某蛋雞場金黃色葡萄球菌和沙門菌的分離鑒定及藥物敏感性分析

黃文青 , 李博文 ， 高 彤 ， 王豪舉 ， 丁紅雷

(1. 西南大學附屬中學 ， 重慶北碚400700 ； 2. 西南大學動物科技學院 ， 重慶北碚400715)

某蛋雞場金黃色葡萄球菌和沙門菌的分離鑒定及藥物敏感性分析

黃文青1, 李博文1， 高 彤2， 王豪舉2， 丁紅雷2

(1. 西南大學附屬中學 ， 重慶北碚400700 ； 2. 西南大學動物科技學院 ， 重慶北碚400715)

為了解某蛋雞場金黃色葡萄球菌和沙門菌對抗菌藥物的耐藥情況，采集重慶市某蛋雞場48份羽毛樣品、123份肛拭子樣品，將羽毛樣品經MH高鹽培養(yǎng)液增菌后劃線接種于MH高鹽平板，將肛拭子樣品經沙門菌增菌液增菌后劃線接種于S.S.平板。將疑似菌落接種LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后提取基因組，PCR擴增金黃色葡萄球菌特異性nuc基因和沙門菌特異性invA基因片段。對分離鑒定的金黃色葡萄球菌和沙門菌進行藥物敏感性試驗。最終共分離鑒定出9株金黃色葡萄球菌、6株沙門菌。藥敏試驗結果表明，分離的金黃色葡萄球菌和沙門菌耐藥嚴重，且存在多重耐藥。本研究基本摸清了該蛋雞場金黃色葡萄球菌和沙門菌對常見抗菌藥物的敏感性，為該蛋雞場的臨床用藥提供了參考。

金黃色葡萄球菌 ； 沙門菌 ； 分離鑒定 ； PCR ； 藥物敏感性試驗

20世紀90年代以來，隨著我國集約化養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展和抗菌藥物在動物飼養(yǎng)中的廣泛應用，動物源性病原菌的耐藥問題越來越嚴重，由此引起的公共衛(wèi)生事件也越來越多。金黃色葡萄球菌和沙門菌均是常見的人獸共患病病原菌。加強這兩種細菌在養(yǎng)殖場中耐藥情況的監(jiān)測，有利于養(yǎng)殖場的合理用藥，減少抗菌藥物的使用，減少耐藥菌株的比例，還能減少食物鏈中耐藥菌株向人傳遞的幾率，具有一定的公共衛(wèi)生意義。

1 材料與方法

1.1 菌株 金黃色葡萄球菌菌株CQHC4CSA002、沙門菌菌株CQ4CSCS005、質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC?25923和大腸桿菌ATCC?25922由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 Mueller-Hinton培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基、革蘭染色液，購自杭州天和微生物試劑有限公司；2×TaqMaster Mix和DNA Marker DM-5 000，購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 藥敏試紙 32種藥敏試紙，購自杭州天和微生物試劑有限公司。(1)β-內酰胺類：(A)青霉素類：青霉素G、氨芐西林、阿莫西林；(B)頭孢類：頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢他啶；(C)氨曲南；(2)氨基糖苷類：鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素；(3)四環(huán)素類：四環(huán)素、強力霉素；(4)酰胺醇類：氯霉素、氟苯尼考；(5)大環(huán)內酯類：紅霉素、阿奇霉素；(6)林可胺類：林可霉素、克林霉素；(7)多肽類：萬古霉素；(8)磺胺類：甲氧嘧啶、復方新諾明；(9)喹諾酮類：恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星。

1.4 方法

1.4.1 樣本采集和處理 2015年1-3月，分兩次于重慶市某蛋雞場采集羽毛樣品48份(第1次10份，第2次38份)，肛拭子樣品123份(第1次63份，第2次60份)。肛拭子樣品的采集采用無菌棉簽蘸取泄殖腔糞便。采集的樣品置于滅菌離心管中，然后放入有冰袋的泡沫箱中，6 h之內運回實驗室。

