藍(lán)莓提取物中功效成分含量測(cè)定方法的探討

曾榮華，劉翠紅，羅明琍，李菁，王小妹

（中藥提取分離過程現(xiàn)代化國家工程研究中心，廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司，廣東廣州510240）

藍(lán)莓提取物中功效成分含量測(cè)定方法的探討

曾榮華，劉翠紅，羅明琍，李菁，王小妹

（中藥提取分離過程現(xiàn)代化國家工程研究中心，廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司，廣東廣州510240）

對(duì)藍(lán)莓提取物開展原花青素，前花青素，花青素、花色苷含量測(cè)定。以保健食品中原花青素、前花青素含量測(cè)定方法及國際商務(wù)部標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定原花青素，前花青素，花青素、花色苷含量。藍(lán)莓提取物中測(cè)定原花青素含量是127.8%，前花青素含量是226.8%，花青素含量25.4%，花色苷含量未測(cè)出，藍(lán)莓提取物中以花青素類含量測(cè)定方法較合適。

藍(lán)莓提取物；原花青素；花青素

藍(lán)莓含有大量的花色苷、類黃酮等多酚類生理活性成分，其抗氧化能力很強(qiáng)，具有促進(jìn)視紅素再合成、抗炎癥、提高免疫力、抗心血管疾病、抗衰老、抗癌等多種生理功效[1]，在食品、醫(yī)藥、健康產(chǎn)品等領(lǐng)域中應(yīng)用已經(jīng)是熱點(diǎn)和焦點(diǎn)之一。以藍(lán)莓為主要原料開發(fā)的產(chǎn)品集中于保護(hù)視力，但是功效成分報(bào)道有以花青素、花色苷、原花青素或前花青素為功效性成分，說法各不一，未有明確功效成分指標(biāo)。

花青素、花色苷屬于生物類黃酮物質(zhì)，花色苷是花青素接上各種糖基后的衍生物，而原花青素、前花青素是多酚類聚合物，這幾種功效成分結(jié)構(gòu)截然不同。本研究目的是采用原花青素方法、前花青素、花青素及花色苷方法對(duì)藍(lán)莓中功效成分進(jìn)行含量測(cè)定，以確定適宜的功效成分含量測(cè)定方法，明確藍(lán)莓中功效成分標(biāo)示。同時(shí)本研究為其它同類產(chǎn)品選擇功效成分提供一種指標(biāo)標(biāo)示的參考。

1 材料

1.1 儀器與試劑

UV-2550型紫外分光光度計(jì)：日本島津；2695型高效液相色譜儀：美國Waters公司；藍(lán)莓提取物、原花青素對(duì)照品（純度＞95%）：尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；歐洲越橘提取物對(duì)照品（批號(hào)：Y0001059）：歐洲藥典；甲醇、鹽酸等分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藍(lán)莓提取物中測(cè)定原花青素含量

對(duì)照品制備方法：取原花青素對(duì)照品13.68 mg，至10 mL容量瓶中，吸取該溶液0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，各取1 mL測(cè)定。將正丁醇與鹽酸按95∶5的體積比混合后，取出6 mL置于具塞錐瓶中，再加入0.2 mL硫酸鐵銨溶液和1 mL對(duì)照品溶液，混勻，置沸水浴回流，精確加熱40 min后，立即置冰水中冷卻，在加熱完畢15 min后，于546 nm波長處測(cè)吸光值。

樣品制備方法：取樣品50 mg置于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇超聲20 min，放冷到室溫后，加甲醇至刻度，搖勻，放置澄清后取上清液2 mL，用甲醇定容至25 mL。與對(duì)照品測(cè)定方法相同，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原花青素的含量。藍(lán)莓提取物中的原花青素含量測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 藍(lán)莓提取物中的原花青素含量測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination of proanthocyanidins in blueberry extracts

由表1的測(cè)定數(shù)據(jù)可知：用保健食品中的測(cè)定原花青素方法測(cè)定藍(lán)莓中的原花青素，原花青素是127.8%，遠(yuǎn)超過樣品的本身含量，因藍(lán)莓提取物溶解于甲醇中，顯紫紅色，而原花青素對(duì)照品甲醇溶液沒有顏色，在進(jìn)行紫外測(cè)定吸光值時(shí)，導(dǎo)致藍(lán)莓中的原花青素測(cè)定值偏高，此方法不適合應(yīng)用于有顏色的原料或產(chǎn)品中原花青素含量測(cè)定。

