實時熒光聚合酶鏈式反應檢測肉制品中的鴨源性成分

摘 要：通過鴨的肌動蛋白β-actin保守基因設(shè)計可特異檢測鴨肉成分的引物和探針，建立實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測鴨肉的方法，并通過模擬肉樣和市售樣品檢測方法的準確性和適用性。結(jié)果表明：該方法可以特異性檢測出麻鴨和草鴨成分，而對豬、牛、羊、雞等DNA均沒有擴增，檢測靈敏度可達到1 pg DNA;通過模擬肉樣檢測確定最低質(zhì)量分數(shù)檢測限為0.01%;市售樣品的檢測結(jié)果表明，該方法能很好地應用于市場，滿足市場檢測需求。

關(guān)鍵詞：實時熒光聚合酶鏈式反應;鴨肉;靈敏度;檢測限

Detection of Duck-Derived Ingredients in Meat Products by Real-time Fluorescent Polymerase Chain Reaction

ZHANG Xiuping1， MIAO Li2，*

（1.Identification Consulting Center of Henan Inspection and Quarantine， Zhengzhou 450003， China;

2.Henan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Zhengzhou 450003， China）

Abstract： According to the conserved sequence of the duck β-actin gene， specific primers and probes were designed， and a real-time polymerase chain reaction （PCR） assay was developed for detecting duck-derived ingredients in meat products. Its accuracy and applicability were evaluated using model and commercial meat samples. Results showed that this method could specifically detect duck-derived ingredients and could not amplify porcine， bovine， ovine and chicken DNA. Its limit of detection was 1 pg of DNA. The minimum detectable level was 0.01% for model meat samples. The results obtained from detection of commercial meat samples showed that this method can meet the requirements for the requirements for the detection of duck-derived components in meat products.

Keywords： real-time fluorescent polymerase chain reaction; duck; sensitivity; detection limit

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201807007

中圖分類號：TS207.3 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2018）07-0037-05

引文格式：

食品的質(zhì)量和安全問題日益成為社會關(guān)注的焦點，隨著人們生活水平的提高，肉制品消費已經(jīng)成為食品消費的重要組成[1-3]，而目前利用摻雜摻假、以次充好等手段制造“假羊肉”、“假牛肉”事件屢屢出現(xiàn)[4]。檢驗檢疫部門有必要加強對于肉及肉制品的檢測，以確保國內(nèi)消費者的權(quán)益得到保護。

在食品中動物源性成分鑒定方面，實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)憑借其高度靈敏性和特異性，已逐步成為肉類成分鑒別的重要技術(shù)[5-7]。楊麗霞等[8]根據(jù)鴨線粒體基因序列的位點差異設(shè)計特異性引物，采用SYBR Green Ⅰ染料，通過溶解曲線分析，建立熒光定量PCR檢測方法。史艷宇等[9]以鴨線粒體基因全序列為靶位點設(shè)計引物和探針，建立鴨源性成分檢測方法，檢測靈敏度可達0.1 μg/kg。

β-actin基因是構(gòu)成細胞骨架的主要成分，具有基因序列高保守性，并且在不同組織間可以穩(wěn)定表達[10-12]。當前研究中多選用線粒體基因，線粒體DNA由于豐度高且在不同組織部位的含量不一致，容易導致定量結(jié)果偏差較大，而β-actin基因作為單拷貝基因，具有基因序列高保守性，在肉源性成分定性及定量方面具有重要參考價值。

本研究通過從GenBank數(shù)據(jù)庫中查找序列并設(shè)計鴨特異的PCR引物和探針，建立快速、準確的實時熒光PCR技術(shù)檢測方法，為食品市場檢測構(gòu)建技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮鴨肉、豬肉、牛肉、羊肉、雞肉以及鴨肉制品

鄭州市某農(nóng)貿(mào)市場;蛋白酶K（20 mg/mL） 日本TaKaRa公司;Tris-飽和酚、氯仿-異戊醇（24∶1） 北京

索萊寶生物科技有限公司;組織裂解液（1 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS））、75%無水乙醇 自配;所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI 7500熒光定量PCR儀 美國應用生物系統(tǒng)公司;DT500電子天平 江蘇常熟長青儀器廠;Hermle Z36HK高速冷凍離心機 德國哈默公司;NTS-4000AM恒溫振蕩水槽 上海斯信有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