采集的羽毛樣品直接加入Mueller-Hinton高鹽増菌液中，220 r/min 37 ℃培養(yǎng)8 h。增菌后的菌液劃線接種于Mueller-Hinton高鹽平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后置于4 ℃ 5 d。每個平板挑取3～5個淺黃色、黃色或橙色疑似金黃色葡萄球菌單菌落劃線接種于LB平板，37 ℃培養(yǎng)18 h。

裝有肛拭子樣品的離心管中加入1.5 mL滅菌PBS，震蕩后靜置2 h，再次震蕩混勻，取200 μL液體于S.S.增菌液中，220 r/min 37 ℃搖床培養(yǎng)6～8 h。增菌后的菌液劃線接種于S.S.平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。挑取3～5個中間黑色的單個菌落劃線接種于LB平板，37 ℃培養(yǎng)18 h。1.4.2 臨床菌株的PCR檢測

1.4.2.1 引物設計與合成 根據GenBank 中公布的金黃色葡萄球菌nuc基因序列和沙門菌invA基因序列，用Primer Premier 5.0設計特異性引物。擴增nuc基因片段的引物：nuc-F：5′-AGGGATGGCTATCAGTAAT GTTTC-3′和nuc-R：5v-CATCAGCATAAATATACGCTAAGCCAC-3′，擴增invA基因片段的引物：invA-F：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′和invA-R：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAAC C-3′。

1.4.2.2 菌株PCR模板的制備 挑取有金黃色葡萄球菌/沙門菌典型菌落特征的單個菌落接種LB液體培養(yǎng)基，220 r/min 37 ℃培養(yǎng)8 h。取新鮮培養(yǎng)的菌液2 mL 12 000 r/min離心1 min，棄上清；加入1 mL ddH2O，重懸，立即12 000 r/min離心1 min，棄上清；加入50 μL ddH2O，105 ℃處理10 min。保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2.3 臨床菌株的PCR鑒定 擴增nuc/invA基因片段PCR反應體系：2×TaqMaster Mix 10 μL，nuc-F/invA-F(10 μmol/L)0.5 μL，nuc-R/invA-R(10 μmol/L)0.5 μL，模板0.5 μL，ddH2O 8.5 μL，總反應體系20 μL。

擴增nuc/invA基因片段PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸6 min。以金黃色葡萄球菌CQHC4CSA002和沙門菌CQ4CSCS005作為陽性對照。1.4.3 藥物敏感性試驗 紙片法測定分離菌株對32種抗菌藥物的敏感性。參照《動物源細菌抗菌藥物敏感性試驗紙片法與稀釋法執(zhí)行標準(2013版)》和《抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準；第二十三版資料增刊》的方法操作與進行結果判定。

2 結果

2.1 菌株分離情況 將平板上疑似為金黃色葡萄球菌的菌落經PCR擴增nuc基因片段，最終共鑒定出9株金黃色葡萄球菌(圖1)，分離率為22.9%。菌株CQ5CSCSA001和CQ5CSCSA002分離于2015年1月，菌株CQ5CSCSA003-CQ5CSCSA009分離于2015年3月(表1)。

圖1 金黃色葡萄球菌臨床分離株的PCR鑒定結果

采樣日期采樣份數分離菌株數分離率/%菌株編號2015．1．1510220．0CQ5CSCSA001?CQ5CSCSA0022015．3．2038723．7CQ5CSCSA003?CQ5CSCSA009合計48922．9

將平板上疑似為沙門菌的菌落經PCR擴增invA基因片段，最終共鑒定出6株沙門菌(圖2)，分離率為4.9%。CQ5CSCS001-CQ5CSCS003分離于2015年1月，CQ5CSCS004-CQ5CSCS006分離于2015年3月(表2)。

