MBD2在老年胃癌中的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞多藥耐藥性的作用

韓雪晶

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 徐州 221002)

MBD2在老年胃癌中的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞多藥耐藥性的作用

韓雪晶

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 徐州 221002)

目的 探討甲基化CpG結(jié)合域蛋白質(zhì)2(MBD2)在老年胃癌中的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞多藥耐藥性的作用。方法 采用免疫組化染色法檢測(cè)70份老年胃癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本中的MBD2表達(dá)情況，并分析其表達(dá)水平與病理參數(shù)的關(guān)系。Western印跡檢測(cè)MBD2在胃癌細(xì)胞系SCG7901及其耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)。使用MBD2的小干擾RNA靜默MBD2表達(dá)后，通過MTT試驗(yàn)檢測(cè)化療藥物順鉑、5-氟尿嘧啶對(duì)胃癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。結(jié)果 MBD2在胃癌組織中陽性表達(dá)率為72.86%，明顯低于相應(yīng)的癌旁組織中的92.86%(P<0.01)。MBD2在胃癌組織中表達(dá)與TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)；其中MBD2在TNM分期為Ⅰ期和Ⅱ期的患者中陽性表達(dá)率明顯高于Ⅲ期和Ⅳ期患者(P<0.05)。SGC7901/阿霉素、GC7901/長春新堿中的MBD2/β-actin灰度比值明顯低于其親本細(xì)胞SGC7901(P<0.01)。SGC7901細(xì)胞和轉(zhuǎn)染無關(guān)序列對(duì)照寡核苷酸的SGC7901細(xì)胞MBD2/β-actin比值之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染MBD2特異性小干擾RNA的SGC7901細(xì)胞中MBD2/β-actin比值明顯低于上述兩株對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05)。轉(zhuǎn)染MBD2特異性小干擾RNA的胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑和5-氟尿嘧啶的IC50值均明顯高于轉(zhuǎn)染無關(guān)序列對(duì)照寡核苷酸的胃癌細(xì)胞(P<0.01)。結(jié)論 MBD2在老年胃癌組織中表達(dá)明顯降低，與臨床分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，可抑制胃癌細(xì)胞的多藥耐藥性，說明MBD2表達(dá)失調(diào)參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

胃癌；甲基化CpG結(jié)合域蛋白質(zhì)2；耐藥性

目前胃癌治療效果仍不理想，約40%的患者經(jīng)化療后出現(xiàn)耐藥〔1，2〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的多藥耐藥性不但與基因缺失、異位、突變有關(guān)，還與遺傳學(xué)改變存在相關(guān)性〔3〕。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要調(diào)控機(jī)制之一，抑癌基因啟動(dòng)子高甲基化是癌癥發(fā)生的一個(gè)重要因素。甲基化CpG結(jié)合域蛋白質(zhì)(MBD)家族是一類與甲基化CpG二核苷酸相互結(jié)合的核蛋白，MBD2作為其成員，可將DNA甲基化與組蛋白修飾有機(jī)的聯(lián)合起來發(fā)揮樞紐作用，與細(xì)胞調(diào)控、腫瘤形成與發(fā)展有著緊密關(guān)系。相關(guān)研究顯示，MBD2在肺癌，特別是非小細(xì)胞肺癌，以及卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌組織中發(fā)揮明顯的轉(zhuǎn)錄靜默作用，導(dǎo)致MBD2與mRNA表達(dá)水平明顯低于正常組織〔4〕。本研究旨在了解MBD2在胃癌組織中的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞多藥耐藥性的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年1月至2016年1月間老年胃癌住院患者手術(shù)切除的胃癌及其相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本70份，其中男45例，女25例，年齡60～84歲；腺癌65例，未分化癌5例；TNM分期：1期3例、Ⅱ期27例、Ⅲ期34例、Ⅳ期6例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例。人胃癌細(xì)胞系(SCG7901)，人胃癌耐藥細(xì)胞系(SGC7901/阿霉素、SGC7901/長春新堿)均購于上?；鄯f生物科技有限公司。放于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 免疫組化檢測(cè)中兔抗人MeCP2多克隆抗體購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，鏈霉菌生物素蛋白-過氧化物酶(SP)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司。兔抗人MBD2多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗購于艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影試劑盒購于美國Sigma公司。MBD2小干擾RNA及無序列隊(duì)長寡核苷酸購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化檢測(cè)MBD2在胃癌組織中表達(dá) 采用SP法，將胃癌組織常規(guī)脫蠟至水，常規(guī)抗原修復(fù)、山羊血清封閉后，依次孵育MBD2多克隆抗體和酶標(biāo)記羊抗兔二抗。DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封固。高倍鏡視野下觀察，進(jìn)行陽性細(xì)胞比例評(píng)分：陽性細(xì)胞比例≤1%為0分，2%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度評(píng)分：無色為0分，淺棕黃色為1分,棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積為組織學(xué)評(píng)分：<4分為陰性，≥4分為陽性。

