HPLC法測(cè)定白龍散中龍膽苦苷和小檗堿的含量

包愛(ài)情 ， 朱聰英 ， 陸春波 ， 林仙軍

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所， 浙江杭州311101)

HPLC法測(cè)定白龍散中龍膽苦苷和小檗堿的含量

包愛(ài)情 ， 朱聰英 ， 陸春波 ， 林仙軍

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所， 浙江杭州311101)

建立反向高效液相色譜法檢測(cè)白龍散中龍膽苦苷和小檗堿含量的方法。試驗(yàn)采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) ，以0.5%三乙胺水溶液(用85%磷酸調(diào)pH值至3.0)-甲醇(60:40，v:v)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；龍膽苦苷和小檗堿的含量測(cè)定范圍分別為4.09～102.2 μg/mL(R=0.999 7)，3.93～98.26 μg/mL(R=1.000 0)；加樣平均回收率分別為 98.63%，97.78%；RSD分別為0.96%，1.23%；該方法方便、準(zhǔn)確、可靠，適用于測(cè)定白龍散中龍膽苦苷和小檗堿的含量。

白龍散； 高效液相色譜； 龍膽苦苷； 小檗堿

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，配Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司； XS-205電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 甲醇為色譜純，Merck 公司；其余試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為milli-Q 超純水。龍膽苦苷對(duì)照品(來(lái)源：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：Z0250510，含量：100.0%)；鹽酸小檗堿對(duì)照品(來(lái)源：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：110713—200911，含量：按小檗堿計(jì)為86.8%)。白龍散供試品(批號(hào)分別為20160101，20160102，20160103)，由浙江某廠生產(chǎn)；自制樣品：中藥飲片，購(gòu)自上藥凱侖醫(yī)藥股份有限公司；經(jīng)浙江省獸藥飼料監(jiān)察所鑒定，按相應(yīng)處方自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18XDB(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.5%三乙胺水溶液(用85%磷酸調(diào)pH值至3.0)-甲醇(60∶40)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取龍膽苦苷對(duì)照品10.22 mg和鹽酸小檗堿對(duì)照品11.32 mg，置同一100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液(約為100 μg/mL)。精密量取20 mL混合對(duì)照品貯備液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。

2.2.2 供試品溶液 取白龍散0.1 g，精密稱(chēng)定，置100 mL圓底燒瓶中，精密加甲醇50 mL，稱(chēng)重，回流1 h，冷卻至室溫，用甲醇補(bǔ)足重量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按處方比例分別自制不含龍膽和黃連的散劑，按其工藝制成相應(yīng)的陰性對(duì)照樣品，再按2.2.2方法制備成陰性對(duì)照溶液。

數(shù)據(jù)是計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，也是計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)的核心元素。在計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)運(yùn)行的過(guò)程當(dāng)中，數(shù)據(jù)會(huì)產(chǎn)生諸多漏洞，而不法分子則會(huì)利用這些數(shù)據(jù)漏洞來(lái)攻擊計(jì)算機(jī)，致使計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生安全風(fēng)險(xiǎn)。如存在于計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)運(yùn)行過(guò)程中的節(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)，其就極易遭到攻擊，數(shù)據(jù)信息被竊取、篡改的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，致數(shù)據(jù)完整性遭到破壞。部分不法分子還會(huì)在數(shù)據(jù)脆弱部分對(duì)其進(jìn)行攻擊，通過(guò)攻擊此部分內(nèi)容來(lái)窺探內(nèi)網(wǎng)的數(shù)據(jù)信息，致內(nèi)網(wǎng)數(shù)據(jù)遭到泄漏。此外，利用數(shù)據(jù)漏洞還可給計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)植入木馬、病毒等，致系統(tǒng)癱瘓，無(wú)法運(yùn)行。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液貯備液、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液注入液相色譜儀，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，記錄龍膽苦苷和小檗堿的光譜圖(圖1～圖2)；同時(shí)記錄混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液的色譜圖(圖3～圖6)。該色譜條件下，龍膽苦苷和小檗堿分離度良好，與其他峰分離良好，理論塔板數(shù)均大于3 000。陰性樣品在混合對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置上無(wú)吸收峰，表明處方中的其他成分對(duì)測(cè)定結(jié)果并無(wú)干擾，滿(mǎn)足定量檢測(cè)需要。注：圖中峰1：龍膽苦苷；峰2：小檗堿。

