左金方體內(nèi)外抑制幽門螺桿菌的實驗研究

余惠旻，侯梅軒，林敬斌，周禹練，黎瑩斯，陳永恒

(深圳大學醫(yī)學院，廣東 深圳 518060)

左金方體內(nèi)外抑制幽門螺桿菌的實驗研究

余惠旻，侯梅軒，林敬斌，周禹練，黎瑩斯，陳永恒

(深圳大學醫(yī)學院，廣東 深圳 518060)

目的：探討左金方在體內(nèi)外抑制幽門螺桿菌(hlicobacter pylori，Hp)生長繁殖的作用。方法：采用瓊脂稀釋法測定左金方和克拉霉素對Hp最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。60只BALB/c小鼠雌雄各半，按體質(zhì)量分層隨機分為正常組、模型組、胃三聯(lián)組(0.351 mg·g-1)及左金方低、中、高劑量組(0.364，0.728，1.456 g·kg-1·d-1)6組，采用抗生素加Hp的方法連續(xù)灌胃7 d建立Hp感染動物模型。從第11天開始連續(xù)灌胃給藥8周后處死小鼠，進行血清尿素酶抗體檢測以及病理切片檢查。結果：瓊脂稀釋法測得左金方最小MIC值為200 μg· mL-1,克拉霉素最小MIC值為0.5 μg· mL-1。血清幽門螺桿菌抗體檢測、小鼠胃黏膜病理切片結果均提示Hp感染動物模型復制成功，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。胃三聯(lián)組、左金方高、中、低劑量組均能有效抑制體內(nèi) Hp的生長，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。結論：左金方在體內(nèi)體外均能有效地抑制幽門螺桿菌的生長。

左金方；幽門螺桿菌；最小抑菌濃度；抑菌

幽門螺桿菌(hpylori，Hp)是全球范圍內(nèi)高感染率的慢性感染性致病菌[1]，近年來發(fā)現(xiàn)Hp感染者可發(fā)展為慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤和胃癌，是極其重要的始動因素[2-3]。目前臨床以2種抗生素加質(zhì)子泵抑制劑為治療Hp的首選藥物，但是隨著抗生素的廣泛使用，Hp耐藥菌株不斷出現(xiàn)以及抗生素相關不良反應等問題，Hp根治難度越來越大。因此，研究新的抗Hp藥物已成為一項重要的研究課題。左金方由黃連和吳茱萸按6∶1組成，對消化系統(tǒng)有廣泛的藥理作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，左金方有抗?jié)?、保護胃黏膜、抑制胃酸分泌、抑菌、止痛和影響胃腸運動的作用[4]。本研究旨在觀察左金方體內(nèi)外抑制幽門螺桿菌生長的情況，為Hp感染相關消化系統(tǒng)疾病的治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

三氣培養(yǎng)箱(美國THERMO公司)；生物安全柜(新加坡ESCO公司)；LEICA ASP 3005脫水機、EG1150 H石蠟包埋機、LEICA RM2235石蠟切片機、LEICA ST5010 自動染色機(德國LEICA公司)，PHY-Ⅲ型攤烘烤片機(中國江蘇常州市中威醫(yī)療器械有限公司)，Olympus IX-81 型病理圖像采集系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司),Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)(美國Medica Cybernetics公司)。

1.2 主要藥物與試劑

黃連、吳茱萸均購自深圳華輝藥業(yè)有限公司，由深圳市中醫(yī)院中藥科劉志承主任藥師鑒定，分別為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch．的干燥根莖和蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa (Juss)Benth．干燥近成熟的果實[5]；枸櫞酸鉍鉀片/替硝唑片/克拉霉素片(麗珠集團麗珠制藥廠，批號160903)；克拉霉素緩釋膠囊(廣州柏賽羅藥業(yè)有限公司，批號514)；幽門螺桿菌尿素酶抗體檢測試劑盒(北京康美天鴻生物科技有限公司)；BRAIN HEART INFUSION (CM1135,美國OXOID公司)；CAMPYLOBACTER AGAR BASE (Karmali)(CM0935,美國OXOID公司)。

1.3 細菌與動物

幽門螺桿菌采用SSI(Sydney strain 1)菌株，培養(yǎng)液由廣州中醫(yī)藥大學中藥藥理室提供。SPF級Balb/c 小鼠雌雄各半，體質(zhì)量18～20 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供(動物許可證號SCXK(粵)2013-0002)。

