糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態(tài)模型的建立*

李海洋，覃海知，晁 俊，方傳明，富曉旭，高 泓，謝春光△

(1．成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610075; 2．成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610075)

【實(shí)驗(yàn)研究】

糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態(tài)模型的建立*

李海洋1，覃海知1，晁 俊1，方傳明1，富曉旭1，高 泓2，謝春光2△

(1．成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610075; 2．成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610075)

目的:建立糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態(tài)模型。方法:60只雄性GK大鼠(隨機(jī)血糖>11.1 mmol·L-1)，按隨機(jī)數(shù)字表法分為GK組、模型組、中藥組各20只，另設(shè)正常Wistar大鼠20只為正常組。正常組、GK組喂飼普通飼料，模型組和中藥組喂飼高脂飼料，造模同時(shí)中藥組給予益氣養(yǎng)陰中藥治療。5周后檢測(cè)各組大鼠糖脂代謝、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA- IR)、血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和 Caspase-3表達(dá)等指標(biāo)，光鏡下觀測(cè)大血管組織病理。結(jié)果:與正常組和GK組比較，模型組大鼠血糖、TC和TG、胰島素抵抗、大血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和腹主動(dòng)脈病理比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與模型組比較中藥組所有指標(biāo)均有顯著改善。結(jié)論:通過GK大鼠喂養(yǎng)高脂飼料的方法可制備糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態(tài)動(dòng)物模型。

糖尿病大血管病變；氣陰兩虛；動(dòng)物模型

糖尿病大血管病變指由糖尿病并發(fā)的心、腦及外周血管病變,占糖尿病患者死亡原因的 60%～70%，已經(jīng)成為我國(guó)糖尿病發(fā)病率和致死率最高且危害最大的慢性并發(fā)癥[1]。為方便實(shí)驗(yàn)研究，筆者采用高脂飼料喂養(yǎng)自發(fā)性2型糖尿病大鼠的方法，試圖建立與臨床相吻合的2型糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態(tài)模型并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物及飼料

SPF級(jí)空腹血糖≥11.1 mmol/L的10周齡雄性自發(fā)性2 型糖尿病GK大鼠，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高脂飼料配方由普通飼料88.2%、精煉豬油 10%、膽固醇1.5%、豬膽鹽0.3%組成,四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心制成塊料。

1．2 藥物及試劑、儀器

參芪復(fù)方浸膏由人參、黃芪、生地黃、天花粉、山茱萸、山藥等中藥組成，1 g浸膏相當(dāng)于原生藥10 g,由四川省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)研究所藥劑科生產(chǎn)(批號(hào)080928)。強(qiáng)生穩(wěn)豪倍優(yōu)血糖儀和血糖試紙為強(qiáng)生(中國(guó))醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品;血清胰島素試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所；甘油三酯和膽固醇試劑盒購(gòu)自溫州東鷗津瑪生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水處理MF-RO-5型,杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司產(chǎn)品；7170型全自動(dòng)生化分析儀,日本日立公司生產(chǎn)；原位細(xì)胞凋亡TUNEL檢測(cè)試劑盒由美國(guó)Roche公司生產(chǎn)； OLYMPUSB X50光學(xué)顯微鏡由日本OLYMPUS公司生產(chǎn)； Mias-2000圖像分析系統(tǒng)由四川大學(xué)智勝軟件股份有限公司生產(chǎn)。

1．3 動(dòng)物分組及造模

80只GK大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后, 隨機(jī)血糖值11.1m mo l · L-1以上者60只入選本實(shí)驗(yàn)。 按隨機(jī)數(shù)字表法分為GK組、模型組、中藥組各20只，正常Wistar大鼠20只,另設(shè)正常組作為空白對(duì)照共4組。

