鑒別犬瘟熱病毒強(qiáng)弱毒株SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

由叢華 ， 張傳美 ， 張洪亮 ， 秦志華 ， 楊海燕 ， 單 虎

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 山東青島266109; 2.山東省蓬萊市畜牧局 ， 山東蓬萊 264003)

鑒別犬瘟熱病毒強(qiáng)弱毒株SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

由叢華1,2， 張傳美1， 張洪亮1， 秦志華1， 楊海燕1， 單 虎1

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 山東青島266109; 2.山東省蓬萊市畜牧局 ， 山東蓬萊 264003)

為建立犬瘟熱強(qiáng)弱毒株SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法，根據(jù)GenBank公布的犬瘟熱毒株的全基因序列并參考相關(guān)文獻(xiàn)，選擇M基因保守區(qū)域合成了1對通用引物M1/M4及鑒別犬瘟熱強(qiáng)弱毒株的特異引物M2和M3。試驗(yàn)證明，該方法重復(fù)性良好；檢測強(qiáng)弱毒株的最低檢出限度在10拷貝；對新城疫病毒、水貂腸炎病毒、阿留申病毒、犬腺病毒、犬細(xì)小病毒5種病毒的特異性檢測均為陰性；對175份犬瘟熱疑似病料進(jìn)行熒光定量RT-PCR，檢出127份陽性樣品，其中強(qiáng)毒株98份，弱毒疫苗株29份，常規(guī)RT-PCR檢出112份陽性樣品。結(jié)果表明，該方法的敏感性高于常規(guī)RT-PCR檢測，并能有效的鑒別強(qiáng)弱毒株。

犬瘟熱病毒 ； SYBR Green I 熒光定量RT-PCR ； 強(qiáng)弱毒株 ； 鑒別

犬瘟熱(Canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(CDV)引起的一種犬類高度接觸性傳染病，可感染犬科、鼬科等多種動物，成為當(dāng)前危害養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)和野生動物保護(hù)業(yè)最大疫病之一。目前傳統(tǒng)的診斷方法中[1-2]，膠體金試劑盒檢測方法雖然快速，但是準(zhǔn)確率低[3]并無法用來區(qū)分強(qiáng)弱毒株；常規(guī)RT-PCR檢測方法存在假陽性、耗時(shí)長等缺點(diǎn)[4]。熒光定量RT-PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對模板準(zhǔn)確定量，具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好和結(jié)果直觀可定量并能區(qū)分強(qiáng)弱毒株等優(yōu)點(diǎn)，已得到廣泛的應(yīng)用[5]。本研究使用SYBR Green I 熒光定量RT-PCR技術(shù)通過特異性引物對犬瘟熱強(qiáng)弱毒株進(jìn)行區(qū)分，建立了犬瘟熱強(qiáng)弱毒株的SYBR Green I 熒光定量PCR檢測方法，該方法為快速準(zhǔn)確的區(qū)分犬瘟熱強(qiáng)弱毒株提供了有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 毒株、試劑及儀器 犬瘟熱野毒株(命名為CDV-Y，H全基因測序?yàn)橐岸局?1株；犬瘟熱弱毒疫苗株(CDV-3株)；新城疫疫苗株(NDV-B1株)；水貂腸炎病毒(MEV)、阿留申病毒(ADV)、犬腺病毒(CAV)、犬細(xì)小病毒(CPV)毒株及病料均由山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。RNA iso plus，質(zhì)粒抽提試劑盒，膠回收試劑盒，pMD19-T載體，E.coli、DH5α等，購自寶生物工程(大連)有限公司；熒光定量PCR 儀(Rotor-gene3000)為美國Gene公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的犬瘟熱毒株的全基因序列并參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]，選擇M基因保守區(qū)4264～4861 bp間，合成一對通用引物M1和M4(擴(kuò)增片段為600 bp)。根據(jù)強(qiáng)弱毒株間有差別區(qū)域，合成位于兩對通用引物中的強(qiáng)弱毒株的特異引物M2和M3，M2/M4可特異性擴(kuò)增強(qiáng)毒株(擴(kuò)增片段為247 bp)，M3/M4可特異性擴(kuò)增弱毒株(擴(kuò)增片段為177 bp)。

