芽孢皮層肽聚糖水解物RP-HPLC法分析條件優(yōu)化

杜文斌，楊建興，師靜，孫靜，章中，*

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021；2.寧夏回族自治區(qū)食品檢測(cè)中心，寧夏銀川750001；3.寧夏出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，寧夏銀川750002）

芽孢皮層肽聚糖水解物RP-HPLC法分析條件優(yōu)化

杜文斌1，楊建興2，師靜3，孫靜1，章中1，*

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021；2.寧夏回族自治區(qū)食品檢測(cè)中心，寧夏銀川750001；3.寧夏出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，寧夏銀川750002）

通過試驗(yàn)確定RP-HPLC法分析芽孢皮層肽聚糖水解物的最佳條件如下：在Welch Ultimate AQ-C18色譜柱上，柱溫為30℃，流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為206 nm，洗脫時(shí)間為120min，以甲醇和0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH= 4.31）做流動(dòng)相，在0min～5min時(shí)使用100%磷酸鹽緩沖溶液，在5min～120min時(shí)流動(dòng)相中的甲醇濃度從0梯度增加到30%。結(jié)果表明：用RP-HPLC法分析芽孢皮層肽聚糖水解物是可行的，為研究高壓熱處理下芽孢皮層肽聚糖支架水解機(jī)理，并進(jìn)一步闡明高壓熱處理殺滅細(xì)菌芽孢的機(jī)理提供了研究方法支撐。

RP-HPLC；芽孢；皮層；肽聚糖；水解物

芽孢是芽孢桿菌屬和梭菌屬細(xì)菌在環(huán)境脅迫條件下形成的一類微生物休眠體，是影響食品安全和食品保藏的重要原因，是食品殺菌的關(guān)鍵目標(biāo)[1]。超高壓是一種重要的新型食品殺菌技術(shù)，超高壓耦合熱處理能有效殺滅芽孢，高壓熱處理下芽孢皮層肽聚糖發(fā)生了水解[2]，這是其殺滅芽孢的重要原因，但該處理下芽孢皮層肽聚糖水解的機(jī)理尚不明確，而要闡明這一機(jī)理，首先必須確定和優(yōu)化芽孢肽聚糖水解物的分析方法。

芽孢一般由胞外壁、芽孢衣、外膜、皮層、細(xì)胞壁、內(nèi)膜和內(nèi)核組成。肽聚糖是芽孢皮層的主要成分，在壓力脅迫條件下發(fā)揮保護(hù)作用，能保持超高壓條件下芽孢結(jié)構(gòu)的完好。單獨(dú)使用壓力時(shí)，1 600MPa的超高壓處理都不能殺死芽孢[3-4]。肽聚糖由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通過β-1，4糖苷鍵交替連接而成[5]，其四肽尾的氨基酸組成和肽橋因菌種而異[6]。本文使用RP-HPLC法對(duì)芽孢皮層肽聚糖水解物進(jìn)行分析鑒定，為闡明高壓熱處理下芽孢皮層肽聚糖水解機(jī)理，進(jìn)而為闡明高壓熱處理殺滅細(xì)菌芽孢的機(jī)理提供研究方法支撐。

RP-HPLC技術(shù)發(fā)展迅速[7-8]，其柱效高、使用壽命長(zhǎng)、重現(xiàn)性好、靈敏度高，幾乎對(duì)各種類型的有機(jī)化合物都有良好的選擇性，并可用于梯度洗脫[9]。推測(cè)高壓熱處理下芽孢皮層肽聚糖水解物為糖胺、胞壁酸、糖肽和氨基酸等有機(jī)物，所以從理論上推測(cè)RP-HPLC法應(yīng)能較好地分析芽孢皮層肽聚糖水解物，選擇合適的檢測(cè)條件對(duì)各種樣品的分析效果非常重要，本文對(duì)RPHPLC法分析肽聚糖水解物的條件進(jìn)行了優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；Tris（分析純）：Sigma-Aldrich公司；尿素、三氯乙酸、氯化鈣、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；十二烷基硫酸鈉（分析純）、甲醇（色譜純）：Sigma公司；鹽酸（分析純）：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；磷酸（分析純）：西安化學(xué)試劑廠；二硫蘇糖醇（分析純）、胰蛋白酶、溶菌酶：北京博奧拓達(dá)科技有限公司；L-丙氨酸（分析純）：上海瑞永生物科技有限公司；菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），編號(hào)As1.433。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1100型HPLC色譜儀及數(shù)據(jù)處理平臺(tái)：美國(guó)Agilent公司；色譜柱：Welch Ultimate AQ-C18柱（250mm×4.6mm；5μm）：美國(guó)Welch公司；UV-2450型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；KDC-2046型冷凍離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 芽孢制備