采用酚-氯仿法提取樣品的基因組DNA，具體步驟參考文獻[13-14]進行，最后加入100 μL TE緩沖液溶解DNA，然后采用核酸定量測定儀測定提取肉樣的DNA含量。

1.3.2 引物和探針設(shè)計

通過核酸比對軟件DnamaN對GenBank中公布的多個物種的β-actin基因共17 個序列進行比對，其中包括5 個鴨源β-actin基因（GenBank中的登錄號分別為EF667345.1、NM_001310421.1、GU564232.1、AY251275.1和DQ675572.1）、3 個雞源β-actin基因（GenBank中的登錄號分別為L08165.1、NM_205518.1和JF436880.1）、3 個豬源β-actin基因（GenBank中的登錄號分別為DQ452569.1、DQ845171.1和U07786.1）、3 個羊源β-actin基因（GenBank中的登錄號分別為NM_001009784.1、U39357.1和AF035422.1）、2 個牛源β-actin基因（GenBank中的登錄號分別為AY141970.1和BT030480.1）和1 個鵝源β-actin基因（GenBank中的登錄號為M26111.1），篩選出鴨β-actin基因的特異序列，并運用Primer 5.0軟件（加拿大Premier開發(fā)公司）設(shè)計鴨源性成分的特異性引物和探針。引物和探針均由上海輝睿生物科技有限公司合成。引物和探針序列如表1所示。

1.3.3 熒光PCR反應程序

反應體系為25 μL：2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL（反應體系終濃度0.2 μmol/L）、探針1 μL（反應體系終濃度

0.4 μmol/L）、DNA模板2 μL，其余用滅菌雙蒸水補齊。反應循環(huán)參數(shù)為：95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，58 ℃、45 s;40 個循環(huán)。

1.3.4 引物與探針的特異性驗證

以從豬、牛、羊、馬、雞、驢、狐貍、狗、老鼠、鵪鶉中提取的DNA作為模板，進行實時熒光PCR反應，以驗證所設(shè)計各引物和探針體系的特異性。

1.3.5 靈敏度實驗

提取純鴨肉粉DNA，調(diào)整DNA模板的初始質(zhì)量濃度為100 ng/μL，用滅菌雙蒸水分別進行10 倍倍比稀釋，然后分別取2 μL各稀釋度的稀釋液為模板，同時設(shè)置陰性對照，進行實時熒光PCR，檢測所設(shè)計引物、探針的靈敏度。

1.3.6 檢測下限的確定

取總質(zhì)量為10 g的肉粉，在雞肉基質(zhì)中添加質(zhì)量分數(shù)為0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%的鴨肉粉，用研磨機進行混樣，得到梯度質(zhì)量分數(shù)的鴨肉粉樣品;稱取100 mg樣品進行DNA提取和熒光PCR擴增，根據(jù)實驗結(jié)果確定檢測下限。

1.3.7 市售樣品的檢測

為驗證該方法在實際樣品檢測中的可應用性，購買市售的10 個生產(chǎn)廠家的鴨肉加工制品，運用本方法進行驗證，同時運用SN/T 3731.5—2013《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分 鴨成分檢測 PCR法》[15]中的方法進行驗證，比較實驗結(jié)果是否一致。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，利用Excel軟件進行圖表編輯，采用聯(lián)合國糧農(nóng)組織（United Nations Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）方法規(guī)定統(tǒng)一的檢測數(shù)據(jù)評價標準，即相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）≤25%。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取與濃度測定

提取DNA的OD260 nm/OD280 nm值在1.7～2.0之間，完全符合實時熒光PCR的要求。

2.2 特異性測定結(jié)果

由圖1可知，麻鴨和草鴨的DNA均有擴增，而豬、牛、羊、馬、雞、驢、狐貍、狗、老鼠、鵪鶉等其他物種的DNA均沒有擴增，表明鴨的引物和探針特異性良好，可以用于熒光PCR檢測。