造模同時(shí)開始給藥,周期5周,正常組、GK組喂飼普通飼料，模型組和中藥組喂飼高脂飼料。正常組、GK組、模型組均按5 ml/(kg· d)灌服生理鹽水，中藥組按 1.44 g/(kg· d) (相當(dāng)于成人劑量的 10倍,成人按60 kg計(jì))灌服中藥混懸液。具體方法: 稱取參芪復(fù)方浸膏7.2 g,加無(wú)菌水25 ml使勻,按5 ml/(kg· d)灌胃。大鼠造模給藥35 d后處死,下腔靜脈采集血樣,并剝離胸、腹主動(dòng)脈備檢。

1．4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)指標(biāo) 觀察動(dòng)物的毛色、攝食、體質(zhì)量、飲水、小便、大便、拉尾排便、神態(tài)、活動(dòng)情況等癥狀，檢測(cè)FBG、TC、TG、血清INS、血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和Caspase-3表達(dá)等。

1.4.2 平均熒光強(qiáng)度檢測(cè) 采用原位末端標(biāo)記Tunel法檢測(cè), 參照Roche原位細(xì)胞凋亡檢測(cè) POD試劑盒及濃縮型 DAB試劑盒操作, 激發(fā)光波長(zhǎng)450～500 nm, 檢測(cè)波長(zhǎng)515～ 565 nm, 在熒光活體微循環(huán)顯微鏡系統(tǒng)下觀察熒光染色結(jié)果, 每個(gè)組織>400× 視野下隨機(jī)選5個(gè)視野, 平均熒光強(qiáng)度=累積熒光強(qiáng)度/發(fā)光物體的表面積。

1.4.3 Caspase-3表達(dá) 采用免疫組組織化學(xué)染色，用OLYMPUSB X50光學(xué)顯微鏡觀察染色結(jié)果, 每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野, 輸入Mias-2000圖像分析系統(tǒng),在200倍鏡下分別測(cè)量?jī)?nèi)皮細(xì)胞 Caspase-3陽(yáng)性物質(zhì)積分光密度及平均光密度并計(jì)算其均值。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

造模過程中，因灌胃不當(dāng)造成糖尿病對(duì)照組大鼠死亡1只，其余無(wú)異常。

2．1 大鼠癥狀比較

造模后，GK組、模型組大鼠均出現(xiàn)神疲、懶動(dòng)或躁動(dòng)、毛色黃而少澤、飲水?dāng)z食增多、尿量增多、生長(zhǎng)增加減緩、拉尾排便、尾色變暗等糖尿病大鼠氣陰兩虛的共同特征，其中模型組的表現(xiàn)尤為明顯。上述癥狀及體征在使用中藥治療反證后與模型組比較均有明顯改善。

2．2 各組大鼠平均每日攝食和平均體質(zhì)量比較(表2)

2．3 各組大鼠FBG、 TC、 TG、FINS、HOMA-IR結(jié)果比較(表3)

表1 各組大鼠癥狀情況

表2 各組大鼠平均攝食和平均體質(zhì)量結(jié)果比較±s)

注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01；與中藥組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01

表3 各組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、 TC、 TG結(jié)果比較

注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01；與中藥組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01(HOMA- IR=(FBG × FINS)/22．5)

2．4 各組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜凋亡內(nèi)皮細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度和腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3表達(dá)水平結(jié)果比較(表4、圖1、2)

表4 各組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜凋亡內(nèi)皮細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度和腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3表達(dá)水平結(jié)果比較±s)