2 方法

2.1 藥物制備

左金方傳統(tǒng)湯劑凍干粉由本實驗室提供，取黃連30 g、吳茱萸5 g加8倍蒸餾水浸泡30 min，加水煎煮3 次，每次30 min 過濾，合并3次濾液冷凍干燥，每克干粉含生藥3.98 g。經(jīng)HPLC 法測定，左金方凍干粉中含小檗堿39.85%，巴馬汀9.19%，藥根堿4.86%，吳茱萸堿0.17%，吳茱萸次堿0.19%。將左金方凍干粉溶于去離子水中配置成1 mg· mL-1的母液，實驗時用超純水稀釋成所需濃度[6-7]。

克拉霉素的配制方法：取適量克拉霉素緩釋膠囊加超純水液配制成2 μg· mL-1母液，實驗時用超純水稀釋成所需濃度。胃三聯(lián)溶液的配制方法: 取適量枸櫞酸鉍鉀片/替硝唑片/克拉霉素片加超純水液配制成35.1 mg· mL-1母液，實驗時用超純水稀釋成所需濃度。

2.2 幽門螺桿菌的培養(yǎng)

取幽門螺桿菌液100 μL，用一次性涂布器涂于CAMPYLOBACTER AGAR BASE培養(yǎng)基上，置三氣培養(yǎng)箱中(85% N2，10% CO2，5% O2)培養(yǎng)，48 h后刮取細菌重懸于PBS緩沖液中，于麥氏比濁儀中調(diào)整至適宜實驗的菌液濃度。

2.3 瓊脂稀釋法測定藥物最小抑菌濃度

按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(clinical and laboratory standards institute，CLSI)制定的瓊脂稀釋法進行藥敏試驗。用CAMPYLOBACTER AGAR BASE培養(yǎng)基將左金方倍比稀釋成終濃度為500、400、300、200、100 μg · mL-1制備成含不同濃度中藥的血瓊脂平皿，同時以空白不含中藥的培養(yǎng)基作為對照。按2、1、0.5、0.25、0.125 μg · mL-1的克拉霉素終濃度制備H．pylori血瓊脂平皿。取100 μL濃度約為 3×108CFU· mL-1的H．pylori 對數(shù)期菌液，均勻涂布于制備好的培養(yǎng)基上，重復3塊培養(yǎng)基，于85%N2·10%CO2和5%O2、相對濕度95%、37℃條件下培養(yǎng)48～72 h，觀察細菌生長情況，以不出現(xiàn)菌落平皿上的最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。

2.4 造模方法

采用培養(yǎng)48～72 h的SS1菌株，PBS調(diào)整濃度到1×109CFU· mL-1，小鼠禁食不禁水24 h后，除空白組外其余小鼠均先用5%碳酸氫鈉溶液0.2 mL灌胃，30 min后按照每次0.2 Ml每只的劑量灌胃Hp菌液，連續(xù)4次，每次間隔48 h，空白對照組小鼠灌胃等量生理鹽水。于末次接種后第4周時禁食12 h處死小鼠，取2塊胃竇組織經(jīng)石蠟包埋，切片后經(jīng)硼酸美蘭(Boricacid methyl blue, BAMB)染色，進行病理組織學檢測；另一塊勻漿稀釋后進行Hp培養(yǎng)，培養(yǎng)后將可疑的菌落格蘭染色具有典型特征且觸酶實驗、氧化酶實驗以及尿素酶實驗陽性者判定為Hp感染，其中有2項陽性者說明造模成功[8]。

2.5 分組與給藥

取 Balb/c 小鼠(SPF級)，按性別體質(zhì)量隨機取10只為空白對照組，其余小鼠接種Hp造模，造模成功后按性別隨機分為模型組、胃三聯(lián)組(0.351 mg· g-1)、左金方高劑量組(1.456 g·kg-1·d-1)、左金方中劑量組(0.728 g·kg-1·d-1)、左金方低劑量組(0.364 g·kg-1·d-1)各10只，雌雄各半，各組小鼠開始灌胃給藥，正常對照組和模型組給予等量生理鹽水，每次0.3 mL，每日1次，連續(xù)8周。

