葛根素治療急性脊髓缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制

季相祿，田峰，王斌，肖萬安

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨外科，沈陽110024）

葛根素治療急性脊髓缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制

季相祿，田峰，王斌，肖萬安

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨外科，沈陽110024）

目的探索葛根素在治療急性脊髓缺血再灌注損傷（ASII）大鼠中的作用機(jī)制。方法28只雄性大鼠阻斷主動脈來實(shí)施ASII。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為4組：陰性對照（NC）組（假手術(shù)處理）、陽性對照（IR+S）組（脊髓缺血再灌注損傷+鹽水處理）、IR+P組（脊髓缺血再灌注損傷+葛根素處理）、IR+R組（脊髓缺血再灌注損傷+細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑處理）。檢測各組大鼠運(yùn)動機(jī)能、脊髓梗死體積、細(xì)胞凋亡指數(shù)及細(xì)胞周期素依賴性激酶5（CDK5）和P25的活性。結(jié)果IR+S組與NC組比較，P35和P25蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；IR+P組、IR+R組與IR+S組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示葛根素對ASII神經(jīng)保護(hù)可能通過類似抑制劑的作用，并且與P35和P25的表達(dá)相關(guān)。結(jié)論脊髓損傷減小與CDK5及P25活性受抑制相關(guān)；在ASII大鼠治療過程中，抑制CDK5及P25活性是葛根素的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制之一。

葛根素；脊髓缺血再灌注損傷；細(xì)胞周期素依賴性激酶5；細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑；大鼠

脊髓缺血及隨后的截癱是胸主動脈或胸腹主動脈的外科治療過程中有可能產(chǎn)生的并發(fā)癥。葛根素由葛根中提取，因其具有顯著的神經(jīng)保護(hù)特性（尤其是治療脊髓缺血損傷）而受到關(guān)注。已有文獻(xiàn)［1-3］報(bào)道，葛根素的神經(jīng)保護(hù)性作用涉及許多因素（炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等）。另外，本組近期研究［4］表明，葛根素的神經(jīng)保護(hù)作用與抑制谷氨酸鹽釋放作用有關(guān)，但葛根素在脊髓缺血損傷中的治療機(jī)制仍不明確。此外，細(xì)胞周期素依賴性激酶5（cyclin?dependent kinase 5，CDK5）是一種脯氨酸介導(dǎo)的多效蛋白激酶，首要作用是調(diào)節(jié)哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和脊髓神經(jīng)元的遷移過程。眾所周知，CDK5的超活化會導(dǎo)致神經(jīng)炎癥及體外或體內(nèi)神經(jīng)元死亡。這種情況在不同的毒性刺激物作用下發(fā)生，可引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高而激活鈣蛋白酶，參與P35裂解為P25的過程。P25對于CDK5是一種縮短后的活化劑，P25的超表達(dá)引起CDK5活性升高，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。因此，抑制CDK5活性在脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)中起重要作用。

本研究旨在探討大鼠急性脊髓缺血再灌注損傷（acute spinal ischemia?reperfusion injury，ASII）是否導(dǎo)致CDK5超活化，應(yīng)用葛根素是否能防止CDK5和P25超活化后導(dǎo)致的神經(jīng)病理學(xué)改變。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理

28只雄性大鼠，體質(zhì)量230～250 g。隨機(jī)均分為4組，每組7只。陰性對照（NC）組以假手術(shù)處理，陽性對照（IR+S）組以脊髓缺血再灌注損傷+鹽水處理，IR+P組以脊髓缺血再灌注損傷+葛根素處理，IR+R組以脊髓缺血再灌注損傷+細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑處理。IR+P組腹腔內(nèi)注射葛根素（50 mg/ kg），該劑量在之前的研究［4］中證明有效。在開始再灌注后第1、2、4、6小時(shí)，分別注射葛根素（50 mg/kg），2 d內(nèi)每24 h同樣處理1次。抑制劑則在開始實(shí)施脊髓缺血前60 min鼠尾靜脈注射，劑量為30 mg/ kg。各組大鼠血流動力學(xué)變量［心率、血壓、血?dú)猓≒aO2和PaCO2）和血液pH］實(shí)驗(yàn)處理前、處理過程中及處理后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P>0.05），體溫維持在正常范圍內(nèi)。所有大鼠完成實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 ASII模型構(gòu)建［5］