2.3 靈敏度測定結(jié)果

分別利用麻鴨和草鴨的5 個質(zhì)量濃度梯度的DNA稀釋液（0.1、0.01、0.001、0.000 5、0.000 1 ng/?L）為模板，對建立的實時熒光PCR檢測體系進行靈敏度實驗和可重復性分析。

由表2～3可知：當樣品質(zhì)量濃度為0.000 1 ng/?L時，在20 次擴增反應中，麻鴨和草鴨陽性擴增次數(shù)分別為4 次和9 次，不滿足檢出率≥95%（即20 次擴增，陽性結(jié)果≥19 次）;當樣品質(zhì)量濃度為0.000 5 ng/?L時，在20 次擴增反應中，所有鴨樣本均得到20 次陽性結(jié)果，滿足檢出率≥95%，且RSD≤25%，故鴨樣品可穩(wěn)定檢出的最低質(zhì)量濃度均為0.000 5 ng/?L，即最低DNA質(zhì)量濃度為1 pg DNA（模板量2 ?L）。

2.4 方法檢測限

由圖2和表4可知：當雞肉粉中的鴨肉粉質(zhì)量分數(shù)為0.01%時，3 次平行測定中均能夠檢出鴨源性成分，平均Ct值34.97;而當雞肉粉中的鴨肉粉質(zhì)量分數(shù)為0.001%時，平均Ct值38.18，數(shù)值較高，不利于判定，因此本方法檢測雞肉粉中的鴨肉粉質(zhì)量分數(shù)檢出限為0.01%。

2.5 市售樣品的檢測

由圖3可知，6 份標識有鴨成分的加工品中能夠檢出鴨源性的為5 份，其中1 份未檢出麻鴨和草鴨成分，與標準檢測結(jié)果一致，表明市面上可能存在假冒的鴨肉產(chǎn)品。

3 討 論

動物產(chǎn)品的質(zhì)量安全涉及畜牧業(yè)的健康發(fā)展，其安全和質(zhì)量越來越受到公眾的關(guān)注，而傳統(tǒng)的依靠感官和經(jīng)驗鑒別的手段已經(jīng)不能滿足市場需求，建立準確、快速、有效的動物源性成分檢測方法是研究熱點[16-18]。

基于PCR和實時熒光PCR方法檢測飼料和肉制品中的動物源性成分已得到了較多關(guān)注和研究[19-20]。何瑋玲等[21]運用動物細胞色素b（cytochrome b，cytb）基因的差異性位點，建立了豬、牛、羊和雞的快速鑒別方法;陳冬等[22]運用牛線粒體12S rRNA基因設(shè)計通用引物，成功鑒別混合鮮牛肉及制品中的牛種來源，但是對于鴨源成分的檢測研究不多。曲莉等[23]采用改良鹽析法和柱層析法有效提取鴨肉的mtDNA，通過在GenBank中下載綠頭鴨線粒體cytb基因序列進行比對，設(shè)計檢測鴨源成分的引物，擴增產(chǎn)物大小為223 bp。SN/T 3731.5—2013以及楊滴等[24]的研究主要應用普通PCR技術(shù)對鴨源性成分進行檢測，普通PCR技術(shù)費時費力，容易污染，逐步被熒光定量PCR方法取代[25-27]。因此，迫切需要建立新的鴨源性成分檢測方法及標準，以滿足實際檢測的需要。

動物特異性基因具有物種特異性，有望成為肉類成分定性檢測的良好靶點[28-30]。本研究根據(jù)羊、牛、豬、雞、鵝5 種動物肌動蛋白β-actin基因序列的位點差異設(shè)計鴨特異性引物和探針，進行熒光定量PCR擴增檢測。結(jié)果表明，所篩選的引物和探針只對鴨的DNA產(chǎn)生特異性擴增曲線，而與豬、牛、羊、馬、雞、驢、狐貍、狗、老鼠、鵪鶉10 種動物的DNA無擴增，特異性較好。通過對DNA梯度稀釋液進行測定顯示，該方法的重復性好，靈敏度可低至1 pg，避免了因提取過程中DNA含量過低而出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象。而在實際檢測中，肉制品中鴨源成分的質(zhì)量分數(shù)更能接近市場需求，因此，本研究通過制作模擬肉樣，確定了最低檢出質(zhì)量分數(shù)，為我國肉制品市場的規(guī)范化和有序化管理提供了必要的技術(shù)支撐，對政府部門的監(jiān)督管理工作具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究利用鴨的β-actin基因保守序列，建立用于檢測鴨成分的實時熒光PCR方法。經(jīng)測試，建立的檢測方法特異性強、靈敏度高，方法檢測限為1 pg DNA和質(zhì)量分數(shù)0.01%，且具有良好的可重復性，能夠滿足日常檢測的需求。對于市售樣品的檢測結(jié)果表明，5 份標注含鴨成分的實際樣本中均能檢出鴨成分，有1 份包裝鹵鴨肉產(chǎn)品未檢出鴨成分，表明產(chǎn)品可能存在摻假現(xiàn)象。