圖2 沙門菌臨床分離株的PCR鑒定結果

采樣日期采樣份數分離菌株數分離率/%菌株編號2015．3．206334．8CQ5CSCS001?CQ5CSCS0032015．7．276035CQ5CSCS004?CQ5CSCS006合計12364．9

2.2 藥物敏感性試驗結果 由表3可知，9株金黃色葡萄球菌臨床株對氨芐西林完全耐藥；8株菌對青霉素G、阿莫西林、頭孢拉定、阿奇霉素、林可霉素、克林霉素耐藥；7株菌株對諾氟沙星、甲氧嘧啶、復方新諾明、四環(huán)素、強力霉素、氯霉素、紅霉素耐藥；6株菌對頭孢唑啉、頭孢他啶和環(huán)丙沙星耐藥；5株菌對氟苯尼考耐藥；即有18種藥物的耐藥率超過50%。所有金黃色葡萄球菌臨床分離株對頭孢噻吩敏感；對頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻肟和慶大霉素耐藥的菌株僅有1株，對阿米卡星和妥布霉素耐藥的菌株有2株，對頭孢氨芐、恩諾沙星耐藥的菌株有3株，對卡那霉素、氧氟沙星耐藥的菌株有4株。

6株沙門菌臨床株對青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢噻肟、鏈霉素、恩諾沙星、甲氧嘧啶、復方新諾明、四環(huán)素、強力霉素、萬古霉素、氯霉素、紅霉素17種藥物完全耐藥；對頭孢曲松和氟苯尼考耐藥菌株有5株。超過22種藥物的耐藥率超過50%。慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素和諾氟沙星對所有分離菌敏感；其中慶大霉素和妥布霉素對所有菌株完全敏感。

目前還沒有氨曲南、鏈霉素和萬古霉素對金黃色葡萄球菌，林可霉素和克林霉素對沙門菌的耐藥標準，故沒有進行藥物敏感性試驗。兩株質控菌株對所測定的所有抗菌藥物均敏感。

3 討論

細菌耐藥已成為全球面臨的最嚴重公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一。1959年甲氧西林首次用于耐青霉素金黃色葡萄球菌引起感染的治療[1]，而1961年報道，在丹麥分離到耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)[2]，隨后歐洲其他國家、日本和美國等陸續(xù)分離到MRSA[1]。除金黃色葡萄球菌外，其他細菌的耐藥菌株也已經廣泛存在，特別是2016年5月26日，美國衛(wèi)生官員報告稱，美國發(fā)現首例對所有已知抗生素有抵抗力的細菌感染病例[3]。

人體內耐藥菌株的存在與動物源性食品隨食物鏈進入人體密切相關[4]。有研究報道，定植于豬體內的MRSA能夠引起人類的疾病[5]。還有報道分離于患乳房炎奶牛的MRSA與分離于人的MRSA基因型十分相似[6]。由此可見，加強對養(yǎng)殖場中細菌耐藥性的監(jiān)測，了解養(yǎng)殖場內重要病原菌的耐藥表型，從而采取針對性的防控措施具有十分重要的意義。

本試驗在蛋雞場分離的金黃色葡萄球菌和沙門菌對多種抗菌藥物具有耐藥性，特別是沙門菌，所有的分離菌株對17種抗菌藥物完全耐藥，由此可見，該養(yǎng)殖場菌株的耐藥非常嚴重。令人奇怪的是，這些菌株對一些在產蛋雞禁用的抗菌藥物仍有極強的耐藥性，如氨芐西林、阿莫西林，這可能是由于其他同類藥物的使用造成的交叉耐藥；對于喹諾酮類和磺胺類藥物的耐藥則可能是由于蛋雞在幼齡時使用此兩類藥物，從而細菌產生耐藥性而造成的；對于氯霉素的耐藥則可能是由于產蛋前氟苯尼考的使用造成，因為氯霉素和氟苯尼考具有相同的耐藥基因，如cat。萬古霉素一般不應用于蛋雞，而本次試驗分離的沙門菌對萬古霉素完全耐藥，這可能是環(huán)境中的耐萬古霉素菌株持續(xù)存在，將耐藥基因傳遞給本養(yǎng)殖場的細菌有關[7]。

