海參皂苷的分離提取及分析方法研究進(jìn)展

袁煒輝，李赫宇，李倩，楊中振，趙余慶，3，*

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110016；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457；3.基于靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)與研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110016）

海參皂苷的分離提取及分析方法研究進(jìn)展

袁煒輝1，李赫宇2，李倩1，楊中振1，趙余慶1，3，*

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110016；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457；3.基于靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)與研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110016）

海參皂苷是海參的主要活性物質(zhì)之一，有巨大的開(kāi)發(fā)價(jià)值和應(yīng)用潛力。但是海參皂苷在海參中含量較少并且種類較多，不易于大量提取與分析。因此海參皂苷的大量提取與分析成為研究的熱點(diǎn)。從提取方法、分離純化方法、分析方法三個(gè)方面綜述了海參皂苷的研究進(jìn)展，為進(jìn)一步研究海參皂苷提供了線索和依據(jù)。

海參皂苷；提取；分離；分析方法

海參（Holothuria）為棘皮動(dòng)物門(mén)（Echinodermata）海參綱（Holothuroidea）動(dòng)物，主要分布于世界溫帶區(qū)和熱帶區(qū)[1]。海參味美可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的藥用價(jià)值。清代《本草綱目拾遺》中記載有“海參性溫補(bǔ)，足敵人參，故名海參”，“降火滋腎，通腸潤(rùn)燥，除勞怯癥”[2]。“滋陰、補(bǔ)血、健陽(yáng)、潤(rùn)燥、調(diào)經(jīng)、養(yǎng)胎、利產(chǎn)。產(chǎn)后、病后衰老，宜同火腿或豬羊肉煨食之”[3]。海參皂苷是海參中最早被分離出的一類皂苷成分，至今已經(jīng)有300多種被分離出來(lái)。海參皂苷，是由苷元和糖鏈通過(guò)β-糖苷鍵結(jié)合而成，主要為海參烷型（holostane），偶有非海參烷型（nonholostane）結(jié)構(gòu)[4-6]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，海參皂苷是海參的主要活性物質(zhì)之一，具有多種多樣的生理活性。這些生理活性包括：抗腫瘤作用[7]、抗真菌作用[8]、溶血作用[9]及免疫調(diào)節(jié)作用[10]等?；衔锉旧砘钚詮?qiáng)，可以作為新型藥物的候選化合物和先導(dǎo)化合物，有巨大的開(kāi)發(fā)價(jià)值和應(yīng)用潛力。本文從提取方法、分離純化方法、分析方法三個(gè)方面綜述了海參皂苷的研究進(jìn)展，為進(jìn)一步研究海參皂苷提供了參考。

1 海參皂苷的提取方法

海參皂苷極性比較大，易溶于極性大的溶劑，如甲醇，乙醇，甚至是水。與此同時(shí)，海參中含有較多的磷脂類物質(zhì)。所以在提取過(guò)程中一般采用醇提法，一方面可以去除脂肪酸，獲得較多的皂苷類成分，另一方面操作簡(jiǎn)單，成本較低。

1.1 回流提取法

回流提?。?0%乙醇提取7次）→大孔吸附樹(shù)脂（取70%乙醇餾分）或流浸膏分散在水后萃取（用正丁醇萃取6次）→將70%乙醇洗脫部分或正丁醇部分減壓回收，得到海參總皂苷[11]。

表1 海參皂苷的回流提取方法Table1 The reflux extraction of triterpeneglycosidesof sea cucumber

1.2 醇-醇提取法

甲醇回流提取3次，取濾液→提取物甲醇熱溶解，冷卻收集上清液濃縮→加苯洗滌3次，收集苯不溶物→加95%乙醇回流2次，取乙醇提取液，減壓干燥，獲得海參粗皂苷[16]。

1.3 水-醇提取法

加水煮沸3次，每次15min，取濾液→加40%乙醇，過(guò)濾沉淀物→加65%乙醇，過(guò)濾沉淀物→加95%乙醇，取乳白色渾濁，離心，加苯，除不溶物→加氯仿，除不溶物，蒸餾去除氯仿后得海參粗皂苷[16]。

1.4 水提取法

海參水提取液或海參廢棄液→1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH=10，離心收集上清液→AB-8型大孔吸附樹(shù)脂柱，離子水，50%和70%的乙醇溶液洗脫，收集70%乙醇的洗脫組分→石油醚萃取脫脂，正丁醇萃取3次→減壓濃縮至浸膏狀后進(jìn)行真空冷凍干燥，即得到水溶性海參皂苷凍干品[17-19]。