1.4 Western印跡檢測(cè)MBD2在胃癌細(xì)胞系中表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長中期的胃癌細(xì)胞SCG7901，以及人胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/阿霉素、SGC7901/長春新堿，提取細(xì)胞總蛋白。常規(guī)方法將蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，濕法轉(zhuǎn)移至NC膜。以兔抗人MBD2和鼠抗人β-actin為一抗行Western印跡檢測(cè)。NC膜經(jīng)ECL顯影液孵育后，使用E-gel Imager凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，進(jìn)行灰度分析，內(nèi)參為β-actin，計(jì)算MBD2的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 胃癌細(xì)胞的藥物敏感性檢測(cè) 使用MTT法檢測(cè)胃癌細(xì)胞的藥物IC50。對(duì)轉(zhuǎn)染了MBD2特異性小干擾RNA或無序列隊(duì)長寡核苷酸的胃癌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，鋪于96孔板，每孔4 000個(gè)細(xì)胞。加入順鉑或5-氟尿嘧啶，設(shè)6個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育3 d，避光加入終濃度為0.05 mg/L的MTT，20 μl/孔，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入200 μl DMSO，振蕩溶解后，490 nm波長處測(cè)量吸光度值，計(jì)算藥物對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率和IC50。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件行t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 MBD2在胃癌及其癌旁組織中的表達(dá)情況 免疫組化染色顯色，MBD2在癌旁組織中呈明顯陽性表達(dá)，在胃癌組織中陽性表達(dá)則較弱，MBD2在胃癌組織中陽性表達(dá)率為72.86%(51/70)，明顯低于相應(yīng)的癌旁組織中的92.86%(65/70，χ2=15.192，P<0.01)，見圖1。

2.2 MBD2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 MBD2在胃癌組織中表達(dá)與TNM分期、遠(yuǎn)傳轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)；其中MBD2在TNM分期為Ⅰ期和Ⅱ期的患者中陽性表達(dá)率為80.00%(24/30)，明顯高于Ⅲ期和Ⅳ期患者的67.50%(27/40)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3 MBD2在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá) SGC7901/阿霉素、SGC7901/長春新堿中的MBD2/β-actin灰度比值分別為(0.582 6±0.021 6)、(0.651 2±0.017 5)，明顯低于其親本細(xì)胞SGC7901的(1.000±0.000；t=24.195、18.458；P<0.01)。SGC7901細(xì)胞和轉(zhuǎn)染無關(guān)序列對(duì)照寡核苷酸的SGC7901細(xì)胞中的MBD2/β-actin比值分別為(1.000±0.000)、(0.894 5±0.053 8)，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染MBD2特異性小干擾RNA的SGC7901細(xì)胞中的MBD2/β-actin比值為(0.566 7±0.094 2)，明顯低于上述兩株對(duì)照組細(xì)胞(t=5.056、6.935；P<0.05)。見圖2，圖3。

圖2 MBD2在SGC7901及其耐藥細(xì)胞中的表達(dá)