M1:5′-AAATCCTGTGTTACCCGCTC-3′；M2:5′-TGGTGGCTCTGCAATATGAA-3′；M3:5′-AATGAATGGATGCCTGGGGTTT-3′；M4:5′-CAAAACTTAGGGTCCAGGAC-3′；1.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 對強(qiáng)毒株CDV-Y和弱毒株CDV-3提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，用引物M1/M4、M2/M4、M3/M4進(jìn)行常規(guī)RT-PCR，膠回收后連接pMD19-T載體中，轉(zhuǎn)入DH5α獲得野毒株和疫苗株的重組質(zhì)粒并測其質(zhì)粒濃度，換算為拷貝數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線的繪制 分別以M2/M4為強(qiáng)毒株上下游引物，以M3/M4為弱毒疫苗株上下游引物，將犬瘟熱強(qiáng)弱毒株標(biāo)準(zhǔn)品按照107～101倍比稀釋作為模板，25 μL的反應(yīng)體系為：SYBR Primix ExTaq12 μL、0.1 nmol/L強(qiáng)弱毒株上、下游引物各1 μL；質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋的模板1 μL、無菌水10 μL。最佳反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析溫度為78 ℃～95 ℃。經(jīng)軟件分析后得到犬瘟熱強(qiáng)弱毒株標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。

1.5 敏感性、特異性及重復(fù)性試驗(yàn) 用強(qiáng)弱毒株拷貝數(shù)依次為1.0×107～1.0×101copies/μL進(jìn)行SYBR Green I熒光定量RT-PCR，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)；分別對強(qiáng)弱毒株質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品與NDV、MEV、ADV、CAV、CPV的cDNA，分別用引物M2/M4和M3/M4進(jìn)行單一熒光定量RT-PCR 檢測，確定該方法的特異性試驗(yàn)；分別取強(qiáng)弱毒株的1.0×102、1.0×104、1.0×106三個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行組內(nèi)及組間的重復(fù)性試驗(yàn)，并且計(jì)算組內(nèi)及組間的變異系數(shù)。

1.6 臨床樣品檢測 對采集的175份由膠體金試劑檢測陽性疑似犬瘟熱病料，研磨為組織懸液并提RNA后用Oligo DT反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別用引物M2/M4和M3/M4對病料進(jìn)行SYBR Green I 熒光定量RT-PCR檢測，同時(shí)用通用引物M1/M4進(jìn)行常規(guī)RT-PCR檢測。

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)品的制備 犬瘟熱強(qiáng)毒株(CDV-Y)和弱毒疫苗(CDV-3)的PCR產(chǎn)物分別出現(xiàn)大小為600 bp、247 bp和177 bp的條帶，與預(yù)期的目的條帶的大小相一致(圖1)。分別對目的條帶膠回收純化，連接轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)過PCR鑒定為目的條帶。

圖1 犬瘟熱強(qiáng)弱毒株P(guān)CR產(chǎn)物

M： DL-1 000 DNA Marker； 1：強(qiáng)毒株CDV-Y； 2：弱毒株CDV-3疫苗株； 3：陰性對照

圖A：引物M1/M2分別擴(kuò)增強(qiáng)弱毒株條帶； 圖B：引物M2/M4和M3/M4分別擴(kuò)增強(qiáng)弱毒株條帶

2.2 熒光定量PCR方法的建立 建立強(qiáng)、弱毒株標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.998和R2=0.996。動力學(xué)曲線顯示，強(qiáng)弱毒株的Tm值分別在78 ℃±0.5 ℃和79 ℃±0.5 ℃，強(qiáng)弱毒株均無引物二聚體及非特異擴(kuò)增峰。

2.3 敏感性試驗(yàn) 強(qiáng)弱毒株的熒光定量RT-PCR的最小檢測量均為101，標(biāo)準(zhǔn)曲線在 l07-101呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(見中插彩版圖2)。

2.4 特異性試驗(yàn) 建立的單一熒光定量PCR均能檢測出強(qiáng)弱毒株，而對NDV、MEV、ADV、CAV、CPV無閾值信號產(chǎn)生(見中插彩版圖3)。結(jié)果表明，該方法在強(qiáng)弱毒株檢測中有很好的特異性。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 選取1.0×102、1.0×104、1.0×106三個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品作為模板對兩套引物進(jìn)行批間和批內(nèi)測試，結(jié)果表明，兩套引物的變異系數(shù)均小于2%，說明其重復(fù)性良好(表1)。

