豬流行性腹瀉病毒山西分離株M基因序列分析

劉文俊 ， 王娟萍 ， 姚敬明 ， 吳 忻 ， 孟 帆 ， 韓一超 ， 李紅麗 ， 樊振華 , 米瑞娟 ， 薛翼鵬

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 山西太原030032)

豬流行性腹瀉病毒山西分離株M基因序列分析

劉文俊 ， 王娟萍 ， 姚敬明 ， 吳 忻 ， 孟 帆 ， 韓一超 ， 李紅麗 ， 樊振華 , 米瑞娟 ， 薛翼鵬

(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 山西太原030032)

為了研究山西地區(qū)豬流行性腹瀉病毒M基因的遺傳變異情況，從2014年10月～2015年4月山西地區(qū)11個地市收集的豬流行性腹瀉病毒(PEDV)病料中擴(kuò)增到4株P(guān)EDV 的M基因，并進(jìn)行序列比對及遺傳分析。結(jié)果表明，4株P(guān)EDV 的M基因與CV777毒株比較，部分核苷酸及氨基酸發(fā)生改變。4株P(guān)EDV的M基因核苷酸和氨基酸的同源性分別為99.6%～100%和99.1%～99.6%，與參考毒株的核苷酸和氨基酸的同源性分別為96.3%～99.9%和96.0%～99.1%。遺傳進(jìn)化分析顯示，4株P(guān)EDV與2010-2013年中國分離株(BJ2010、HB/BD、HB/FN、HLJ-2012、GDHZ-1202、SHQP/YM/2013)、2008年泰國KU04RB08株親緣關(guān)系較近；與2株泰國株(M_NIAH2013_95和M_NIAH1795_04)、2株歐洲株(CV777和Br1/87)和2006年中國分離株LZC親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

豬流行性腹瀉 ； 山西分離株 ； M基因 ； 序列分析

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的豬的一種急性、高度傳染性腸道傳染病，臨床上以嘔吐、水樣腹瀉和脫水死亡為特征[1-2]。該病1978年首次報道于比利時和英國[3-4]，1984年宣化等證實(shí)該病在我國存在[5]。豬流行性腹瀉病毒是冠狀病毒科、冠狀病毒屬的成員，為有囊膜單股正鏈RNA病毒，基因組全長約28 k，包括5′端非編碼區(qū)、3′端非編碼區(qū)以及至少7個開放閱讀框(ORF1a、 ORF1b、ORF2-ORF6)[6-7]。其中，由ORF5基因編碼的M蛋白在病毒粒子組裝、出芽過程中起重要作用，同時能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生[8]。為了調(diào)查山西地區(qū)PEDV M基因的遺傳變異情況，本研究通過RT-PCR方法對2014-2015年采集自山西省11個地市的PEDV陽性病料的M基因進(jìn)行了克隆測序和序列分析，以便為我省防控PED提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 病料 病料于2014-2015年采集自山西省太原、晉中、呂梁等11地市發(fā)生仔豬腹瀉的豬場，包括小腸及腸內(nèi)容物等。

1.2 病料的處理 將采集的小腸及腸內(nèi)容物剪碎后研磨，加入PBS緩沖液勻漿后，12 000 r/min(4 ℃)離心5 min，收集上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑 RNAiso Plus、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PremixTaqTM、DNA Marker DL-2 000、pMD18-T Vector，購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；E.coliDH5α菌株，購自天根生化科技(北京)有限公司；乙醇、異丙醇、氯仿等試劑均為分析純。

1.4 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank登錄PEDV CV777 M基因保守區(qū)設(shè)計了擴(kuò)增M基因全序列的引物，擴(kuò)增產(chǎn)物片段預(yù)期長度為689 bp。引物序列如下：M-F：5′-AACGAAATATGTCTAACGGTTCTATTC-3′，M-R：5′-TTAGACTAAATGAAGCACTTTCTCAC-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 病毒RNA的提取 按RNAiso Plus試劑盒操作說明書，從陽性病料中提取病毒基因組RNA，用適量的DEPC水溶解，-20 ℃保存，備用。

1.6 M基因的擴(kuò)增、克隆和測序 提取的RNA為模板制備cDNA，參照PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit操作說明書進(jìn)行。在PCR管中依次加入，RNase free H2O 7 μL、RNA 1 μL 、dNTP 1 μL，反轉(zhuǎn)錄引物(M-R)1 μL；混勻后，65 ℃保溫5 min后，冰上迅速冷卻；在上述的PCR管加入5 PrimeScript II Buffer 4 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、 PrimeScript Ⅱ RTase 1 μL、 RNase free dH2O 4.5 μL。PCR反應(yīng)體系：PremixTaq25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，滅菌蒸餾水21 μL，混勻后進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃45 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)；再 72 ℃ 延伸10 min。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。將PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)鑒定后將陽性菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.7 序列分析 對所獲得的4株P(guān)EDV M基因序列用DNAStar軟件與GenBank中登錄的12株國內(nèi)外分離株的M基因進(jìn)行了同源性分析，并構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 PEDV M基因的擴(kuò)增結(jié)果 從陽性病料中提取 RNA， 用引物M-F和M-R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，分別獲得4個與預(yù)期片段大小相符的特異片段(圖1)，分別命名為：CH/SXHF18/2015、CH/SXTLF10/2015、CH/SXCH11/2015和CH/SXJZY11/2015。

