鐮形棘豆總生物堿抗腫瘤活性部位的體外篩選

陳 醒，駱雨璇，王 楠

鐮形棘豆總生物堿抗腫瘤活性部位的體外篩選

陳 醒，駱雨璇，王 楠

目的 篩選出鐮形棘豆總生物堿抗腫瘤的主要活性部位。 方法 將鐮形棘豆生物堿粗提部位經(jīng)萃取后按照極性大小分為二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位，采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法觀察各部位對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC?7721、人肺癌細(xì)胞A549、人胃癌細(xì)胞MKN?45、人結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO、人宮頸癌細(xì)胞HeLa以及人乳腺癌細(xì)胞MDA?MB?231等6種人癌細(xì)胞株增殖的影響。 結(jié)果 總生物堿的正丁醇部位幾乎沒(méi)有抑制細(xì)胞增殖的作用，乙酸乙酯部位抑制作用比較弱，而二氯甲烷部位顯示有較明顯地抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，且對(duì)6種細(xì)胞都有效。此外，不同的腫瘤細(xì)胞株對(duì)同一藥物的敏感性也各不相同，人肺癌細(xì)胞A549和人乳腺癌細(xì)胞MDA?MB?231對(duì)藥物有較高的敏感性。 結(jié)論 鐮形棘豆抗腫瘤的活性部位為總生物堿的二氯甲烷部位。

鐮形棘豆；抗腫瘤；總生物堿；四甲基偶氮唑鹽

鐮形棘豆為豆科棘豆屬（Oxytropis D.C.）植物鐮形棘豆（Oxytropis falcata Bunge）的干燥全草，藏藥名為莪達(dá)夏［1］。其味辛、性寒，有小毒，入肺、脾二經(jīng)，具有清熱解毒、生肌愈瘡、澀脈止血、抗炎止痛、通利大便等功效，用于治療流感、扁桃體炎、黃水病、創(chuàng)傷、骨傷疼痛等，享有“草藥之王”的美譽(yù)［2］。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)棘豆屬植物中黃花棘豆、小花棘豆生物堿均具有良好的抗腫瘤活性［3，4］，我們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)鐮形棘豆總生物堿具有明顯的抗腫瘤作用，其機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的［5］。筆者將鐮形棘豆生物堿粗提部位經(jīng)萃取后按照極性大小分為二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位，采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法觀察各部位對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC?7721、人肺癌細(xì)胞A549、人胃癌細(xì)胞MKN?45、人結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO、人宮頸癌細(xì)胞HeLa以及人乳腺癌細(xì)胞MDA?MB?231等6種人癌細(xì)胞株增殖的影響，以期篩選出鐮形棘豆抗腫瘤的活性部位，為鐮形棘豆抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 AE240電子分析天平（METTLER?TOLE?DO）；TD10001型電子天平（天津市天平儀器有限公司）；TGL?16臺(tái)式高速離心機(jī)（金壇市醫(yī)療儀器廠）；Rotavapor R?205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（瑞士Büchi公司）；SHB?Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；DZF?6050型真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；多功能提取罐、單效濃縮器（江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部）；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（FORMA，THER?MO）；Bio?Rad 680酶標(biāo)分光光度讀板儀（USA）；BP211D精密電子分析天平（Startorius）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；OLYMPUS倒置顯微鏡（Japan）；WH?861型旋渦混合器（江蘇省太倉(cāng)市科教器材廠）；離心機(jī)（JingLiLDS?10B）；HH?4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar）。

1.2 材料與試藥 鐮形棘豆原植物來(lái)源于青海省共和縣，2012年7月采收，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉訓(xùn)紅教授鑒定為豆科棘豆屬植物鐮形棘豆（Oxytropis falcata Bunge）的干燥全草。DMEM培養(yǎng)基（GIBCO，美國(guó)）；RPMI 1640培養(yǎng)基（GIBCO，美國(guó)）；新生牛血清（56℃水浴滅活 0.5 h）；胰酶（GIBCO，美國(guó)）；MTT（Amresco，美國(guó)）；青霉素、鏈霉素（山東魯抗藥業(yè)公司）；0.1 mmol／L磷酸鹽緩沖液（PBS；pH7.2～7.4，自制）；二甲基亞砜（DMSO，Amresco，國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、氨水、濃鹽酸等（均為分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）；純凈水（南京中天凈水有限公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞株SMMC?7721、人肺癌細(xì)胞株 A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞 LOVO、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人胃癌細(xì)胞株MKN?45和人乳腺癌細(xì)胞MDA?MB?231由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