參考文獻：

[1] LOPEZ C I， GONZALEZ I， FAJARDO V， et al. Quantitative detection of goats milk in sheeps milk by real-time PCR[J]. Food Control， 2007， 8（11）： 1466-1473. DOI： 10.1016/j.foodcont.2006.11.006.

[2] ALI M E， HASHIM U， KASHIF M， et al. Development of swine-specific DNA markers for biosensor-based halal authentication[J]. Genetics and Molecular Research， 2012， 11（2）： 1762-1772. DOI：10.4238/2012.June.29.9.

[3] 付理文， 張宇， 依含， 等. TaqMan多重實時熒光PCR同步定量檢測6 種動物源性成分方法的建立[J]. 中國生物工程雜志， 2017， 37（9）： 48-59. DOI：10.13523/j.cb.20170907.

[4] 李巧玲， 劉景艷. 市場鮮豬肉摻假狀況的調(diào)查監(jiān)測[J]. 食品科學， 2004， 25（10）： 273-276.

[5] KOPPEL R， DANIELS M， FELDERER N， et al. Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from duck， goose， chicken， turkeyand pork[J]. European Food Research and Technology， 2013， 236： 1093-1098. DOI：10.1007/s00217-013-1973-2.

[6] 高琳， 徐幸蓮， 周光宏. PCR技術(shù)用于食品中原料肉物種鑒別的研究進展[J]. 肉類研究， 2006， 20（10）： 19-21.

[7] ALI M E， HASHIM U， MUSTAFA S， et al. Analysis of pork adulteration in commercial meatballs targeting porcine-specific mitochondrial cytochrome b gene by TaqMan probe real-time polymerase chain reaction[J]. Meat Science， 2012， 91（4）： 454-459. DOI：10.1016/j.meatsci.2012.02.031.

[8] 楊麗霞， 宋濤平， 謝曉紅， 等. SYBR Green Ⅰ實時PCR技術(shù)鑒定鴨源性成分的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)通報， 2013， 29（11）： 16-19.

[9] 史艷宇， 劉金華， 吳月丹， 等. 熒光定量PCR方法檢測畜肉食品中鴨源性成分[J]. 食品安全質(zhì)量檢測報， 2013， 4（6）： 1859-1864.

[10] 劉岑杰， 劉彥泓， 楊滴， 等. 肉制品中鴨源性成分的實時熒光PCR檢測[J]. 肉類工業(yè)， 2015（1）： 51-53. DOI：10.3969/j.issn.1008-5467.2015.01.016.

[11] KESMEN Z， CELEBI Y， GULLUCE A， et al. Detection of seagull meat in meat mixtures using real-time PCR analysis[J]. Food Control， 2013， 34（1）： 226-231. DOI：10.1016/j.foodcont.2013.04.006.

[12] 苗麗， 李志娟， 王珊， 等. 肉制品中牛源性成分熒光定量聚合酶鏈式反應方法的建立與應用[J]. 肉類研究， 2015， 29（9）： 30-33.

[13] CAI Yicun， LI Xiang， L? Rong， et al. Quantitative analysis of pork and chicken products by droplet digital PCR[J]. Bioed Research International， 2014（8）： 1-6. DOI：10.1155/2014/810209.

[14] 苗麗， 張秀平， 陳靜， 等. 微滴數(shù)字PCR法定量檢測肉制品中羊源性成分的研究[J]. 食品工業(yè)科技， 2016， 37（4）： 73-76.