圖1 PEDV M基因的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 M基因序列變化 4株P(guān)EDV山西分離株M基因全長均為689 bp，無核苷酸插入和缺失。與CV777 M基因相比，4株P(guān)EDV山西分離株M基因有13個相同的核苷酸突變，分別為：37為核苷酸由G→C，125、285、618位由T→C，180位由G→A，198、213、222、234、566位由C→T，348位由T→A，603位由A→C，640位由G→T。另外，CH/SXTLF10/2015株在453位由A→G、503位由T→A，CH/SXHF18/2015株在273位由G→T。4株P(guān)EDV山西分離株M基因推倒的氨基酸與CV777相比，第13位氨基酸由E→Q，第42位由V→A，第189位 A→V，第214位由A→S。另外，CH/SXTLF10/2015株的第168位氨基酸由F→Y。

2.3 M基因同源性分析 4株P(guān)EDV山西分離株M基因核苷酸和氨基酸的同源性分別為99.6%～100%和99.1%～99.6%。與GDHZ～2012、KU04RB08、SHQP YM2013、BJ2010、HB-BD、HB/FN、HLJ-2012核苷酸和氨基酸的同源性分別為99.0%～99.9%和97.4%～99.1%。與Br1/87、LZC、CV777核苷酸和氨基酸的同源性分別為96.8%～98.1%和95.6%～97.8%。與M_NIAH1795_04、M_NIAH2013_95核苷酸和氨基酸的同源性分別為96.3%～96.8%和96.0%～96.5%。

2.4 M基因的遺傳進(jìn)化分析 將獲得的M基因與GenBank已發(fā)表的PEDV的M基因進(jìn)行核苷酸序列比對，利用MEGA4構(gòu)建進(jìn)化樹，見圖2。由圖2可知，PEDV毒株可分為3個群。4株P(guān)EDV山西分離株均屬于第3群，同屬該群的還有1986-2013年的13株中國株(CH/S、LJB-03、JS-2004-2、DX、CH/HNCH/06、BJ2010、HB/BD、HB/FN、SH1、HLJ-2012、GDYA、GDHZ-1202、SHQP/YM/2013)，1997-2009年6株韓國株(KPEDV-9、Chinju99、M2227、PFF188、CPF259、DR13)，2008年泰國株泰國KU04RB08和日本株JMe2。歐洲株CV777、Br1/87和中國2006年分離到LZC株組成第2群。泰國1995年分離的M_NIAH2013_95和2004年分離的M_NIAH1795_04組成第1群。遺傳進(jìn)化分析表明，4株P(guān)EDV山西分離株與2010-2013年中國分離株(BJ2010、HB/BD、HB/FN、HLJ-2012、GDHZ-1202、SHQP/YM/2013)、2008年泰國KU04RB08株親緣關(guān)系較近；與2株泰國株(M_NIAH2013_95和M_NIAH1795_04)、2株歐洲株(CV777和Br1/87)和2006年中國分離株LZC親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 基于PEDV M基因繪制的進(jìn)化樹

3 討論

3.1 2010年10月，中國南方暴發(fā)PED[9]，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。2014年冬季至2015年春季，山西省部分規(guī)模化豬場暴發(fā)哺乳仔豬腹瀉病，臨床主要表現(xiàn)為哺乳仔豬水樣腹瀉、嚴(yán)重脫水和嘔吐，發(fā)病率和死亡率高達(dá)90%～100%，給我省養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了查清山西省豬流行性腹瀉的流行情況，課題組對山西11個地市的30個規(guī)?；i場的仔豬腹瀉發(fā)病情況進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)研，并對采集的253份病料進(jìn)行豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)檢測，PEDV陽性率為73.26%，TGEV陽性率為7.36%。表明山西省豬群發(fā)生的腹瀉，主要是由豬流行性腹瀉病毒引起。3.2 4株P(guān)EDV山西分離株M基因有13個相同的核苷酸突變。另外，CH/SXTLF10/2015株有2個位點(diǎn)，CH/SXHF18/2015株有1個位點(diǎn)發(fā)生了不同于其他毒株的核苷酸突變。4株P(guān)EDV山西分離株M基因推倒的氨基酸與CV777相比，有4個相同位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生突變。另外，CH/SXTLF10/2015株的第168位氨基酸由F→Y。4株P(guān)EDV山西分離株M基因與鄭逢梅等[10]、黃冬妮等[11]、盧冰霞等[12]分離的毒株有不同的突變點(diǎn)，可能是在選擇壓力下發(fā)生了一定的變異，因此，課題組計劃進(jìn)一步分析PEDV其他遺傳變異情況，為預(yù)防控制PED提供參考。

