基于LC—MS技術(shù)毛細(xì)支氣管炎風(fēng)熱閉肺證的代謝組學(xué)研究

陳超　邊遜

摘要：目的 采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法，探析毛細(xì)支氣管炎中醫(yī)風(fēng)熱閉肺證在血清內(nèi)源性代謝物的變化，以尋找毛細(xì)支氣管炎中醫(yī)風(fēng)熱閉肺證的診斷標(biāo)志物。方法 收集毛細(xì)支氣管炎患兒風(fēng)熱閉肺證（風(fēng)熱閉肺組）20例和健康兒童（對(duì)照組）20例。以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)兩組受試患兒的血清樣本進(jìn)行代謝圖譜分析，并對(duì)潛在的生物標(biāo)記物進(jìn)行鑒定。結(jié)果 風(fēng)熱閉肺組與正常對(duì)照組相比很多離子峰高、峰面積均存在著明顯差異，篩出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的差異生物標(biāo)志物共8種：L-纈氨酸，尿素，L-天門冬氨酸，2氨-咪唑，D-甘露糖，L-天門冬酰胺，D-果糖，L-谷氨酰胺。結(jié)論 本研究從代謝組學(xué)小分子水平初步反映了小兒毛細(xì)支氣管炎風(fēng)熱閉肺證的代謝特征，為從生物代謝的角度研究中醫(yī)證候的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：代謝組學(xué)；毛細(xì)支氣管炎；風(fēng)熱閉肺證；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

Study on Metabonomics of Bronchiolitis with Wind Heat Obstructing Lung Syndrome Based on LC-MS

CHEN Chao，BIAN Xun

（Department of Pediatrics，Nanjing Traditional Chinese Medicine and Western Medicine Hospital，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210014，Jiangsu，China）

Abstract：Objective Using high performance liquid chromatography-mass spectrometry metabonomic technique study method，the change of capillary bronchitis chinese wind heat closed the lung in serum endogenous metabolites，to find the diagnosis of bronchiolitis in Traditional Chinese Medicine of wind heat closed lungs markers.Methods Capillary bronchitis in children with wind heat closed the lung（wind heat closed lung group）and 20 healthy children（control group）20 cases.The two groups of serum sample test were analyzed by using metabolic profiling by liquid chromatography mass spectrometry，and to identify potential biomarkers.Results Many group of wind heat lung ion peak high compared with the normal control group，area there were significant differences， with statistical difference between screening biomarkers were 8： L-valine， urea， L-aspartic acid， 2 of ammonia - imidazole，D-mannose，L-asparagine，D-fructose，L-glutamine.Conclusion This study from the metabonomics small molecular level preliminary reflect the metabolic characteristics of children with bronchiolitis in wind heat closed the lung，and provide a certain experimental basis for the modern scientific connotation of TCM syndromes from the perspective of biological metabolism.

Key words：Metabonomics；Bronchiolitis；Wind heat obstructing lung syndrome；Liquid chromatography-mass spectrometry

中醫(yī)證候代謝組學(xué)研究[1]是運(yùn)用代謝組學(xué)相關(guān)技術(shù)對(duì)中醫(yī)不同證候患者或模型動(dòng)物的血漿、尿液等樣本進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析，得到各自的代謝產(chǎn)物圖譜，篩查出特異性代謝產(chǎn)物的標(biāo)志物，并用生物信息學(xué)方法分析生物標(biāo)志物的功能，以確定“證相關(guān)代謝譜群”。本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)毛細(xì)支氣管炎風(fēng)熱閉肺證患兒血清內(nèi)源性小分子代謝物的變化差異進(jìn)行分析，探析毛細(xì)支氣管炎中醫(yī)風(fēng)熱閉肺證的代謝組學(xué)特征，以期為毛細(xì)支氣管炎中醫(yī)證候?qū)W研究提供代謝組學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 全部病例均來(lái)源于2012年2月～2014年4月我院兒科RSV毛細(xì)支氣管炎風(fēng)熱閉肺證住院患兒，共20例。2014年3月～2015年10月健康體檢患兒20例。兩組在性別、年齡方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），簽署知情同意書。

1.2病例納入標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)診斷參照全國(guó)高等學(xué)校教材《兒科學(xué)》（第七版），中醫(yī)疾病診斷、證候診斷參照普通高等教育“十五”國(guó)家級(jí)規(guī)劃教材、新世紀(jì)全國(guó)高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材《中醫(yī)兒科學(xué)· 肺系疾病·肺炎喘嗽》及國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)臨床診療術(shù)語(yǔ)證候部分》的相關(guān)內(nèi)容。排除應(yīng)激和先天性心臟病、支氣管肺發(fā)育不良、早產(chǎn)及免疫缺陷等患兒。