1為SGC7901；2為轉(zhuǎn)染無關(guān)序列對(duì)照寡核苷酸的細(xì)胞表達(dá)；3為轉(zhuǎn)染MBD2特異性小干擾RNA的SGC7901圖3 MBD2在SGC7901細(xì)胞與轉(zhuǎn)染MBD2特異性小干擾RNA或無關(guān)序列對(duì)照寡核苷酸的細(xì)胞中表達(dá)

2.4 MBD2表達(dá)降低對(duì)胃癌細(xì)胞耐藥性的影響 轉(zhuǎn)染MBD2特異性小干擾RNA的胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑和5-氟尿嘧啶的IC50值分別為(2.384±0.153 7)μg/ml、(11.439±0.358 2)μg/ml，均明顯高于轉(zhuǎn)染無關(guān)序列對(duì)照寡核苷酸的胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑和5-氟尿嘧啶的IC50值(8.552±0.171 2)μg/ml、(0.895±0.027 5)μg/ml(t=16.490、9.264；P<0.01)。

3 討 論

腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中DNA甲基化是重要機(jī)制之一，多表現(xiàn)為大范圍的低甲基化和局部的高甲基化〔5〕。MBD家族是一類與甲基化CpG二核苷酸相互結(jié)合的核蛋白，該家族成員中具有相同的MBD，其中MBD2可與DNA上單一對(duì)稱的甲基化CpG相互結(jié)合，借助TRD和橋蛋白復(fù)合物、組蛋白乙?；讣捌渌惨种谱拥南嗷プ饔?，在甲基化位點(diǎn)處形成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，抑制轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控元件結(jié)合生成復(fù)合物〔6〕。研究已發(fā)現(xiàn)MBD2在肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌組織中發(fā)揮明顯的轉(zhuǎn)錄靜默作用，導(dǎo)致MBD2與mRNA表達(dá)水平明顯低于正常組織，但關(guān)于MBD2與胃癌關(guān)系的研究報(bào)道仍十分少見。

本次研究說明表達(dá)缺失或抑制是MBD2在胃癌組織中表達(dá)失調(diào)的主要形式。隨胃癌病情的進(jìn)展MBD2表達(dá)水平有下降趨勢(shì)，提示MBD2表達(dá)抑制可能參與胃癌病情的發(fā)展。MBD2雖然與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，但與胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在明顯關(guān)聯(lián)，在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌組織中有更多的MBD2表達(dá)，該結(jié)果與相關(guān)研究中MBD2在雌二醇受體陽性的乳腺癌中表達(dá)水平明顯高于陰性的報(bào)道相似〔7〕。提示MBD2不能簡單地歸結(jié)為腫瘤抑制分子。

化學(xué)治療是目前胃癌治療的主要手段之一，術(shù)前新輔助化療可有效促使腫瘤降期，術(shù)后化療可清除剩余的癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)移灶。然而腫瘤的多藥耐藥性嚴(yán)重制約了化療的效果。相關(guān)研究認(rèn)為，多種分子基因表達(dá)失調(diào)在多藥耐藥性產(chǎn)生中起到調(diào)控作用〔8〕。本次研究顯示，MBD2在胃癌耐藥細(xì)胞中表達(dá)水平明顯低于親本細(xì)胞，使用小干擾RNA降低其表達(dá)水平可有效提升胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑、5-氟尿嘧啶的耐受性，說明MBD2可抑制胃癌細(xì)胞的多藥耐藥性。在胃癌病情發(fā)展過程中，MBD2的表達(dá)逐漸被抑制，有利于癌細(xì)胞獲得多藥耐藥性的特性，導(dǎo)致惡性表型不斷增強(qiáng)。

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8 楊叢蓮.奧沙利鉑黃芩素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胃癌細(xì)胞抑制作用的影響研究〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016;7(5):640-3.

〔2016-07-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

韓雪晶(1976-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究。

R735.2

A

1005-9202(2017)07-1666-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.042