表1 強(qiáng)弱毒株批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗(yàn)

2.6 臨床樣品檢測 應(yīng)用建立的強(qiáng)弱毒株SYBR Green I 熒光定量RT-PCR和常規(guī)RT-PCR，對175份犬瘟熱疑似病料進(jìn)行檢測。熒光定量RT-PCR共檢出陽性樣品127份，其中強(qiáng)毒株98份，弱毒疫苗株29份；常規(guī)PCR僅檢出陽性樣品112份。臨床檢測證明建立的熒光定量RT-PCR具有更高的敏感性。

3 討論

目前，疫苗是預(yù)防和治療犬瘟熱最有效的方法，被廣泛應(yīng)用于毛皮動物養(yǎng)殖及寵物飼養(yǎng)和野生動物保護(hù)等領(lǐng)域，但由于野毒株變異的長期積累，CDV疫苗株可能已經(jīng)不能對所有的CDV流行株產(chǎn)生有效的保護(hù)，這可能是導(dǎo)致免疫失敗的主要原因之一，另外近幾年來經(jīng)常有免疫的犬或水貂暴發(fā)犬瘟熱的現(xiàn)象發(fā)生。

為了鑒別犬瘟熱強(qiáng)毒株還是疫苗株對動物的感染，YiLi等[7]人通過對CDV H基因氨基酸的比對發(fā)現(xiàn)，在331位和502位氨基酸殘基上存在差異從而設(shè)計(jì)野毒株與疫苗株P(guān)CR鑒別引物，楊天闊等[10]人通過比對野毒株與疫苗株H基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立用于鑒別檢測CDV野毒株與疫苗株的RT-LAMP檢測方法。這些方法雖然能夠區(qū)分強(qiáng)弱毒株，但在靈敏度方面與熒光定量PCR檢測方法相比存在一定的差距[9]。雖然現(xiàn)在已有關(guān)于建立熒光定量PCR檢測犬瘟熱病毒的方法，但并未有熒光定量PCR檢測方法對強(qiáng)弱毒株進(jìn)行鑒別區(qū)分。本研究通過CDV強(qiáng)弱毒株特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了區(qū)分強(qiáng)弱毒株的SYBR Green I 熒光定量檢測方法。通過驗(yàn)證該方法敏感性、特異性和重復(fù)性良好，閉管檢測無需PCR后處理，避免了樣品間的交叉污染，臨床檢測效果良好，說明本方法可廣泛用于毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)及寵物飼養(yǎng)和野生動物保護(hù)等領(lǐng)域強(qiáng)弱毒株臨床檢測中，及時(shí)區(qū)分強(qiáng)弱毒株感染，指導(dǎo)疫苗使用和藥物使用情況。

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Development of a SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR assay for detection and identification wild-type and vaccine strain of canine distemper virus

YOU Cong-hua1，2, ZHANG Chuan-mei1, ZHANG Hong-liang1, QIN Zhi-hua1，YANG Hai-yan1, SHAN Hu1

(1.Shandong Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China； 2.The Livesfock Bureau of Penglai at Shandong Province, Penglai 264003, China)

SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR was developed for the detection and identification of wild-type and vaccine strains of canine distemper virus(CDV).According to the differences of whole gene sequence of M gene in the strains of CDV in Genebank, two pairs of primers, universal primer M1 and M4 and specific primers M2 and M3 were designed to differentiate wild-type and vaccine strain of CDV. The developed RT-PCR could detect minimum 10 copies for wild-type and vaccine strains and specifically differentiate NDV,MEV,ADV,CAV,and CPV. SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR and normal PCR detected 127 positive samples and 112 positive samples,respectively. Twenty-nine positive samples were vaccine strain in 127 positive samples detected by SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR. This results show that the sensitivity of this assay is higher than normal RT-PCR, which can also differentiate wild-type and vaccine strains of CDV.

Canine distemper virus; SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR; wild-type and vaccine strain; identification.

s：ZHANG Chuan-mei； SHAN Hu

2014-12-31.

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303042)；科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)(科技部)(2012FY111000)

由叢華(1989-)，男，碩士，研究方向?yàn)閯游飩魅静》乐危珽-mail: youconghua@163.com

張傳美，E-mail:zhangchuanmei100@163.com；單虎，E-mail:shanhu67@163.com

S852.65+5

A

0529-6005(2017)03-0023-03