注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01；與中藥組比較:▲▲P<0.01

圖1 胸主動(dòng)脈平均熒光強(qiáng)度結(jié)果注：從左到右依次為正常組、GK組、模型組、中藥組

圖2 腹主動(dòng)脈caspase-3免疫組化染色(×200)注：從左到右依次為正常組、GK組、模型組、中藥組

2．5 大鼠腹主動(dòng)脈病理結(jié)果比較

圖3顯示，正常組大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)膜平坦,內(nèi)皮細(xì)胞扁平,緊貼于平直的內(nèi)彈力板上,中彈力板與平肌細(xì)胞整齊相間平行排列,內(nèi)膜光滑整齊；GK組內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,未見明顯脂質(zhì)沉積；模型組腹主動(dòng)脈病理顯示，有大小不一的內(nèi)膜增厚病灶，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、數(shù)目增多，內(nèi)皮下細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)膜斷裂不平整，脂質(zhì)沉積比較明顯，可見多個(gè)泡沫細(xì)胞；中藥組腹主動(dòng)脈內(nèi)膜大部分無(wú)增厚，偶見內(nèi)膜增厚病灶及泡沫細(xì)胞，數(shù)目較西藥組少，內(nèi)膜增厚處內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，內(nèi)皮下細(xì)胞浸潤(rùn)及脂質(zhì)沉積不明顯。

圖3 腹主動(dòng)脈病理HE染色(×400倍)注：從左到右依次為正常組、GK組、模型組、中藥組

3 討論

糖尿病大血管病變屬于中醫(yī)學(xué) “消渴”“痹癥”等范疇，氣陰兩虛是本病的基本病機(jī)，故本實(shí)驗(yàn)以建立2型糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態(tài)模型為主要研究對(duì)象。

目前2型糖尿病的造模方法主要有自發(fā)形成、誘導(dǎo)形成及基因敲除等方法[2]。本研究在參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-10]后，采用自發(fā)形成糖尿病和誘導(dǎo)形成大血管病變相結(jié)合的造模途徑。一方面，自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型GK大鼠是通過重復(fù)數(shù)代近親繁殖葡萄糖耐量處于上限的Wister大鼠而發(fā)展起來(lái)的。GK大鼠在發(fā)病后，明顯出現(xiàn)類似于糖尿病病人“三多一少”的臨床癥狀[11]。 研究指出，GK大鼠胰島組織的形態(tài)學(xué)變化與2 型糖尿病發(fā)病機(jī)制相近，GK大鼠死亡率低，血糖維持水平與臨床病人接近，動(dòng)物的感染癥狀不明顯。 研究結(jié)果說明，GK大鼠的優(yōu)點(diǎn)更適合2 型糖尿病發(fā)病機(jī)制及其并發(fā)癥的研究。另一方面，糖尿病及大血管病變的發(fā)生與飲食密切有關(guān)。《素問·奇病論》記載：“此肥美之所發(fā)也，此人必?cái)?shù)食甘美而多肥也，肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴。”《素問·痹論》曰：“飲食自倍， 腸胃乃傷。”本研究在中醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下，采用高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)模型大鼠的發(fā)生。GK大鼠為自發(fā)性糖尿病大鼠，既有先天不足的稟賦因素存在，又有本“虛”的特性，且處于“虛”態(tài)。GK大鼠通過高脂飲食誘導(dǎo)，類似于中醫(yī)理論中肥甘厚味損傷脾胃，脾胃虛弱則氣血生化乏源，在糖尿病“虛”態(tài)的基礎(chǔ)上增加了氣血不足的因素，先天不足加上后天乏源，故與中醫(yī)氣陰兩虛病機(jī)有相似之處[12-14]。