本研究為該蛋雞場抗菌藥物的使用提供了參考，有利于提高藥物使用的針對性，并通過藥物的交替使用降低耐藥菌株的比例。在后續(xù)的研究中將繼續(xù)增大樣本采集量和采集范圍，使樣品更有代表性。

表3 金黃色葡萄球菌和沙門菌臨床分離株對抗菌藥物的敏感性

S：敏感； I：中度敏感； R：耐藥

[1] Eniright M C, Robinson D A, Randle G,etal. The evolutionary history of methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA) [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, 99 (11): 7687-7692.

[2] Eriksen K R. "Celbenin"-resistant staphylococci [J]. Ugeskr Laeger, 1961, 123: 384-386.

[3] http://news.sciencenet.cn/htmlnews/2016/5/347278.shtm.

[4] Bortolaia V, Espinosa-Gongora C, Guardabassi L,etal. Human health risks associated with antimicrobial-resistant enterococci andStaphylococcusaureuson poultry meat [J]. Clinical Microbiology and Infection, 2016, 22 (2): 130-140.

[5] Jamrozy D M, Fielder M D, Butaye P,etal. Comparative genotypic and phenotypic characterisation of methicillin-resistantStaphylococcusaureusST398 isolated from animals and humans [J]. PLoS One, 2012, 7 (7): e40458.

[6] Juhász-Kaszanyitzky E, Jánosi S, Somogyi P,etal. MRSA transmission between cows and humans [J]. Emerging Infectious Diseases, 2007, 13 (4): 630-632.

[7] Quintana-Hayashi M P, Thakur S. Phylogenetic analysis reveals common antimicrobial resistantcampylobactercolipopulation in antimicrobial-free (ABF) and commercial swine systems [J]. PLoS One, 2012, 7 (9): e44662.

Isolation,identification and antibiotic sensitivity analysis ofStaphylococcusaureusandSalmonellafrom a layer-raising farm

HUANG Wen-qing1, LI Bo-wen1, GAO Tong2, WANG Hao-ju2, DING Hong-lei2

(1.High School Affiliated to Southwest Univeristy, Chongqing 400700, China;2. College of Animal Science and Technology, Southwest University, Chongqing 400715, China)

The purpose of the study is to acquire the information of the antibiotic sensitivity of hen-associatedStaphylococcusaureus(S.aureus) andSalmonellain a layer-raising farm in Chongqing. Forty eight feather samples and 123 fecal samples were collected. The feather samples were cultured in high-salt MH medium and then cultured on high-salt MH plates. Fecal samples were cultured in SS medium and then cultured on SS plates. The suspected colonies were cultured in LB media. TheS.aureusspecific genenucandSalmonellaspecific geneinvAwere amplified from the suspected colonies, and the antimicrobial susceptibility of the identifiedS.aureusandSalmonellawere tested with 32 antibacterials. NineS.aureusisolates and 6Salmonellaisolates were identified from samples. Antibiotic sensitivity assay showed that the drug resistances ofS.aureusandSalmonellato antibacterials were serious. This study implies that the antibiotic sensitivity ofS.aureusandSalmonellato commonly used antibacterials is severe and provides some useful data for the clinical medication in the layer-raising farm.

Staphylococcusaureus;Salmonella; isolation and identification; PCR; antibiotic sensitivity assay Corresponding author：DING Hong-lei

2016-07-21

國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目(2013CB12720)；重慶市中小學創(chuàng)新人才工程項目(CY150205)

黃文青(1999-)，女，高中生，主要研究興趣為微生物耐藥，E-mail：474164278@qq.com

丁紅雷，E-mail：hongleiding@swu.edu.cn

Q933

A

0529-6005(2017)03-0042-04