圖1 龍膽苦苷光譜圖

圖2 小檗堿光譜圖

圖3 混合對(duì)照品270 nm色譜圖

圖4 樣品270 nm色譜圖

圖5 自制陰性樣品(缺龍膽)270 nm色譜圖

圖6 自制陰性樣品(缺小檗堿)270 nm色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線(xiàn)性范圍 精密量取混合對(duì)照品貯備液(約100 μg/mL)適量，分別用甲醇稀釋成約40、20、10、10、4 μg/mL系列溶液，分別精密量取上述混合對(duì)照品貯備液及相應(yīng)稀釋的溶液10 μL，按上述色譜條件，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值(Y)對(duì)濃度(X，μg/mL)進(jìn)行線(xiàn)性回歸計(jì)算，方程為：

龍膽苦苷： Y=6219.4X-1868.8(R=0.999 7)，線(xiàn)性范圍4.09～102.2 μg/mL;

小檗堿： Y=40,370.3X-16,246.4(R=1.000 0)，線(xiàn)性范圍3.93～98.26 μg/mL。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL,按上述色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次記錄峰面積，計(jì)算結(jié)果，龍膽苦苷和小檗堿峰面積的RSD分別為0.28%，0.32%。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)：20160101)，分別在0、1、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算龍膽苦苷和小檗堿的峰面積的RSD分別為1.01%、1.07%。結(jié)果表明，供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品(批號(hào)：20160101)，分別稱(chēng)取6份，照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定供試品溶液中龍膽苦苷和小檗堿的含量。結(jié)果測(cè)得龍膽苦苷的含量分別為25.86、25.72、25.70、25.93、25.49、25.74 mg/g；小檗堿的含量分別為8.44、8.76、8.66、8.56、8.52、8.69 mg/g；RSD分別為0.57%、1.38%。結(jié)果表明，此方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知龍膽苦苷和小檗堿含量的樣品(批號(hào)：20160101) 0.05 g，共6份，置100 mL圓底燒瓶中，精密加對(duì)照品溶液(稱(chēng)取龍膽苦苷對(duì)照品13.26 mg和鹽酸小檗堿對(duì)照品5.02 mg于同一500 mL容量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度)50 mL，其余按2.2.2項(xiàng)同法處理后，測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 白龍散回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.5 樣品測(cè)定 取不同批號(hào)的白龍散，按2.2.2項(xiàng)下方法處理，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品中龍膽苦苷和小檗堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g)n=3

3 討論與小結(jié)

3.1 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

3.1.1 波長(zhǎng)的優(yōu)化 在波長(zhǎng)選擇上，通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器(PDA)在200 nm～400 nm進(jìn)行了全掃描，結(jié)果顯示，龍膽苦苷在275 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，小檗堿在228、265、347 nm的波長(zhǎng)處有較大吸收波長(zhǎng)，在270 nm的波長(zhǎng)處，兩者均有較大的吸收，因此本文將檢測(cè)波長(zhǎng)定為270 nm。

3.1.2 提取方式的優(yōu)化 在提取方式選擇上，比較了浸漬、超聲和回流的提取效果，研究表明，對(duì)龍膽苦苷的提取上浸漬沒(méi)有超聲和回流效果好，但超聲和回流沒(méi)有差異；但在小檗堿的提取上回流要優(yōu)于超聲，超聲又要明顯優(yōu)于浸漬，因此為了更好地提取本文選擇回流作為提取方式。