1.4 方法

1.4.1 樣品的準(zhǔn)備 鐮形棘豆藥材40 kg，加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇約480 L，于室溫下冷浸過(guò)夜，次日回流提取3次，分別為2.5、1.5、1 h，減壓抽濾，收集濾液，于50℃下減壓回收乙醇，并進(jìn)一步濃縮成浸膏（5 kg）；藥渣再加入體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇約480 L，于室溫下冷浸過(guò)夜，次日回流提取3次，分別為2.5、1.5、1 h，減壓抽濾，收集濾液；于50℃下減壓回收乙醇，濃縮成浸膏。取95%乙醇提取所得浸膏（3.8 kg），加入1%的鹽酸溶液10 L，室溫下攪拌成懸浮狀，離心，取上清液，加入二氯甲烷（1 L×9）反復(fù)振搖提取除去色素后，加入濃氫氧化鈉溶液調(diào)堿性為pH 9～10，然后依次以二氯甲烷（1 L×20）、乙酸乙酯（1 L ×20）、正丁醇（1 L×20）反復(fù)振搖提取至提取液接近無(wú)色，分取各有機(jī)溶劑振搖提取液和最后所得的殘余液，分別減壓濃縮至干，得到二氯甲烷部位提取濃縮物（11.86 g）、乙酸乙酯部位提取濃縮物（20.80 g）以及正丁醇部位提取濃縮物（688.05 g），供實(shí)驗(yàn)用。

1.4.2 樣品處理 分別取二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的干浸膏各50 mg，加入二甲基亞楓（DMSO）100 μL，渦旋使溶解，分別作為二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的儲(chǔ)備液，用時(shí)稀釋。DMSO的最終濃度不超過(guò)0.1%。將配制好的不同濃度的藥物以0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，4℃保存待用。

1.4.3 MTT比色法［6］取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化，吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度2×105個(gè)／mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，在細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)融合至50%～70%時(shí)加藥處理，每種藥物設(shè)5個(gè)濃度梯度，使藥物終濃度分別為25、50、100、250、500 μg／mL，每孔100 μL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組（含相同濃度的DMSO）。空白對(duì)照組加入等體積的無(wú)血清培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組只含有細(xì)胞，并未加藥，陽(yáng)性對(duì)照組加入不同濃度（5、10、15 μg／mL）的順鉑PBS溶液，每孔100 μL，同樣設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別于給藥24、48、72 h后，每孔加入12 μL濃度為5 mg／mL的MTT溶液，平面混勻后，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，然后棄去各孔中的上清液，再加入100 μL DMSO，平面振蕩混勻10 min，待其各孔中的紫色結(jié)晶完全溶解后，置于酶標(biāo)分光光度讀板儀下測(cè)定各孔中的吸光度值（OD，λ490nm）。按下面公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：

細(xì)胞抑制率 ＝（1－實(shí)驗(yàn)組OD值／對(duì)照組OD值）× 100%

2 結(jié) 果

2.1 鐮形棘豆生物堿各極性部位對(duì)SMMC?7721體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià) 研究發(fā)現(xiàn)二氯甲烷部位抑制作用較明顯，乙酸乙酯部位次之，而正丁醇部位的抑制作用比較弱。其中，二氯甲烷部位抑制SMMC?7721細(xì)胞增殖的 IC50（μg／mL）分別為 736.63（12 h）、480.30（24 h）、296.96（48 h）、237.87（72 h）。見(jiàn)圖1。

2.2 鐮形棘豆生物堿各極性部位對(duì)A549體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià) 乙酸乙酯部位和正丁醇部位無(wú)抑制A549細(xì)胞增殖的作用，而二氯甲烷部位的抑制作用顯著。給藥后隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，二氯甲烷部位對(duì)A549的抑制增殖作用增強(qiáng)，且呈劑量依賴關(guān)系。尤其給藥48 h及72 h后，劑量依賴關(guān)系明顯。其IC50（μg／mL）分別為11950.00（24 h）、76.64（48 h）、47.89（72 h）。見(jiàn)圖2。

2.3 鐮形棘豆生物堿各極性部位對(duì)MKN?45體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià) 乙酸乙酯部位和正丁醇部位沒(méi)有抑制MKN?45細(xì)胞增殖的作用，而二氯甲烷部位抑制作用比較顯著，高劑量（500 μg／mL）時(shí)，抑制作用與陽(yáng)性藥順鉑相當(dāng)。當(dāng)藥物濃度較低時(shí)，隨著劑量的增加，二氯甲烷部位對(duì)MKN?45細(xì)胞增殖的抑制作用增加并不明顯，當(dāng)藥物濃度達(dá)到100 μg／mL以上時(shí)，呈明顯的劑量依賴關(guān)系。其IC50（μg／mL）分別為 761.02（24 h）、257.32（48 h）、138.76（72 h）。 見(jiàn)圖3。

圖1 各組藥物對(duì)SMMC?7721細(xì)胞增殖的影響

圖2 各組藥物對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

圖3 各組藥物對(duì)MKN?45細(xì)胞增殖的影響

2.4 鐮形棘豆生物堿各極性部位對(duì)LOVO體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià) 正丁醇部位沒(méi)有顯示抑制LOVO細(xì)胞增殖的作用，乙酸乙酯部位作用較弱，二氯甲烷部位作用比較顯著，且呈明顯的劑量依賴關(guān)系。其IC50（μg／mL）分別為205.86（24 h）、88.90（48 h）、93.42（72 h）。見(jiàn)圖4。