1.3樣本采集及處理 根據(jù)知情同意書，于患兒入院第2 d，取清晨取清晨空腹時(shí)采集靜脈血5 ml，經(jīng)13000 r/min離心10min。取血清，分裝，先置于-20℃，1 w后置-80℃保存；標(biāo)本測(cè)試時(shí)將凍存的樣本在室溫下解凍，取50μL置離心管中，加入150 μL乙腈，渦旋充分混勻，然后16000 r/min，高速離心5 min，取上清液過(guò)Captiva ND Lipids過(guò)濾板，取濾液進(jìn)樣、LC-MS儀分析。

1.4統(tǒng)計(jì)分析方法 在樣品測(cè)定時(shí)，用Agilent MassHunter Workstation軟件包中的Data Acquisition軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，然后用Qualitative Analysis對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分子特征識(shí)別，分析處理后，導(dǎo)入Mass Profiler Professional（MPP）軟件，通過(guò)MPP軟件處理數(shù)據(jù)，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）法來(lái)描述數(shù)據(jù)內(nèi)部的特征，運(yùn)用PCA得分圖（Score plot）獲得樣本分類信息，并發(fā)現(xiàn)可作為生物標(biāo)記物的化合物，在此基礎(chǔ)上用PLS-DA 進(jìn)行建模，來(lái)考察生物標(biāo)記物對(duì)于毛細(xì)支氣管炎中醫(yī)證候篩選的準(zhǔn)確度和靈敏度，在多維統(tǒng)計(jì)中找出差異代謝物，并應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和單因素ANOVA分析的驗(yàn)證，結(jié)合VIP值大于1并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）的代謝物確定為潛在標(biāo)記物。

2 結(jié)果

2.1各組血漿液相色譜-質(zhì)譜代謝輪廓分析 正常組、RSV感染喘息性支氣管炎風(fēng)熱閉肺組（簡(jiǎn)稱風(fēng)熱閉肺證組）血液液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）典型總離子色譜圖（Total ion current chromatogram，TIC）見(jiàn)圖1、2，模式識(shí)別分析結(jié)果顯示在相同保留時(shí)間下風(fēng)熱閉肺組與正常對(duì)照組相比很多離子峰高、峰面積存在著明顯差異。

2.2潛在標(biāo)志物 采用LC-MS儀器自帶的相似匹配軟件結(jié)合保留時(shí)間，通過(guò)PCA法等分析，經(jīng)SIMCA-P軟件分析并經(jīng)過(guò)譜庫(kù)鑒定、分析得出毛細(xì)支氣管炎風(fēng)熱閉肺證患兒相比健康對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)血清代謝物有8種：L-纈氨酸，尿素，L-天門冬氨酸，2氨-咪唑，D-甘露糖，L-天門冬酰胺，D-果糖，L-谷氨酰胺，見(jiàn)表1。

3 討論

急性毛細(xì)支氣管炎是嬰幼兒時(shí)期臨床最為常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，臨床上以喘憋為特征，好發(fā)于3歲以內(nèi)患兒，尤其是2月～6個(gè)月的嬰兒。Sihurs等研究發(fā)現(xiàn)[2-3]毛細(xì)支氣管炎反復(fù)發(fā)作易進(jìn)展為哮喘，是兒童哮喘的風(fēng)險(xiǎn)因素之一，其確切機(jī)制目前尚不清楚。在治療方面，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無(wú)特效藥物，中醫(yī)根據(jù)辯證論治原則，組方配藥，臨床療效滿意，具有一定優(yōu)勢(shì)，但目前中醫(yī)的證候?qū)W研究尚缺乏客觀量化標(biāo)準(zhǔn)。

機(jī)體代謝產(chǎn)物的變化可敏銳地反映機(jī)體在特定生理病理狀態(tài)下的變化，是組學(xué)研究的最終目標(biāo)與方向，自2009年SlupskyCM[4]首次提出基于NMR的代謝組學(xué)研究方法可能適用于肺炎的病因快速診斷，在未來(lái)肺炎的醫(yī)學(xué)研究中具有明顯優(yōu)勢(shì)，本研究采用LC-MS代謝組學(xué)技術(shù)分析患兒血漿代謝物發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)支氣管炎風(fēng)熱閉肺證患兒與健康對(duì)照組間在小分子代謝物表達(dá)水平具有明顯差異，共篩出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異性血清代謝物8種：L-纈氨酸，尿素，L-天門冬氨酸，2氨-咪唑，D-甘露糖，L-天門冬酰胺，D-果糖，L-谷氨酰胺。表明在RSV感染的狀態(tài)下，患兒體內(nèi)一些小分子代謝物的含量發(fā)生明顯改變，提示該代謝通路改變具有差異性。

本研究從代謝組學(xué)小分子水平初步反映了小兒毛細(xì)支氣管炎風(fēng)熱閉肺證的代謝特征，為從生物代謝的角度研究中醫(yī)證候的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為今后中醫(yī)兒科證候?qū)W研究做出了有益探索。

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