2.6 血清尿素酶檢測方法

于末次給藥后禁食 24 h，眼眶取血并離心取血清，檢測幽門螺桿菌尿素酶抗體(根據(jù)試劑盒說明書方法進行)。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 左金方體外抗菌實驗

表1顯示，肉眼觀察左金方血瓊脂平皿中，含藥濃度在100 μg · mL-1以下時，均可見幽門螺桿菌的生長，含藥濃度在500、400、300、200 μg · mL-1時，均未見幽門螺桿菌的生長，可見左金方對Hp的MIC為200 μg· mL-1，相同條件下陽性藥物克拉霉素的MIC為0.5 μg· mL-1。

3.2 血清尿素酶檢測

表2顯示，血清幽門螺桿菌尿素酶抗體檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型組 Hp感染的陽性率為80%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明模型復制成功；胃三聯(lián)組明顯降低了Hp的感染率，Hp感染的陽性率降為20%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；左金方低劑量組與高劑量組對幽門螺桿菌的感染均有一定的抑制作用，其中高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，低劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 左金方體外對Hp的抑菌效果

注：+：代表有細菌生長；-：代表無細菌生長

表2 左金方抑制幽門螺桿菌的作用[例(%)]

注：與模型對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

3.3 胃黏膜病理組織學觀察結果

胃組織經(jīng)硼酸美蘭(boricacid methyl blue, BAMB)染色后，在光鏡下觀察，幽門螺桿菌為藍色，紅細胞綠色，背景藍色。 Hp形狀彎曲或棒桿狀，主要位于胃腺小凹表面和黏液內(nèi)。正常對照組胃小凹內(nèi)未見 Hp，感染率為 0(見圖 1A)；模型組及有Hp陽性感染組胃小凹黏液內(nèi)見深藍色的 Hp(見圖1B)；模型組感染率為100%；陽性藥物組清除率為100%，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；左金方高、中、低劑量組對Hp感染均有不同程度的抑制作用，其中左金方高劑量組清除率為80%，胃小凹內(nèi)見少量 Hp黏附，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；左金方低劑量組清除率為50%，胃小凹內(nèi)見較多Hp黏附，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 幽門螺桿菌在體清除實驗結果(胃黏膜組織Hp檢測)

注：與對照組比較：#P<0.01；與模型對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

圖1 小鼠胃黏膜切片(1000伊)A. 未感染 B. 感染

4 討論

幽門螺桿菌(helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎的主要病原體，它與胃潰瘍和胃癌的發(fā)生密切相關，是目前惟一公認的細菌致癌因子。研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染還與消化道外的多種疾病，如冠心病、動脈硬化、腦梗塞、高血壓、缺鐵性貧血、原發(fā)性血小板減少性紫癜等有關。

研究證實，根除幽門螺桿菌后可明顯降低和防止消化性潰瘍的復發(fā)。臨床常用抗菌藥物(有阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素等)、質(zhì)子泵制劑(奧美拉挫等)和鉍劑等對抗Hp感染。由于Hp的自發(fā)突變和不合理使用或濫用抗生素等原因，使耐藥菌株不斷增加，導致療效不穩(wěn)定、藥物副作用較大等后果，因此尋找新的對抗Hp感染的有效藥物成為亟待解決的關鍵問題[9]。

應用中藥治療細菌感染具有效果穩(wěn)定、不易發(fā)生耐藥性、易在胃內(nèi)發(fā)揮作用等優(yōu)勢，在抗Hp感染中不斷被開發(fā)應用[10]。左金方重用黃連為君藥，清瀉肝火，肝火得清，自不橫逆犯胃。且黃連瀉胃熱，使胃火降而和胃氣，清瀉肝胃之火，標本兼顧。方中配吳茱萸辛熱反佐黃連之寒，是瀉火而無涼遏之弊，兩藥相反相成，使肝火得清、胃氣得降則諸癥自愈[11]。

本實驗采用瓊脂稀釋法測定左金方抑制幽門螺桿菌生長的最小濃度為200 μg· mL-1，證明左金方在體外具有抑制Hp生長的作用；通過建立 Hp體內(nèi)感染模型，給動物灌服左金方藥物，發(fā)現(xiàn)左金方高、中、低劑量組對Hp感染均有不同程度的抑制作用。與模型組比較，左金方高劑量組清除率為80%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；左金方低劑量組清除率為50%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上結果說明，左金方在體內(nèi)外均有抑制幽門螺桿菌生長的作用。

[1] LEE YY, MAHENDRA RS, GRAHAM DY. Helicobacter pylori infection a boon or a bane: lessons from studies in a low-prevalence population [J]. Helicobater, 2013, 18(5):338-346.

