六味地黃濃縮丸HPLC指紋圖譜研究

李志龍

摘 要：目的：就六味地黃濃縮丸HPLC指紋圖譜開展研究分析。方法：選用Dikma Diamonsil C18色譜柱，流動相梯度洗脫為乙腈-水，其中乙腈內(nèi)所含磷酸的比例為0.05%，水中所含磷酸的比例為0.05%。研究中將柱溫控制在40℃并掌握好流速。在不同的時間段內(nèi)檢測波長也存在一定差異，以20μL為進樣量。本次實驗研究中選取規(guī)范的色譜峰指認方法，即Q-TOF-MS-IDA-MS/MS。結(jié)果：實驗結(jié)果顯示，此種方法能夠?qū)灿蟹逯械?8個色譜峰進行定性鑒別，具有良好的精密度和穩(wěn)定性。以此種方式對六味地黃濃縮丸進行測定，可見相似度在0.96以上。結(jié)論：本次HPLC指紋圖譜研究為六味地黃濃縮丸的質(zhì)量評價提供可靠的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：六味地黃濃縮丸；HPLC；指紋圖譜；質(zhì)量評價

六味地黃是中藥中的經(jīng)典名方，以滋陰補腎受到廣泛關(guān)注，該方主要由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉等成分依照標準質(zhì)量比所組成。隨著醫(yī)學的不斷進步，現(xiàn)代藥理研究也更為深入，發(fā)現(xiàn)六味地黃方對內(nèi)分泌以及免疫系統(tǒng)具有良好的調(diào)節(jié)作用，其優(yōu)良的藥理作用主要體現(xiàn)在抗氧化、抗衰老以及改善腎功能等多個方面，以此方位基礎(chǔ)不斷改進后所形成的六味地黃加減方，在臨床醫(yī)學上發(fā)揮著重要的作用。為加強六味地黃丸質(zhì)量控制，本文旨在通過對六味地黃濃縮丸進行HPLC指紋圖譜研究，以提高色譜峰指認的合理性，為六味地黃濃縮丸的質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

1 材料

本次研究中所選用的儀器設(shè)備主要有高效液相色譜儀、超聲清洗器、電子天平以及數(shù)據(jù)傳力軟件。研究中所選用的六味地黃濃縮丸是來自河南某制藥公司的不同批次藥品。丹皮酚購自食品藥品檢定研究院，水為純凈水，乙腈和甲醇為色譜純，磷酸與甲酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 制備單味藥材供試品溶液

自S1-S10號中分別稱取0.5g六味地黃濃縮丸樣品，置于標準規(guī)格的錐形瓶內(nèi)，在50℃條件下，進行時長15min的超聲提取三次，第1次加甲醇進行提取，后兩次分別加入甲醇提取，在2500r·min-1離心條件下，25min后對提取液進行合并定容。

精密吸取上述溶液1.0mL并加以濃縮除醇厚，以1.0mL純水進行復溶，之后對該溶液進行精密吸取100μL，加入至完全活化的3.0mLSPE柱中，分別以1.0mL水和甲醇進行洗脫處理，可以得到甲醇洗脫液，待0.45μm微孔濾膜過濾后方可進行HPLC分析。除此之外，茯苓、山藥、澤瀉、熟地黃等在粉碎后稱取標準量藥材粉末，依照上述方法進行操作，即可制得單味藥材供試品溶液。

2.2 色譜條件

DikmaDiamonsilC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相乙腈（A，含0.05%磷酸）-水（B，含0.05%磷酸），梯度洗脫，0～5.5min，4%A；5.5～10min，4%～5%A；10～26min，5%～30%A；26～33min，30%～32%A；33～42min，32%～80%A；42～53min，80%～90%A。柱溫40℃；流速1.0mL·min-1；檢測波長276nm（0～10min），236nm（10～40min），276nm（40～60min）；進樣量20μL。

2.3 質(zhì)譜條件

本次實驗研究中，以ESI源作為離子源，為保證正負離子數(shù)據(jù)采集的可靠性，采用一級全掃描的方式，并掌握好數(shù)據(jù)采集速度，最好在5Hz左右，將掃描范圍控制在m/z100-1000。以最多對一級質(zhì)譜圖中10個母離子的MS/MS質(zhì)譜圖作為信息采集工作模式開展數(shù)據(jù)收集，源溫度為600℃最佳，霧化氣應當為414Pa，卷簾氣為214Pa。除此之外，在操作中應當保持動態(tài)背景扣除處于開啟狀態(tài)。