2.2 藍(lán)莓提取物中測(cè)定前花青素含量

測(cè)定方法：保健食品中前花青素的測(cè)定[3]。

精密稱定對(duì)照品10 mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（因無前花青素對(duì)照品，采用原花青素對(duì)照品），用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中。

吸取該溶液0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。各取2 mL測(cè)定。

將正丁醇與鹽酸按95∶5的體積比混后，取出15 mL置于具塞錐瓶中，再加入0.5 mL硫酸鐵銨溶液和2 mL試樣溶液，混勻，置沸水浴回流，精確加熱40 min后，立即置冰水中冷卻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，待進(jìn)高效液相色譜分析。

取樣品25 mg置于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇超聲20 min，放冷到室溫后，加甲醇至刻度，搖勻，取1 mL至10 mL，定容。處理方法同對(duì)照品。藍(lán)莓提取物中的前花青素含量測(cè)定結(jié)果見表2。

2.3 術(shù)前準(zhǔn)備 術(shù)前3 d給予流質(zhì)飲食。手術(shù)前晚做好腸道及術(shù)區(qū)皮膚準(zhǔn)備，清潔灌腸、床上擦浴、供皮區(qū)及受皮區(qū)備皮。術(shù)日當(dāng)天禁食。

圖1 前花青素對(duì)照品液相圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of procyanidins standard

表2 藍(lán)莓提取物中的前花青素含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination of procyanidins in blueberry extracts

前花青素對(duì)照品液相圖譜見圖1，藍(lán)莓提取物前花青素液相色譜圖見圖2。

由圖1與圖2可知，前花青素對(duì)照品與藍(lán)莓提取物前花青素對(duì)照品色譜圖出峰位置一致，峰形一致，是因?yàn)闇y(cè)定方法的原理是依據(jù)試樣中前花青素單體或聚合物在加熱的酸性條件和鐵鹽催化作用下，C-C鍵斷裂而生成深紅色花青素離子即氰定的原理，藍(lán)莓中以花青素為主，原花青素氰定后也以花青素為存在方式，因此前花青素對(duì)照品液相圖譜與藍(lán)莓提取物液相圖譜一致。但是采用此方法不能作為藍(lán)莓提取物中的前花青素含量，由表2可知，用此方法測(cè)得的前花青素含量是226.8%，超過100%，因?yàn)樗{(lán)莓提取物甲醇溶液紫紅色，存在顏色干擾，導(dǎo)致測(cè)定值不能反映藍(lán)莓提取物中的前花青素含量。

圖2 藍(lán)莓提取物前花青素液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of blueberry extract

2.3 藍(lán)莓提取物中測(cè)定花色苷含量

測(cè)定方法：越橘提取物國際商務(wù)標(biāo)準(zhǔn)[4]。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：取歐洲越橘提取物對(duì)照品125mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加2%鹽酸-甲醇溶液，并稀釋至刻度，搖勻。準(zhǔn)確移取2 mL的上述溶液于10 mL量瓶中，用10%磷酸溶液定容，配成標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

供試品溶液制備：同標(biāo)準(zhǔn)品制備。

歐洲越橘提取物對(duì)照品的花色苷液相圖譜見圖3，藍(lán)莓提取物中的花色苷液相圖譜見圖4。

圖3 歐洲越橘提取物對(duì)照品的花色苷液相圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of bilberry extract standard

圖4 藍(lán)莓提取物中的花色苷液相圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of blueberry extract

由圖3及圖4可知，歐洲越橘提取物對(duì)照品色譜圖上超過10個(gè)色譜峰，藍(lán)莓提取物只有兩個(gè)色譜峰，且出峰時(shí)間與歐洲越橘提取物對(duì)照品出峰時(shí)間不一致，因藍(lán)莓提取物中的花色苷與歐洲越橘提取物中的花色苷結(jié)構(gòu)不一致，因此測(cè)定藍(lán)莓提取物中的色苷不能采用此方法。