研究結(jié)果說明，模型組大鼠明顯出現(xiàn)血糖升高、血脂代謝紊亂、胰島素抵抗、大血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加和大血管組織病理改變等情況，其發(fā)病過程及特征與糖尿病大血管病變的臨床表現(xiàn)基本相似，屬于2型糖尿病大血管病變?cè)缰衅诘牡湫吞攸c(diǎn)。本研究和前期研究都發(fā)現(xiàn)，高脂飼料喂養(yǎng)的GK大鼠，其證候表現(xiàn)為精神萎靡、懶動(dòng)或躁動(dòng)、毛色枯黃、飲水?dāng)z食增多、尿量增多、生長(zhǎng)增加減緩、拉尾排便、尾色變暗等，與人體“氣陰兩虛”證的臨床表現(xiàn)具有相似性。模型大鼠的FBG、TC、TG、FINS、HOMA-IR升高，一是由于氣虛不能轉(zhuǎn)化體內(nèi)精微物質(zhì)所致，二是陰液不足不能稀釋血液所致；胸主動(dòng)脈平均熒光強(qiáng)度和腹主動(dòng)脈caspase-3表達(dá)水平的升高，以及腹主動(dòng)脈病理顯示內(nèi)膜增厚、細(xì)胞腫脹、細(xì)胞浸潤(rùn)、內(nèi)膜斷裂等表現(xiàn)，均是由于行于脈內(nèi)的“營(yíng)”陰不足不能濡養(yǎng)血管，氣虛不能正常推動(dòng)血液運(yùn)行所致。在使用益氣養(yǎng)陰的參芪復(fù)方后，中藥組可觀察到大鼠證候表現(xiàn)及血糖升高、血脂代謝紊亂、胰島素抵抗、大血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加和大血管組織病理改變等情況均有明顯的改善。這也從反面佐證了本研究中糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態(tài)模型的成功建立。

綜上所述，本研究在自發(fā)性糖尿病GK大鼠基礎(chǔ)上，再結(jié)合高脂飲食誘導(dǎo)的方式，初步建立了既符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué) 2 型糖尿病大血管病變特征、又含有中醫(yī)學(xué)“氣陰兩虛”特點(diǎn)的病證結(jié)合大鼠模型。此模型與臨床2 型糖尿病大血管病變氣陰兩虛型的臨床表現(xiàn)、發(fā)病機(jī)制相似，且時(shí)間較短、死亡率低、成功率高，是研究2型糖尿病大血管病變“氣陰兩虛”態(tài)的成功模型。

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Establishment of the “Qi and Yin Deficiency” Model in the Diabetic Macrovascular Diseases

LI Hai-yang1， QIN Hai-zhi1， CHAO Jun1， FANG Chuan-ming1， FU Xiao-xu1， GAO Hong2， XIE Chun-guang2△

(1．ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，ChengduSichuan610075,China; 2．AffiliatedHospital,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，ChengduSichuan610075,China)

Objective: To establish models of Qi and Yin deficiency state and syndrome in diabetes mellitus macroangiopathy.Methods: 20 Wistar rats were included in the control group, while 60 male GK rats (random blood glucose >11.1 mmol/L)were randomly divided into GK group,model group and Chinese traditional medicine(TCM) group,20 rats in each group. Control group and GK group feed ordinary,model group and TCM group eat with high fat feed.TCM group had a Chinese medicine treatment at the same time. After 5 weeks, testing fasting blood ghcose、 fasting serum insulin (FINS), insulin resistance index (HOMA IR),Total cholesterol; triglycerides and vascular endothelial cell apoptosis;caspase-3 express;Light microscope observe pathology of the Abdominal aorta.Results: compared with the control group and GK group, the blood glucose, TC,TG, insulin resistance, vascular endothelial cell apoptosis, and large blood vessels tissue pathological have significant differences.Compared with the control group, TCM group all the indexes have improved significantly.Conclusion: By feeding the GK rats with high-fat feed,models of Qi and Yin deficiency state and syndrome in type 2 diabetes mellitus macroangiopathy was successfully established．

Diabetes mellitus macroangiopathy; Qi and Yin deficiency, Animal models

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273749)-養(yǎng)陰益氣活血法阻斷糖尿病大血管病變GK大鼠代謝記憶的量效關(guān)系研究及表觀遺傳學(xué)機(jī)制；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81102589)-養(yǎng)陰益氣活血法雙向調(diào)控PI3-K信號(hào)系統(tǒng)對(duì)防治糖尿病大血管病變的拆方研究

李海洋(1985-)，男，江西信豐人，在讀博士，從事中醫(yī)藥防治內(nèi)分泌代謝病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。

△通訊作者：謝春光(1964-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)藥防治內(nèi)分泌代謝病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究，E-mail：xcg718@aliyun.com。

R587.1

B

1006-3250(2017)03-0325-04

2016-09-04