[2] JING YANG, LV-XIA DAI, XING PAN, et al. Protection againstHelicobacterpyloriinfection in BALB/c mice by oral administration of multi-epitope vaccine of CTB-UreI-UreB[J]. Pathog Dis, 2015,73:1-9.

[3] LARS AGRéUS, PER M HELLSTROM, NICHOLAS J TALLEY, et al. Towards a healthy stomach?Helicobacterpyloriprevalence has dramatically decreased over 23 years in adults in a Swedish community, 2016, 4(5):686-696.

[4] 周紅祖，徐麗霞，余惠旻，等.左金方、黃連、吳茱萸誘導人胃癌細胞SGC-7901凋亡的作用比較[J].藥物分析雜志，2015,35(7)：1160-1165.

[5] 方玲子，周紅祖，余惠旻.左金方與反左金方抗MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡作用的對比研究[J].中南藥學，2015，13(7)：708-712.

[6] 周紅祖，周禹練，余惠旻.左金方和5-FU對胃癌細胞生長及BAX/Bcl-2表達的調(diào)控研究[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2016，22(6)：777-791.

[7] 邱菡，周紅祖，周禹練，等.左金方聯(lián)合5-FU抑制人胃癌細胞RF-48的增殖作用研究[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2016，22(7)：929-932.

[8] 許藝飛，江偉雯，鄺兆進，等.胃瘍寧丸體內(nèi)外抗幽門螺桿菌的實驗研究[J].中藥新藥與臨床藥理， 2014,25(5):572-576.[9] JIBRAN S. MUHAMMAD, SYED F. ZAIDI, YUE ZHOU, et al. Novel epidermal growth factor receptor pathway mediates release of human β-defensin 3 from Helicobacter pylori-infected gastric epithelial cells[J]. Pathog Dis, 2016，74: ftv128.

[10] 李江，成虹.不同中藥提取物對幽門螺桿菌耐藥菌株體外抗菌活性研究[J]. 現(xiàn)代中醫(yī)臨床，2015,22(2)：21-23.

[11] 陳奇.中成藥名方藥理與臨床 [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1998:59-260.

Antimicrobial Activities of ZuoJinFang against Helicobacter Pylori in Vivo and in Vitro

YU Hui-min, HOU Mei-xuan, LIN Jing-bin, ZHOU Yu-lian，LI Ying-si, CHEN Yong-heng

(SchoolofMedicine，ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China)

Objective： To study the antimicrobial activities of ZuoJinFang against helicobacter pylori in vivo and in vitro. Methods：The minimum inhibiting concentration (MIC) of ZuoJinFang and Clarthromycin were measured by agar dilution method; sixty BALB/c mice, half male and half female, were randomly divided into 6 groups, normal control group，model group，gastric triad group (0.351 mg· g-1) and ZuoJinFang low, middle and high dose groups (0.364，0.728，1.456 g· kg-1· d-1), the mice were inoculated orally with antibiotic on first day and with Helicobacter pylori strains for 7 continuous days to establish Hp infection model. From experimental day 11，the mice were given oral administration of the corresponding drugs for 8 weeks. At the end of the experiment，gastric mucosa and serum were obtained for serum HP antibody test and pathological section examination. Results The MIC of ZuoJinFang was confirmed as 200 μg· mL-1and that of Clarthromycin was 0.5 μg· mL-1. The result of serum antibody test and pathological section examination showed that Hp infection model had been established successfully，compared with the normal control, were statistically significant. And both gastric triad group and ZuoJinFang could inhibit the growth of Hp in vivo, compared with the model group，were statistically significant.Conclusion：ZuoJinFang are effective on inhibiting the growth of Hp in vivo and in vitro.

ZuoJinFang； Helicobacter pylori； Minimum inhibitory concentration； Antimicrobial activities in vitro and in vivo

余惠旻(1972-)，男，新疆人，藥學博士，從事中藥及其復方與機體微生態(tài)的研究。

R589

B

1006-3250(2017)03-0405-03

2016-09-15