1.5 冷浸提取法

將海參制品絞碎，用85%的乙醇冷浸多次，每次3 d～7 d，減壓回收乙醇提取液得流浸膏。將流浸膏均勻分散在水中，依次用等量的石油醚，正丁醇萃取，分別得到石油醚部分和正丁醇部分，取正丁醇部分，將正丁醇部分減壓回收，得到海參總皂苷[20]。

2 海參皂苷的分離純化方法

2.1 常規(guī)柱色譜

由于海參體內(nèi)含有較多的鹽分，蛋白，多糖等成分，會(huì)影響進(jìn)一步的分離工作，而大孔吸附樹(shù)脂層析具有很好的除鹽效果，還可同時(shí)除去部分蛋白、多糖等一些水溶性雜質(zhì)。海參中化學(xué)成分復(fù)雜，并且海參皂苷的極性差別少，所以在海參皂苷的分離過(guò)程中常常需要采用兩種以上的硅膠柱系統(tǒng)和反復(fù)硅膠柱層析來(lái)達(dá)到分離目的常以氯仿-甲醇-水進(jìn)行洗脫。在海參皂苷的凝膠柱層析分離中，海參皂苷分子量比較大，極性強(qiáng)，易溶于水，并且在一些化合物中其單糖羥基常被硫酸酯化，所以極易被洗脫出來(lái)，從而可以使用羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20）更好的與脂溶性物質(zhì)或分子量小的成分如色素等分離[21]。海參皂苷的常規(guī)分離流程如圖1所示。

2.2 高效

2.2 液相層析法（HPLC）

在進(jìn)行海參皂苷分離純化時(shí)，色譜柱一般選擇以硅膠和反相硅膠作色譜柱填料的制備色譜柱，檢測(cè)器常為示差折光檢測(cè)器（RID）。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以進(jìn)行快速定性分析，并且有時(shí)候可用作定量分析，但是缺點(diǎn)是需要時(shí)間長(zhǎng)，消耗溶劑多，不適合大量分離[22-23]。

圖1 海參皂苷的提取分離流程圖Fig.1 Extraction and separation processesof sea cucumber glycosides

2.3 高效離心分配色譜或離心色譜（HPCPC或CPC）

高效離心分配色譜技術(shù)（HPCPC）是由離心色譜進(jìn)一步發(fā)展，屬于液液分配色譜，同時(shí)也是現(xiàn)代逆流色譜的一種。它的機(jī)理是是基于組分在旋轉(zhuǎn)螺旋管內(nèi)的相對(duì)移動(dòng)而互不混溶的兩相溶劑間分配系數(shù)不同而獲得分離，不需要用固體支撐體。其優(yōu)點(diǎn)是：避免物質(zhì)對(duì)固定相的不可逆吸附，失活，操作成本低，制備量大，操作靈活[24]。其步驟包括溶劑系統(tǒng)及樣品溶液的制備，固定相（溶劑系統(tǒng)上相）的填充，流動(dòng)相（溶劑系統(tǒng)下相）及樣品溶液的加入。Yadollah Bahrami等采用高效離心分配色譜技術(shù)（HPCPC），溶劑系統(tǒng)為CHCl3∶MeOH∶H2O-0.1%HCO2H（7∶13∶8），對(duì)一些海參皂苷的同分異構(gòu)體取得很好的分離，且減少有機(jī)溶劑的消耗[25-26]。

3 海參皂苷的定性方法

3.1 光譜學(xué)方法

質(zhì)譜常用于海參皂苷分子量的確定，以及皂苷糖鏈上單糖的連接順序。由于皂苷類成分具有難揮發(fā)性，一般的硬電離技術(shù)在皂苷的應(yīng)用上難以發(fā)揮，所以海參皂苷一般采用軟電離技術(shù)，如正或負(fù)離子快原子轟擊質(zhì)譜（FAB-MS），場(chǎng)解析質(zhì)譜（FD-MS）等。隨著聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)質(zhì)譜儀（MALDIMS/MS）和電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-MS/MS）等串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)開(kāi)始成功應(yīng)用于海參皂苷的定性檢測(cè)上，串聯(lián)質(zhì)譜方法簡(jiǎn)單，快捷，為海參皂苷的定性檢測(cè)提供很大幫助[27]。核磁共振譜可分為核磁共振氫譜（1H-NMR），核磁共振碳譜（13C-NMR）和二維核磁共振譜（2DNMR），它們是測(cè)定海參皂苷結(jié)構(gòu)的主要依據(jù)。

3.2 液質(zhì)聯(lián)用法

于林芳[28]等利用HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，其中質(zhì)譜儀為Q-TOF質(zhì)譜儀，采用負(fù)離子模式檢測(cè)，毛細(xì)管電壓為3.0 kV；錐孔電壓60 V；掃描范圍為200m/z～2 000m/z，對(duì)8種海參體內(nèi)皂苷類化合物進(jìn)行定性分析。通過(guò)質(zhì)譜數(shù)據(jù)獲得各皂苷成分的精確分子質(zhì)量，分子式和碎片離子的裂解信息，最后與HPLC-DAD圖譜和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，對(duì)海參體內(nèi)的部分已知皂苷進(jìn)行鑒定。