2.4 藍(lán)莓提取物中測(cè)定花青素含量

測(cè)定方法：越橘提取物國際商務(wù)標(biāo)準(zhǔn)[4]。

精密稱定供試品50 mg，置50 mL體積棕色容量瓶中，加入2%鹽酸甲醇溶液30 mL，超聲溶解，冷卻至室溫，用2%鹽酸甲醇溶液定容。精密吸取2 mL至25 mL量瓶中，取5 mL到25 mL量瓶中，以2%鹽酸甲醇作空白進(jìn)行540 nm處測(cè)定吸光度A。藍(lán)莓提取物中花青素的含量測(cè)定結(jié)果見表3。

3 討論

越橘、藍(lán)莓、黑果枸杞等水果中都有花色苷，但是花色苷種類是否一致，在對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)時(shí)需進(jìn)一步確定。前花青素與原花青素都是黃烷醇類成分，但是目前并無有資質(zhì)機(jī)構(gòu)出售相應(yīng)對(duì)照品，因此這兩種檢測(cè)方法可操作性不強(qiáng)。盡管現(xiàn)在已經(jīng)有原花青素B1、B2等單體對(duì)照品，但是對(duì)照品昂貴，對(duì)于生產(chǎn)中實(shí)操性還存在一定的問題。花色苷只適應(yīng)歐洲越橘提取物的測(cè)定，花青素測(cè)定適合性廣泛，但其檢測(cè)方法較粗糙，對(duì)于存在多種成分的制劑，采用此方法進(jìn)行含量測(cè)定準(zhǔn)確性需進(jìn)行驗(yàn)證。在對(duì)花青素類產(chǎn)品進(jìn)行功效成分含量測(cè)定時(shí)，需廣泛調(diào)研文獻(xiàn)、藥典、標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)確證，明確原料中的功效成分衡量指標(biāo)，再開展功能因子含量分析，為產(chǎn)品質(zhì)量提供保障。

表3 藍(lán)莓提取物中花青素的含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination of anthocyanins in blueberry extracts

由表3可知，采用花青素方法，藍(lán)莓提取物中的花青素測(cè)定結(jié)果為25.4%，與市售的25%藍(lán)莓提取物規(guī)格一致。表明用此方法確定藍(lán)莓提取物中花青素含量是可行的，但是此方法無對(duì)照品，對(duì)于以藍(lán)莓提取物為主要原料開發(fā)的產(chǎn)品，用此方法衡量產(chǎn)品中花青素含量準(zhǔn)確度欠妥。

[1] 陳介甫,李亞東,徐哲.藍(lán)莓的主要化學(xué)成分及生物活性[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2010,45(4):422-429

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范[M].北京:衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司,2003:274-275

[3] 中華人民共和國衛(wèi)生部,中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 22244-2008保健食品中前花青素的測(cè)定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008:1-3

[4]中國醫(yī)藥保健品進(jìn)出口商會(huì).植物提取物國際商務(wù)標(biāo)準(zhǔn)集[M].北京:中國商務(wù)出版社,2016:182-211

Investigation on Determination of Functional Ingredient in Blueberry Extract

ZENG Rong-hua，LIU Cui-hong，LUO Ming-li，LI Jing，WANG Xiao-mei
（National Engineering Research Center for Modernization of Extraction and Separation Process of TCM，Guangzhou Baiyunshan Hanfang Pharmaceutical Company Limited，Guangzhou 510240，Guangdong，China）

Determination of proanthocyanidins，procyanidins，anthocyanins and anthocyanin in blueberry extract were studied.The determinations were carried out with proanthocyanidins and procyanidins'content methods of function food and National Ministry of commerce standard.Content of proanthocyanidins was 127.8% ，content of procyanidins was 226.8%.Content of anthocyanins was 25.4%.Anthocyanin content was not measured.Determination of anthocyanins was suitable for blueberry extract.

blueberry extract；proanthocyanidins；anthocyanins

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.029

2016-08-15

廣東省科學(xué)技術(shù)廳應(yīng)用型科技研發(fā)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2015B020234001）

曾榮華（1978—），女（漢），工程師，碩士，從事健康產(chǎn)品研究。