2.5 鐮形棘豆生物堿各極性部位對(duì)HeLa體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià) 乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖的抑制作用很弱，二氯甲烷部位抑制作用比較顯著。當(dāng)藥物濃度較低時(shí)，隨著劑量的增加，二氯甲烷部位對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用增加并不明顯，當(dāng)藥物濃度達(dá)到100 μg／mL以上時(shí)，呈明顯的劑量依賴關(guān)系。其IC50（μg／mL）分別為 4201.70（24 h）、129.07（48 h）、113.03（72 h）。見(jiàn)圖5。

2.6 鐮形棘豆生物堿各極性部位對(duì)MDA?MB?231體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià) 正丁醇部位對(duì)MDA?MB?231的增殖無(wú)明顯的抑制作用，乙酸乙酯部位抑制作用很弱，而二氯甲烷部位抑制作用比較顯著，且呈明顯的劑量依賴關(guān)系，高劑量（500 μg／mL）時(shí)，對(duì)MDA?MB?231細(xì)胞增殖的抑制作用與陽(yáng)性藥順鉑相當(dāng)。其IC50（μg／mL）分別為1267.98（24 h）、104.63（48 h）、50.14（72 h）。見(jiàn)圖6。

圖4 各組藥物對(duì)LOVO細(xì)胞增殖的影響

圖5 各組藥物對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

圖6 各組藥物對(duì)MDA?MB?231細(xì)胞增殖的影響

3 討 論

筆者通過(guò)對(duì)生物堿粗提物3個(gè)不同極性部位進(jìn)行體外抗腫瘤篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正丁醇部位幾乎沒(méi)有抑制細(xì)胞增殖的作用，乙酸乙酯部位抑制作用比較弱，而二氯甲烷部位顯示了較明顯的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，且對(duì)6種細(xì)胞都有效，因此確定了鐮形棘豆抗腫瘤的活性部位為總生物堿的二氯甲烷部位。這可能與各部位的生物堿種類和含量有關(guān)。前期薄層色譜發(fā)現(xiàn)，鐮形棘豆中二氯甲烷部位生物堿種類多，紫外分光光度法對(duì)各部位生物堿含量進(jìn)行測(cè)定也表明二氯甲烷部位生物堿含量為0.08 mg／g，較乙酸乙酯部位（0.05 mg／g）、正丁醇部位（0.002 mg／g）多。此外，不同的腫瘤細(xì)胞株對(duì)同一藥物的敏感性也各不相同，通過(guò)對(duì)6種人癌細(xì)胞進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，人肺癌細(xì)胞A549以及人乳腺癌細(xì)胞MDA?MB?231對(duì)藥物有較高的敏感性。在作用72 h后，二氯甲烷部位抑制A549及MDA?MB?231的IC50分別為47.89 μg／mL和50.14 μg／mL，為今后進(jìn)一步進(jìn)行鐮形棘豆抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)研究及機(jī)制研究提供了科學(xué)的依據(jù)與參考。此外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)正丁醇部位抑制率呈現(xiàn)部分負(fù)值的情況，可能和正丁醇部位含有的其它成分有關(guān)，有待于進(jìn)一步考證。

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Screening of anti?tumor parts from the total alkaloids of Oxytropis falcata Bunge

CHEN Xing，LUO Yu?xuan，WANG Nan

（Department of Pharmacy，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region，PLA，Nanjing210002，Jiangsu，China）

Objective To select anti?tumor activity fraction from the total alkaloids ofOxytropis falcataBunge. Methods The crude alkaloids extracts fromOxytropis falcataBunge were divided into three fractions according to the polarity：dichloromethane fractions，ethyl acetate fractions and n?butanol fractions.Then the three fractions were screened on human hepatocellular cancer SMMC?7721 cells，human lung cancer A549 cells，human gastric cancer MKN?45 cells，human colon cancer LOVO cells，human cervix cancer HeLa cells and human mammary adenocarcinoma MDA?MB?231 cells to evaluate the anti?tumor fractions. Results The n?butanol fraction almost did not inhibit cell proliferation，and inhibition of ethyl acetate extract was relatively weak.However，the dichloromethane fraction showed a more significant inhibition of tumor cell proliferation activity.In addition，different tumor cells have different sensitivity to the same drug.The study showed that A549 human lung cancer cells and human breast cancer cell line MDA?MB?231 had a higher sensitivity to the drug. Conclusion The dichloromethane fractions are the anti?tumor fractions from the total alkaloids ofOxytropis falcataBunge.

Oxytropis falcata；Anti?tumor；Total alkaloids；MTT

R285.5

A

1672?271X（2017）01?0037?05

10.3969／j.issn.1672?271X.2017.01.010

2016?12?14；

2017?01?05）

（本文編輯：葉華珍； 英文編輯：王建東）

210002 江蘇南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥品科

王 楠，E?mail：njpilicewn＠163.com

陳 醒，駱雨璇，王 楠.鐮形棘豆總生物堿抗腫瘤活性部位的體外篩選［J］.東南國(guó)防醫(yī)藥，2017，19（1）：37?41.