘤的標(biāo)準(zhǔn)，遂行快速冰凍免疫組化染色HMB45和MelanA均呈陽(yáng)性，冰凍診斷考慮為惡性黑色素瘤，石蠟切片HE及免疫組化染色支持陰道惡性黑色素瘤。通過報(bào)道該病例，探討快速冰凍切片免疫組化染色的臨床意義及應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：惡性黑色素瘤，快速冰凍免疫組化，HMB45，MelanA

Diagnosis of Vaginal Malignant Melanoma by Rapid Frozen Immunohistochemical Staining：A Case Report and Its Application Value

SONG Jian-chan，SI Jing-wen，CHEN Ling，ZHANG Xin-ying，SHI Yi-quan，LIU Yi-xin

（Department of Pathology，Tianjin Central Hospital of Gynecology Obstetrics，Tianjin，300100，China）

Abstract：Vaginal malignant melanoma is a very rare，but high degree of malignancy and high recurrence of the tumor，the incidence rate in the global context is on the rise，a serious threat to women's life and health.This paper reports a case of Tianjin Central Obstetrics and Gynecology Hospital rapid frozen section immunohistochemistry staining in diagnosis of vaginal malignant melanoma cases.The patient was an old women，19 years ago due to uterine fibroids hysterectomy，due to increased vaginal secretions with hemorrhage treatment，cervical lesions found in black colposcopy and TCT detection showed some melanin containing cells.For patients with frozen tissue detection，but because the inspection organization is small，does not have the diagnosis of malignant melanoma of the standard，carry out the frozen immunohistochemistry staining of HMB45 and MelanA were positive，frozen for diagnosis of malignant melanoma，paraffin HE and immunohistochemical staining in support of malignant melanoma in the vagina.Through the case study reports，to investigate the clinical significance and application value of rapid frozen section immunohistochemical staining.

Key words：Malignant melanoma；Rapid frozen immunohistochemistry；HMB45；MelanA

1資料與方法

1.1病例 患者，女性，67歲，主因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)后19年，陰道分泌物增多伴出血就診于外院，診斷為陰道炎，為進(jìn)一步明確診斷轉(zhuǎn)入天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院。陰道鏡檢查發(fā)現(xiàn)宮頸黑色病變，采集宮頸細(xì)胞樣本進(jìn)行液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)（Thinprep cytologic test，簡(jiǎn)稱TCT）檢測(cè)，鏡下見含有黑色素的細(xì)胞，見圖1。遂于2016年8月29日進(jìn)行手術(shù)，術(shù)中送檢陰道內(nèi)組織及病灶（小米大～直徑0.5 cm）共8塊做快速冰凍檢測(cè)，由于送檢組織小，細(xì)胞異型小，無典型惡性黑色素瘤形態(tài)特點(diǎn)，術(shù)中正確診斷對(duì)于患者手術(shù)方式選擇至關(guān)重要，且該患者年齡較大，無法耐受二次手術(shù)，遂決定行術(shù)中快速冰凍免疫組化檢測(cè)，HMB45和MelanA染色，腫瘤細(xì)胞均呈陽(yáng)性表達(dá)，冰凍診斷為：陰道黑色素腫瘤，考慮為惡性黑色素瘤。之后臨床對(duì)腫物進(jìn)行了擴(kuò)大切除，進(jìn)一步切除了雙側(cè)附件、宮旁組織、陰道壁及雙側(cè)髂總、髂內(nèi)、髂外、閉孔、腹股溝淋巴結(jié)。

1.2方法

1.2.1快速冰凍切片免疫組織化學(xué)染色 快速免疫組化的檢測(cè)系統(tǒng)采用邁新公司的即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒，一抗HMB45為中杉金橋公司的ZM-0187鼠單抗，MelanA為中杉金橋公司的ZM-0398鼠單抗，顯色分別用Dako公司的Dako RealTM DAB和中杉金橋公司的ZLI-9036 AEC酶底物試劑盒。

術(shù)中送檢的組織標(biāo)本進(jìn)行快速冰凍制片后，經(jīng)95%乙醇固定2 min，稍水洗，3%H2O2 2 min，PBS 1 min ×3次，分別滴加HMB45和MalanA一抗，37°C孵育20 min，PBS 1 min ×3次，然后滴加快捷型二抗，37°C孵育8 min，PBS稍洗后，滴加DAB顯色2 min，稍水洗后進(jìn)行復(fù)染，常規(guī)脫水透明后封片，整個(gè)染色過程共約35～40 min。