菌種用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基活化培養(yǎng)3代以上，接入試管斜面促芽孢生長(zhǎng)培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。在37℃培養(yǎng)7 d后，用接種環(huán)和無菌去離子水將試管斜面上的芽孢洗滌收集到離心管中。然后用冷的無菌去離子水離心洗滌3次（離心條件：7 000 r/min、4℃、15min）。離心后將上清液和沉淀上部一起倒掉，純化后的芽孢重懸在無菌去離子水中，濃度調(diào)整為1.5×108CFU/mL左右，放在4℃保存，一個(gè)月內(nèi)使用。

1.3.2 芽孢皮層肽聚糖提取

所有提取步驟都在離心管內(nèi)、在1mL的體積進(jìn)行，在未指明的情況下，所有離心條件均為（13 000 r/min、3min）。芽孢懸浮液離心后再用芽孢衣脫除劑在37℃處理兩次，每次60min（脫除劑組成為50mmol/L、pH= 8的Tris-Hcl緩沖液，8mol/L尿素，1%（重量/體積）的十二烷基硫酸鈉、50mmol/L二硫蘇糖醇）。脫除芽孢衣后芽孢用水洗滌5次。然后用5%的三氯乙酸在95℃處理6min以鈍化皮層裂解酶，再用1mol/L、pH8的Tris-Hcl洗滌1次，用水洗滌5次。用胰蛋白酶（0.1mg/mL、溶于20mol/L、pH8的Tris-鹽酸緩沖液和10mmol/L的氯化鈣）在37℃下消化處理16 h，將大部分蛋白質(zhì)除去，離心取沉淀。添加十二烷基硫酸鈉到1%，然后將芽孢樣品在100℃加熱15min。離心后，取沉淀物用水清洗直到上清液中沒有十二烷基硫酸鈉（大約洗滌10次），最后所得沉淀物即為芽孢皮層肽聚糖[10-14]。

1.3.3 肽聚糖水解物制備

將溶菌酶溶于12.5mmol/L、pH=5.5的磷酸鹽緩沖鹽中，活力調(diào)整為2 000U。取1.3.2所得的芽孢皮層肽聚糖在37℃的溶菌酶溶液中酶解[15-16]24 h，離心，取上清液，微孔濾膜過濾，待用。

2 結(jié)果與討論

2.1 波長(zhǎng)的選擇

用分光光度計(jì)在190 nm～400 nm波長(zhǎng)對(duì)芽孢皮層肽聚糖水解物樣品進(jìn)行全波段掃描[17]，結(jié)果如圖1。

圖1 芽孢皮層肽聚糖水解物紫外吸收光譜圖Fig.1 Theultravioletabsorption spectra of spore′s cortical peptidoglycan hydrolysate

由圖1可知，樣品溶液在195 nm處有最大吸收，鑒于RP-HPLC色譜儀紫外檢測(cè)器最小檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm，初步選擇202 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

在202 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，以甲醇和0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=4.31）做流動(dòng)相，在0min～5 min時(shí)使用100%磷酸鹽緩沖溶液，在5min～120min時(shí)流動(dòng)相中的甲醇濃度從0梯度增加到20%。結(jié)果如圖2。

圖2 芽孢肽聚糖水解物在202 nm檢測(cè)波長(zhǎng)的色譜圖Fig.2 Chromatogram of spore′scorticalpeptidoglycan hydrolysateat detection wavelength 202 nm

由圖2發(fā)現(xiàn)基線嚴(yán)重漂移，嚴(yán)重影響了分析效果?；€漂移可能是甲醇在該波長(zhǎng)下吸收大造成的，為了解甲醇在不同波長(zhǎng)下的吸收大小，隨后在190 nm～400 nm波長(zhǎng)對(duì)甲醇進(jìn)行全波段掃描，結(jié)果如圖3，甲醇在194 nm處有最大吸收。對(duì)比圖1和圖3，可發(fā)現(xiàn)隨著檢測(cè)波長(zhǎng)增加，甲醇的吸收比肽聚糖水解物的吸收下降得快，因此為減少甲醇吸收造成的干擾，將波長(zhǎng)增加到206 nm進(jìn)行檢測(cè)。

圖3 甲醇溶液紫外吸收光譜圖Fig.3 Theultravioletabsorption spectra ofmethanolsolution

2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

對(duì)于芽孢皮層肽聚糖水解物的RP-HPLC法分析，流動(dòng)相關(guān)系重大，有機(jī)溶劑的種類和濃度決定流動(dòng)相的極性，即洗脫能力[18]。流動(dòng)相中添加甲醇，可以改善洗脫效果和峰形，通過梯度改變流動(dòng)相中的甲醇濃度，各物質(zhì)會(huì)隨流動(dòng)相依次洗脫出來。為選擇最佳的甲醇濃度，在30min內(nèi)將甲醇濃度從0梯度增加到30%進(jìn)行肽聚糖水解物洗脫試驗(yàn)，結(jié)果見圖4。