Roman S.Popov等[29]通過(guò)HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，利用梯度洗脫的方法，在海星體內(nèi)Patiria pectinifera發(fā)現(xiàn)兩種海參皂苷類成分，并且通過(guò)總離子流的保留時(shí)間和對(duì)其準(zhǔn)分子離子峰以及其裂解方式進(jìn)行解析，最終確定為cucumariosides F1和F2，并確認(rèn)這兩種海參皂苷的來(lái)源。這體現(xiàn)了HPLC-MS/MS在海參皂苷定性分析的作用。與此同時(shí)，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)也是區(qū)分同分異構(gòu)體的主要方法。海參皂苷類苷元結(jié)構(gòu)類似，糖單元組成相近，容易出現(xiàn)同分異構(gòu)體。Séverine Van Dyck等[30]采用液質(zhì)聯(lián)用方法對(duì)海參Holothuria forskali進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)同分異構(gòu)體，其中有13個(gè)為新化合物。

HPLC芯片技術(shù)是一種新興的色譜分析技術(shù)，通常與質(zhì)譜聯(lián)用。HPLC-芯片/質(zhì)譜工作流程可將整個(gè)分析周期（糖鏈斷裂，質(zhì)譜分析）縮短為幾十分鐘，這將極大地提高藥物分析的效率。Karen Grace V.Bondoc[31]等采用nano-HPLC-chip Q-TOFMS對(duì)三種海參進(jìn)行同分異構(gòu)體分析，其中液相條件：C18微流芯片柱（40 nL富集柱，43mm×0.075mm分析柱），流動(dòng)相A：10%甲醇（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B：100%甲醇（含0.1%甲酸），梯度洗脫，納米泵到分析柱流速為300 nL/min，質(zhì)譜條件：正離子掃描，記錄質(zhì)荷比范圍400 m/z～2 000m/z，基準(zhǔn)質(zhì)荷比范圍680.035m/z～1 279.995m/z，檢測(cè)出多種海參皂苷的同分異構(gòu)體，HPLC-芯片/質(zhì)譜技術(shù)為發(fā)現(xiàn)具有新型結(jié)構(gòu)的海參皂苷提供重要依據(jù)。

4 海參皂苷的定量方法

4.1 顯色劑顯色法

顯色劑顯色法是采用紫外-可見(jiàn)分光光度法，以齊墩果酸或海參皂苷Echinoside A為對(duì)照品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，5%香草醛-冰醋酸為顯色劑，檢測(cè)波長(zhǎng)為546nm～560 nm，最后通過(guò)比色法測(cè)定總皂苷含量的一種方法[32]。

4.2 HPLC-ELSD法

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）對(duì)于沒(méi)有紫外吸收的皂苷類化合物的含量檢測(cè)提供了有力的幫助。張然等以三萜皂苷Holotoxin A1為對(duì)照品，醋酸銨溶液（氨水調(diào)pH=7.00）：乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD），漂移管溫度為60℃，建立三萜皂苷Holotoxin A1的HPLC-ELSD檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)在0.2μg/mL～25μg/mL線性關(guān)系良好（R2=0.999），檢測(cè)限為0.05μg/mL[33]。

4.3 溶血活性試驗(yàn)

海參皂苷具有溶血活性，所以有人也采用該特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行定量分析。Séverine Van Dyck等先采用離心法和磷酸緩沖溶液（PBS）對(duì)牛血液反復(fù)洗滌，制得紅細(xì)胞懸液。在紅細(xì)胞懸液中加入海參皂苷，37℃培養(yǎng)1 h后進(jìn)行離心，在540 nm下測(cè)懸液的吸光度。采用其他具有溶血活性皂苷類成分作為對(duì)照品，最后進(jìn)行比較[27]。

4.4 PMP衍生化法

由于海參皂苷上的D-異鼠李糖（D-quinovose）屬于還原糖，可以與PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）試劑反應(yīng)，形成紫外吸收強(qiáng)的PMP-quinovose，并且在HPLC檢測(cè)中與其他PMP糖類衍生物有很好的分離效果，所以可用于定量檢測(cè)。Dong Ping等以D-異鼠李糖（D-quinovose）作為對(duì)照品，經(jīng)過(guò)HPLC（流動(dòng)相為22%的乙腈的磷酸氫鉀緩沖液，pH為5.2，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm）分析后作標(biāo)準(zhǔn)曲線，接著對(duì)海參皂苷進(jìn)行提取分離及用三氟乙酸進(jìn)行酸水解，除去苷元，收集經(jīng)過(guò)水解的糖單元并與PMP試劑反應(yīng)，然后經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)海參皂苷中D-異鼠李糖（D-quinovose）的含量，最后通過(guò)公式校正確定海參皂苷的含量。其方法在6.56mg/L～164mg/L。時(shí)具有良好的線性關(guān)系（R2= 0.995），重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，定量限和定性限分別為1.122mg/L和4.42mg/L[34]。