[1] 陳溥言．獸醫(yī)傳染病學(xué)[M]．5版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：229-231．

[2] 斯特勞 B E．豬病學(xué)．趙德明，張仲秋，沈建忠，主譯．[M].9版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008：399-403．

[3] Pensaert M B，Debouck P．A new coronavirus-like particles associated with diarrhea in swine[J]．Arch Virol，1978，58(3)： 243-247．

[4] Chasey D，Cartwright S F．Virus-like particles associated with porcine epidemic diarrhea [J]．Res Vet Sci，1978，25(2)：255-256．

[5] 宣化，邢德坤，王殿瀛，等．應(yīng)用豬胎腸單層細(xì)胞培養(yǎng)豬流行性腹瀉病毒的研究[J]．中國人民解放軍獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1984，4(3)：202-208．

[6] Kocherhans R，Bridgen A，Ackermann M，etal．Completion of the porcine epidemic diarrhea coronvirus (PEDV) genome sequence [J]．Virus Genes，2001，23(2)：137-144．

[7] Park S J，Kim H K，Song D S．Complete genome sequences of a Korean virulent porcine epidemic diarrhea virus and its attenuated counterpart [J]．J Virol，2012，86(10)：5964-5964．

[8] Escors D，Camafeita E，Ortego J，etal．Organization of two transmissible gastroenteritis coronavirus membrane protein topologies within the virion and core [J]．J Virol，2001，75(24)：12228-12240．

[9] Sun Rui-qin， Cai Ru-jian，Chen Ya-qiang，etal．Outbreak of porcine epidemic diarrhea in sucking piglets,China [J]．Emerg Infect Dis，2012，18(1)：161-163．

[10] 鄭逢梅，霍金耀，趙軍，等．2010-2012年華中地區(qū)豬流行性腹瀉病毒分子特征和遺傳進(jìn)化分析[J]．病毒學(xué)報，2013，29(3)：197-205．

[11] 黃冬妮，黃良宗，馬春全，等．廣東省豬流行性腹瀉病毒ORF3和 M基因的克隆與序列分析[J]．黑龍江畜牧獸醫(yī)科技版，2015，3：136-139．

[12]盧冰霞，秦毅斌，何穎，等．2011-2014年廣西豬流行性腹瀉病毒檢測及其M基因的序列分析[J]．中國畜牧獸醫(yī)，2015，42(3)：529-557．

Sequence Analysis of the M Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus in Shanxi Province

LIU Wen-jun , WANG Juan-ping ， YAO Jing-ming ， WU Xin , MENG Fan ， HAN Yi-chao , LI Hong-li , FAN Zhen-hua ， MI Rui-juan , XUE Yi-peng

(Institution of Animal Husbandry and Veterinary, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030032, China)

In order to study the heritable variation of M gene of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in Shanxi Region, 4 PEDV field strains were isolated from 11 cities in Shanxi province during October 2014 to April 2015.M gene was amplified from the 4 PEDV field strains by RT-PCR, cloned, sequenced and compared with the other reference strains in GenBank. The result showed that the several nucleotides and amino acids of M gene of 4 PEDV field strains compared with the vaccine strain (CV777) changed. The nucleotide and amino acid homologies of M gene of the 4 PEDV field strains in Shanxi were 99.6% to 100% and 99.1% to 99.6%, respectively, but compared with the reference strains were 96.3%-99.9% and 96.0%-99.1%. Phylogenetic analysis showed that the 4 PEDV strains had closer genetic relationship with the Chinese isolates (BJ2010, HB/BD, HB/FN, HLJ-2012, GDHZ-1202, SHQP/YM/2013) during 2010 to 2013 and Thailand isolate (KU04RB08) in 2008, but more distant genetic relationship with European isolate (CV777,Br1/87), Thailand isolates (M_NIAH2013_95, M_NIAH1795_04) and China isolate (LZC) in 2006.

porcine epidemic diarrhea virus ; Shanxi isolates ; M gene ; sequence analysis Corresponding author:WANG Juan-ping

2016-05-12

山西省科技攻關(guān)項目(20140311020-2-A);山西省科技攻關(guān)項目(20150311018-3)

劉文俊(1979-)，男，助理研究員，碩士，主要從事動物疫病分子生物學(xué)檢測與診斷技術(shù)的研究，E-mail：774075120@qq.com

王娟萍，E-mail:jcbyjs@sohu.com

Q785

A

0529-6005(2017)03-0032-03