3.1.3 提取時(shí)間的優(yōu)化 在提取時(shí)間的選擇上，比較了30 min，60 min和90 min的提取效果，研究表明，對(duì)于龍膽苦苷3種時(shí)間無(wú)顯著差異，而對(duì)于小檗堿30 min的提取效果要顯著低于60 min和90 min，而60 min和90 min的提取效果相當(dāng)，因此本試驗(yàn)將提取時(shí)間定為60 min。

3.2 小結(jié) 本試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[5-6]選用不同的比例的甲醇-水，甲醇-0.2%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果表明，選用當(dāng)前試驗(yàn)的流動(dòng)相時(shí)，樣品中龍膽苦苷和小檗堿分離效果好、無(wú)雜峰干擾且時(shí)間短。目前尚未見(jiàn)到白龍散組分含量測(cè)定相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]小檗堿含量測(cè)定的方法普遍在流動(dòng)相配制中使用了十二烷基磺酸鈉，而十二烷基磺酸鈉對(duì)C18柱有一定的破壞性，本試驗(yàn)使用的流動(dòng)相對(duì)柱子傷害較小。本試驗(yàn)開(kāi)發(fā)的方法單針?lè)治鰰r(shí)間短，前處理簡(jiǎn)便，方法簡(jiǎn)便可靠，可用于大批量樣品檢測(cè)進(jìn)行，可為白龍散質(zhì)量控制提供參考。

[3] Lei Zhaoa, Juan Yea, Guo-tai Wu,etal. Gentiopicroside prevents interleukin-1 beta induced inflammation response in rat articular chondrocyte [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2015,172: 100-107.

[4] Guo-xun Lia, Xi-mo Wanga, Tao Jiang,etal. Berberine prevents damage to the intestinal mucosal barrier during early phase of sepsis in rat through mechanisms independent of the NOD-like receptors signaling pathway [J]. European Journal of Pharmacology, 2014,730: 1-7.

[5] 王文月，劉志宏，黃愛(ài)文，等. 雙波長(zhǎng)HPLC法測(cè)定酸性龍膽合劑中龍膽苦苷和橙皮苷的含量[J]. 中國(guó)藥房, 2015,26(9):1241-1243.

[6] 陳靜，支張， 索朗次仁，等. HPLC法測(cè)定藏藥解吉那保不同部位龍膽苦苷的含量[J]. 現(xiàn)代中醫(yī)藥, 2015, 35(6): 92-94.

[7] 熊巨良. 高效液相色譜法測(cè)定五味黃連丸中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿的含量[J]. 湖南中醫(yī)雜志, 2014, 30(9): 152-154.

[8] 王慧，毛春芹， 周淵，等. HPLC同時(shí)測(cè)定舒樂(lè)洗劑中苦參堿和小檗堿[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014, 20(9):88-90.

Determination of Gentiopicroside and Berberine in Bailong San by HPLC

BAO Ai-qing , ZHU Cong-ying , LU Chun-bo ， LIN Xian-jun

(Zhejiang Province Institute of Veterinary Drug and Feedstuff, Hangzhou 311101，China)

To establish a HPLC method for the determination of gentiopicroside and berberine in Bailong San, analysis was performed on a C18 column (250 mm×4.6 mm，5 μm)with a mobile phase of 0.5% triethylamine in water(pH was adjusted to 3.0 by 85% phosphoric acid)-methanol (60:40，v:v)at a flow rate of 1.0 mL/min and a column temperature of 30℃. The injection volume was 10 μL and the determination wave length was 270 nm. The linear range was 4.09～102.2 mg/mL(r=1.000 0) and 3.93～98.26 mg/mL (r=1.000 0), and the average recovery was 98.63% and 97.78% with RSD% of .96% and 1.23%, respectively. This method was convenient, accurate and reliable for the determination of gentiopicroside and berberine in Bailong San .

Bailong San; HPLC; Gentiopicroside; Berberine

2016-08-05

包愛(ài)情(1989—)，男，碩士，從事獸藥檢測(cè)、畜產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)工作，E-mail：baoaiqing@126.com

R286

A

0529-6005(2017)03-0096-03