4.5 液質(zhì)聯(lián)用法

宋姍姍等[35]采用液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)血清中海參皂苷Echinoside A，以皂苷單體Echinoside A為標(biāo)準(zhǔn)品，采用選擇離子監(jiān)測(cè)掃描（SIM），流動(dòng)相為乙腈-0.1%碳酸銨水梯度洗脫，質(zhì)譜條件為負(fù)離子掃描，毛細(xì)管電壓3.5 kV，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)海參皂苷單體Echinoside A，在0.3μg/mL～20μg/mL濃度范圍內(nèi)，單體濃度與液質(zhì)SIM模式下峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，并從小鼠血液中檢測(cè)到Echinoside A，由此知海參皂苷Echinoside A可經(jīng)消化道吸收，為海參皂苷在保健食品及藥物中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。GuoDan等[36]則以洛伐他丁酸為內(nèi)標(biāo)物，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），建立了LC-MS/MS的方法測(cè)定小鼠體內(nèi)中海參皂苷nobiliside A的濃度，液相條件為甲醇-水（80∶20）等梯度洗脫，質(zhì)譜條件去簇電壓：-101.00V；射入電壓：-303.00 V；碰撞能：-130.00 V；碰撞室出口電壓：-7.00 V，發(fā)現(xiàn)nobilside A的血漿濃度在50 ng/mL～5 000 ng/mL（R2= 0.994 6）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可作為海參皂苷nobilside A體內(nèi)分析的重要依據(jù)。

5 結(jié)論

海參作為保健品，市場(chǎng)需求量大，同時(shí)隨著研究的深入，海參皂苷在預(yù)防和治療疾病方面越來(lái)越受人關(guān)注，其作為藥物的先導(dǎo)化合物的潛力巨大。當(dāng)前海參皂苷的研究主要集中在對(duì)不同海參中海參皂苷單體化合物的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定和生理活性研究方面，至今已有多種海參皂苷的結(jié)構(gòu)以及其活性得到闡明。但是對(duì)于海參皂苷的提取分離和分析方面研究相對(duì)較少，現(xiàn)在還處于實(shí)驗(yàn)室階段。在分離提取方面，缺乏對(duì)新技術(shù)的應(yīng)用，提取率低，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)，但是我們可以借助植物皂苷類的提取分離方法，用于海參皂苷的分離。在分析方面，液質(zhì)聯(lián)用的發(fā)展對(duì)化合物的含量測(cè)定和定性分析上發(fā)揮著越來(lái)越大的作用，它不需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜繁瑣的預(yù)處理，具有高效快速、靈敏度高，尤其適于不易分離得到、分離度低或在分離過(guò)程中容易丟失的組分等一系列優(yōu)點(diǎn)，對(duì)海參皂苷的分析有重大的意義。因此，在海參皂苷的提取分離及分析方面的研究還需進(jìn)一步加強(qiáng)。

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Research Progress on Extraction，Separation and AnalyticalM ethod of Triterpene Glycosides of Sea Cucumber

YUANWei-hui1，LIHe-yu2，LIQian1，YANGZhong-zhen1，ZHAOYu-qing1，3，*
（1.College of TraditionalChineseMedicine，Shenyang PharmaceuticalUniversity，Shenyang 110016，Liaoning，China；2.Tianjin Ubasichealth Nutrition Co.，Ltd.，Tianjin，300457；3.Key Laboratory ofStructure-Based DrugDesign and Discovery，MinistryofEducation，Shenyang PharmaceuticalUniversity，Shenyang 110016，Liaoning，China）

Sea cucumber glycosideswasmain active substance of sea cucumber，which had great development value and potential application.But the content of the sea cucumber glycosides in sea cucumber was loWand structurewas complicated，difficult to fully extractand analyse.So the sea cucumber glycosidesextraction and analysis has become a hot research topic.In this paper，the research progress of Sea cucumber glycosideswas discussed from itsextraction，purification and analyticalmethod.Itprovided good cluesand evidence for further study on sea cucumberglycosides.

seacucumberglycosides；extraction；separation；analyticalmethod

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.050

2016-07-30

袁煒輝（1993—），男（漢），碩士研究生，研究方向：中藥化學(xué)。

*通信作者