1.2.2石蠟組織切片染色 組織標(biāo)本固定于10%中性福爾馬林，經(jīng)脫水、透明、浸蠟后，石蠟包埋、常規(guī)切片、HE染色。

1.2.3石蠟組織切片免疫組織化學(xué)染色 免疫組化染色一抗HMB45為中杉金橋公司的ZM-0187鼠單抗，MelanA為中杉金橋公司的ZM-0398鼠單抗，二抗為深達(dá)生物公司的DD-13免疫顯色試劑，顯色試劑同冰凍免疫組化。常規(guī)石蠟切片后65°C烤片1 h，透明劑5 min×3脫蠟，無水乙醇3 min×3，95%乙醇3 min，80%乙醇3 min，水洗，EDTA（PH8.0）熱修復(fù)95°C，3 min，待冷卻后經(jīng)3%H2O2封閉10 min，流水沖洗，PBS 3 min×3，然后滴加一抗，37°C孵育1 h，PBS 3 min×3，然后滴二抗，室溫孵育30 min，PBS 3 min×3，滴加DAB顯色2 min，稍水洗后進(jìn)行復(fù)染，常規(guī)脫水透明后封片，整個(gè)染色過程約4～5 h。

2結(jié)果

2.1快速冰凍切片HE及免疫組化染色：HE染色細(xì)胞異型小，惡性黑色素瘤形態(tài)不典型，HMB45和MelanA部分細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，定位于細(xì)胞漿，見圖2。

1.2石蠟切片HE染色結(jié)果 鏡下見大部分區(qū)域腫瘤細(xì)胞較小，異型性小，圓形或多角形，上皮樣，部分細(xì)胞胞漿空亮，少部分細(xì)胞內(nèi)可見黑色素顆粒；零件少部分區(qū)域細(xì)胞呈梭形，異型性較大，部分細(xì)胞漿內(nèi)可見黑色素顆粒，見圖3。病理診斷：陰道黑色素瘤，結(jié)節(jié)樣惡性黑色素瘤；Breslow厚度：1.3 cm；Clark水平：Ⅳ；有水平（放射狀）生長(zhǎng)、垂直生長(zhǎng)及潰瘍，核分裂像1～4個(gè)/2mm2，無退化，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，周圍切緣及深部切緣陰性，見微衛(wèi)星灶，有血管浸潤(rùn)，無神經(jīng)浸潤(rùn)；AJCC分期：T4bN2aMx。

2.3石蠟切片免疫組化染色結(jié)果 MelanA和HMB45染色，腫瘤細(xì)胞均陽(yáng)性；其中AEC顯色，陽(yáng)性結(jié)果呈紅色；DAB顯色，陽(yáng)性結(jié)果為呈棕黃色；細(xì)胞內(nèi)色素呈棕至棕黑色，細(xì)胞核均呈藍(lán)色，見圖4。

2討論

惡性黑色素瘤是來源于黑色素細(xì)胞的一種高度惡性腫瘤[1]，原發(fā)于女性生殖道的惡性黑色素瘤少見，僅占全部惡性黑色素瘤的3%～5%[2]。1887 年P(guān)oronas 首次報(bào)道了原發(fā)性陰道惡性黑色素瘤，至今這種病例只有少數(shù)個(gè)案報(bào)道及病例分析，全球的病例報(bào)道文獻(xiàn)不足300 例[3]，該疾病惡性度高，易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，其5年生存率約為25%[4]。目前，手術(shù)仍是陰道惡性黑色素瘤首選治療方案，能有效延長(zhǎng)患者生存時(shí)間[5]。此外，早期發(fā)現(xiàn)有助于延長(zhǎng)患者的存活時(shí)間，因此對(duì)惡性黑色素瘤病理診斷分析的準(zhǔn)確性顯得極為重要，掌握惡性黑色素瘤病理診斷特點(diǎn)，有助于臨床治療和患者預(yù)后。免疫組織化學(xué)染色中，惡性黑色素瘤腫瘤細(xì)胞不同程度地表達(dá)黑色素細(xì)胞標(biāo)志物S-100、HMB45和MelanA，由于各標(biāo)志物的敏感性和特異性不同，故采用至少兩種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，可提高惡性黑色素瘤的診斷準(zhǔn)確性[6]。本病例因冰凍送檢組織小，鏡下惡性黑色素瘤細(xì)胞形態(tài)不典型，異型性小，且患者年齡較大，無法耐受二次手術(shù)，所以需行快速冰凍免疫組化以明確診斷，選取HMB45和MelanA兩種抗體聯(lián)合使用。我們所用的快速冰凍免疫組化只需35～40 min就能完成染色過程，對(duì)于術(shù)中需要明確診斷，尤其是明確良惡性診斷的病例具有重要的臨床意義和應(yīng)用價(jià)值，但并不是所有用于石蠟免疫組化的抗體，均適用于快速冰凍免疫組化，因此我們也在進(jìn)一步研究和探討更多適用于快速冰凍免疫組化的指標(biāo)。

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