如圖4所示：在206 nm下，隨著甲醇濃度增加，其吸收干擾也增加，經(jīng)綜合考慮流動(dòng)相的極性要求和甲醇的吸收情況，最終選擇甲醇濃度在5min～120min內(nèi)從0梯度增加到30%。

以甲醇和0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=4.31）做流動(dòng)相，在0 min～5 min時(shí)采用100%磷酸鹽緩沖液，在5min～120min時(shí)甲醇濃度從0梯度增加到30%，對(duì)芽孢皮層肽聚糖水解物進(jìn)行分析檢測(cè)，結(jié)果如圖5。

圖4 在30m in內(nèi)流動(dòng)相中甲醇從0梯度增加到30%的色譜圖Fig.4 Chromatogram when themethanol concentration increased gradually from 0 to 30%in 0m in-30m in

圖5 調(diào)整檢測(cè)波長(zhǎng)和流動(dòng)相后芽孢皮層肽聚糖水解物色譜圖Fig.5 Chromatogram of spore′scorticalpeptidoglycan hydrolysateafter adjusting thedetection wavelength andmobile phase

由圖5可知，流動(dòng)相能將芽孢肽聚糖水解物洗脫開，且由甲醇造成的基線漂移較小，但問題是被檢測(cè)物的出峰面積太小，各組分出峰不明顯，因此進(jìn)一步提高了芽孢肽聚糖水解物濃度后進(jìn)行RP-HPLC分析試驗(yàn)，結(jié)果如圖6。

圖6 提高濃度后芽孢皮層肽聚糖水解物色譜圖Fig.6 Chromatogram of spore′s corticalpep tidoglycan hydrolysateof increased concentration

如圖6所示：各組分出峰效果良好，峰形尖銳，峰面對(duì)稱，幾乎無拖尾現(xiàn)象，基線較穩(wěn)定，對(duì)肽聚糖水解物的分析效果良好。

在肽聚糖水解物的制備過程中，使用了溶菌酶試劑，為排除溶菌酶試劑中各成分對(duì)分析結(jié)果的干擾，在以上RP-HPLC分析條件下對(duì)溶菌酶溶液?jiǎn)为?dú)進(jìn)行分析檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示：溶菌酶溶液在此條件下基本不出峰。和圖7對(duì)比可知：圖6中所見的各個(gè)峰確為芽孢皮層肽聚糖水解物中的各種組分。

圖7 溶菌酶溶液色譜圖Fig.7 Chromatogram of lysozyme solution

3 結(jié)論

本文通過研究確定枯草芽孢桿菌芽孢皮層肽聚糖水解物的RP-HPLC法最佳分析條件為：設(shè)置Welch Ultimate AQ-C18色譜柱溫為30℃，流速為1mL/min，洗脫時(shí)間為120min，檢測(cè)波長(zhǎng)為206 nm，以甲醇和0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=4.31）作流動(dòng)相，在0～5min時(shí)采用100%磷酸鹽緩沖液，在5min～120min時(shí)甲醇濃度從0梯度增加到30%。在該條件下對(duì)芽孢皮層肽聚糖水解物的分析效果良好，下一步可用質(zhì)譜對(duì)肽聚糖水解物的各種組分做進(jìn)一步定性分析。本文的研究成果為闡明高壓熱處理下芽孢皮層肽聚糖水解機(jī)理，進(jìn)而闡明高壓熱處理殺滅細(xì)菌芽孢的機(jī)理提供了研究方法支撐。

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Optim ization of RP-PHLC Analysis Conditions for Spore's Cortical Peptidoglycan Hydrolysate

DUWen-bin1，YANG Jian-xing2，SHIJing3，SUN Jing1，ZHANGZhong1，*
（1.CollegeofAgriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，Ningxia，China；2.Ningxia Food Inspection Center，Yinchuan 750001，Ningxia，China；3.General Technology CenterofNingxia Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Yinchuan 750002，Ningxia，China）

By experiment，the optimal RP-HPLC conditions for analyzing spore's cortical peptidoglycan hydrolysate were as follows：on Welch Ultimate AQ-C18 chromatographic column，column temperature 30℃，floWspeed 1mL/min，detection wavelength 206 nm，elution time 120min，withmethanoland 0.05mol/L PBS（pH=4.31）asmobile phase，in 0min-5min 100%PBSwasused，in 5min-120min themethanol concentration increased gradually from 0 to 30%.The result indicated that itwas feasible to use RP-HPLC foranalyzing spore's cortical peptidoglycan hydrolysate，which provided researchmethod support for studying the hydrolysis principle of spore's cortical peptidoglycan under HPTS（High Pressure Thermal Sterilization）treatment，and further for clarifying the principleofspore inactivation by HPTS.

RP-HPLC；spores；cortex；peptidoglycan；hydrolysate

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.023

2016-07-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460410）

杜文斌（1991—），男（漢），碩士研究生，研究方向：新型食品殺菌技術(shù)、儀器分析。

*通信作者：章中（1977—），男（漢），副教授，博士。