2.4 指紋圖譜的建立以及共有指紋峰的指認

為更好的建立指紋圖譜，應當取供試品溶液20μL，依照標準色譜條件進行測定，可得出不同批次下六味地黃濃縮丸HPLC指紋圖譜，依據(jù)不同色譜峰相對保留時間，可以確定共有峰，進一步依據(jù)特征指紋峰建立指紋圖譜，如圖1所示。

六味地黃濃縮丸HPLC指紋圖譜中明顯顯示，共有指紋峰22個，其中16號峰為參照風，以此為依據(jù)能夠?qū)Σ煌V峰的保留時間以及保留面積進行準確計算，便于其與同一圖譜中參照峰的保留時間以及保留面積參數(shù)值進行對比分析。計算后的相對保留時間與相對峰面積見表1、2。

在對共有指紋峰進行準確指認的基礎(chǔ)上，應當對共有指紋峰的來源進行合理確認。這就需要研究人員對六味地黃濃縮丸提取液HPLC圖與山藥、茯苓、熟地黃等單味藥提取液HPLC圖進行對比分析，在指紋峰保留時間的對比下可以明確不同單味藥的特征峰。其中，1號、5號和15號共有峰為熟地黃的特征峰，2號、4號共有峰為酒制山茱萸和熟地黃的特征峰，3號為酒制山茱萸和牡丹皮的特征峰，除此之外，6-9號和10-14號、18-19號為酒制山茱萸特征峰。10，16，17，21號共有峰為牡丹皮的特征峰；20號共有峰為牡丹皮和澤瀉的特征峰；22號共有峰為茯苓、山藥、澤瀉、牡丹皮的特征峰。

2.5 方法學考察

精密度試驗中，取同一供試品溶液連續(xù)測定5次，考察各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果相對保留時間的RSD<0.7%，相對峰面積RSD<4.0%（7，17號峰RSD為5.0%～13%），表明儀器穩(wěn)定，精密度良好。

穩(wěn)定性試驗中，取同一供試品溶液分別在0，2，6，12，24h測定其指紋圖譜，考察各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果相對保留時間的RSD<0.50%，相對峰面積RSD<5.0%（6，7，8，15號峰RSD為7.0%～13%），表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗中，平行處理同一批次樣品5份，分別測定，考察各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果相對保留時間的RSD<0.90%，相對峰面積RSD<4.0%（7，17號峰RSD為7.0%～28%），表明該方法重復性良好。

上述方法學考察試驗中，個別色譜峰RSD，較大，分析其原因主要為六味地黃濃縮丸成分較復雜，且指紋圖譜基線不平穩(wěn)，同時上述色譜峰峰面積相對于其他色譜峰較小，造成工作站系統(tǒng)自動積分誤差，采用手動積分可盡量減小誤差。

3 討論

研究表明，中藥的質(zhì)量控制是一項復雜的工作，由于其組成屬性為多組分，因此在質(zhì)量控制的過程中應當全面的反映出其物質(zhì)組成屬性，也就是說，應當中藥的提取、純化處理以及分析條件的選擇，都是比較重要的環(huán)節(jié)，應當確保中藥中所含多組分得以準確表征出來，從而加強中藥質(zhì)量控制。中藥指紋圖譜是現(xiàn)代科學技術(shù)不斷進步的基礎(chǔ)上所形成的一種分析方法，能夠全面、定量的將中藥中所包含的化學信息技術(shù)反映出來，但在實際應用中仍有待進一步完善。通過本次研究可知，采用雙波長切換法能夠更加準確的將不同波長下的色譜信息進行記錄，提高色譜峰的豐富性，從而清晰且準確的反映出六味地黃濃縮丸的質(zhì)量。

參考文獻

[1] 高新彪，孫磊，喬善義，高松，車彥忠.六味地黃濃縮丸HPLC指紋圖譜研究[J].中國中藥雜志，2012，37（22）：3411-3415.

[2]高新彪.六味地黃濃縮丸化學成分指紋圖譜研究[D].沈陽藥科大學，2012.