[15] 中國檢驗檢疫科學研究院， 中華人民共和國深圳出入境檢驗檢疫局， 深圳市檢驗檢疫科學研究院. 食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分 鴨成分檢測PCR法： SN/T 3731.5—2013[S]. 北京： 中國標準出版社， 2013.

[16] KARABASANAVAR N S， SINGH S P， KUMAR D， et a1. Detection of pork adulteration by highly-specific PCR assay of mitochondrial D-loop[J]. Food Chemistry， 2014， 145： 530-534. DOI：10.1016/j.foodchem.2013.08.084.

[17] NICOLAI Z B， FINN K V， ANDERS H K. Species determination： can we detect and quantify meat adulteration？[J]. Meat Science， 2009， 83： 165-174. DOI：10.1016/j.meatsci.2009.06.003.

[18] 張娟， 宗卉， 張利平. PCR-mtDNA技術(shù)鑒別檢測不同動物肌肉組織和飼料中鴨源性成分[J]. 生物工程學報， 2008， 24（10）： 1832-1836. DOI：10.3321/j.issn：1000-3061.2008.10.025.

[19] PEGELS N， GONZALEZ I， LOPEZ C I， et al. Evaluation of a TaqMan real-time PCR assay for detection of chicken， turkey， duck， and goose material in highly processed industrial feed samples[J]. Poultry Science， 2012， 91（7）： 1709-1719. DOI：10.3382/ps.2011-01954.

[20] 金萍， 丁洪流， 李培， 等. 實時熒光PCR快速篩選食品中鴨源性成分[J]. 食品工業(yè)科技， 2013， 34（18）： 61-63; 67. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2013.18.041.

[21] 何瑋玲， 黃明， 張弛. 食品中肉類成分種屬鑒別技術(shù)研究進展[J]. 食品科學， 2012， 33（3）： 304-307.

[22] 陳冬， 柏凡， 周明亮， 等. 基于線粒體12S rRNA基因鑒別混合牛肉及制品的牛種來源[J]. 遺傳， 2008， 30（8）： 1008-1014.

[23] 曲莉， 李瀟涵， 王雪松， 等. 7 種肉類線粒體DNA的提取及鴨源性成分檢測[J]. 食品研究與開發(fā)， 2015， 36（20）： 107-110.

[24] 楊滴， 劉彥泓， 劉岑杰， 等. 飼料中鴨源組織成分PCR檢測方法的研究[J]. 飼料研究， 2013（10）： 74-76. DOI：10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2013.10.019.

[25] 張晶鑫， 高玉時， 范艷鳳. 利用PCR技術(shù)鑒別畜禽肉中鴨源性成分研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學， 2015， 43（34）： 202-203. DOI：10.3969/j.issn.0517-6611.2015.34.076.

[26] SEVILLA A， MOLINA E， TELLO M， et al. Detection of mycobacteria by culture and DNA-based methods in animal-derived food products purchased at Spanish supermarkets[J]. Front Microbiol， 2017， 9（8）： 1030. DOI：10.3389/fmicb.2017.01030.

[27] ALERT E， JURG R， KOPPEL R. Quantification of beef， pork， chicken and turkey proportions in sausages： use of matrix-adapted standards and comparison of single versus multiplex PCR in an interlaboratory trial[J]. European Food Research and Technology， 2009， 230： 55-61. DOI：10.1007/s00217-009-1138-5.

[28] 計紅， 李鵬， 楊煥民. 動物特異性基因篩選方法研究的新進展[J]. 生物學雜志， 2004， 21（2）： 7-9. DOI：10.3969/j.issn.2095-1736.2004.02.003.

[29] GHOVVATI S， NASSIRI M R， MIRHOSEINI S Z， et al. Fraud identication in industrial meat products by multiplex PCR assay[J]. Food Control， 2009， 20（8）： 696-699. DOI：10.2174/2212798409666170113151213.

[30] 李楠， 王佳慧， 沈青， 等. 北京地區(qū)牛、羊肉片中鴨、雞、豬源性成分調(diào)查[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志， 2014， 26（3）： 227-232. DOI：10.13590/j.cjfh.2014.03.006.