腹腔內(nèi)注射水合氯醛（350 mg/kg）維持實(shí)驗(yàn)動物麻醉狀態(tài)。用聚乙烯導(dǎo)管（PE?50）插入尾動脈以監(jiān)測遠(yuǎn)端動脈壓和注射肝素用。經(jīng)左股動脈向胸降主動脈植入1個(gè)2F的Fogarty導(dǎo)管，導(dǎo)管尖端到達(dá)左鎖骨下動脈的水平。在主動脈阻斷期間，控制近端動脈血壓在40 mmHg，應(yīng)用連接到1個(gè)外部儲血器（37.5°C）20 G的聚四氟乙烯導(dǎo)管插入左頸總動脈。在主動脈阻斷期間，應(yīng)用常溫的水（38.0～38.3°C）通過熱交換器（100 mL/min）灌注控制并保持脊髓正常溫度。在所有插管完成后，肝素（200 U）注入尾動脈。為了誘導(dǎo)脊髓缺血，生理鹽水膨脹導(dǎo)管球囊0.05 mL并讓血液流入外部儲血器中。缺血時(shí)間維持60 min，繼之48 h再灌注。陰性對照組動物施行假手術(shù)，施以相同處理，但不阻斷主動脈。

1.3 神經(jīng)功能評定

以Tarlov評分系統(tǒng)對神經(jīng)功能進(jìn)行評分，標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，后肢完全屈曲，無活動；1分，后肢不完全嚴(yán)重屈曲；2分，后肢可以活動，但不能跳躍；3分，后肢可以跳躍，但活動明顯不穩(wěn)；4分，后肢可以跳躍，活動輕度不穩(wěn)；5分，后肢活動正常。

1.4 脊髓缺血梗死體積評定

通過之前研究［6］方法評定脊髓缺血梗死的體積。簡言之，即通過快速切除脊髓來測量梗死體積。制備2 mm的切片，在磷酸鹽緩沖溶液的2%三苯基氯化四氮唑中培養(yǎng)。染色后的脊髓切片保存在10%甲醛溶液中。梗死區(qū)域通過圖像分析軟件（NIH圖像分析儀）進(jìn)行分析。

1.5 細(xì)胞死亡數(shù)量評定

大鼠處死，取出L2～3節(jié)段的脊髓斷面。使用追蹤檢測試劑盒（美國Gen Script公司），利用TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）染色技術(shù)對脊髓切片進(jìn)行處理。對每個(gè)切片的TUNEL陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，其總數(shù)作為TUNEL指數(shù)。

1.6 CDK5、P35和P25評定

CDK5活性通過廠家試劑盒（加拿大Signal Chem公司）分析測定。CDK5活性作為積分光密度值。P35和P25蛋白提取物進(jìn)行12%丙烯酰胺的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，以及聚偏二氟乙烯膜的免疫印跡。該膜在P35/P25的初級抗體（美國Cell Signaling Technology公司）中培養(yǎng)，在室溫下阻斷或者以β?肌動蛋白的初級抗體作為內(nèi)部控制性稀釋。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)用葛根素及抑制劑預(yù)處理可改善神經(jīng)功能

NC組大鼠后肢運(yùn)動功能無改變。神經(jīng)功能評分結(jié)果顯示，與NC組比較，IR+S組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），提示有顯著的神經(jīng)功能缺陷；IR+P組、IR+R組與IR+S組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），施加葛根素可明顯改善功能，抑制劑預(yù)處理也顯著防止了由ASII引起的神經(jīng)功能缺陷。IR+P組和IR+R組比較運(yùn)動功能評分沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見表1。

2.2 應(yīng)用葛根素及抑制劑預(yù)處理可減小脊髓梗死體積

與NC組比較，IR+S組脊髓梗死體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；IR+P組、IR+R組與IR+S組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而IR+R組與IR+P組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。急性脊髓缺血48 h再灌注導(dǎo)致脊髓廣泛的梗死，然而葛根素、抑制劑處理能夠使梗死體積顯著減小。見表1。

2.3 應(yīng)用葛根素及抑制劑預(yù)處理可穩(wěn)定P35和P25蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，IR+S組與NC組比較，P35和P25蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；IR+P組、IR+R組與IR+S組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；

ASII引起P25蛋白表達(dá)升高、P35蛋白表達(dá)下降，提示ASII通過加快P35裂解而導(dǎo)致P25表達(dá)上調(diào)，P25表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致CDK5超活化。抑制劑預(yù)處理組顯著地抑制了P25的上調(diào)和P35的下調(diào)，在葛根素處理組也觀察到類似的結(jié)果，提示葛根素對ASII神經(jīng)保護(hù)可能通過類似抑制劑的作用，并且與P35和P25的表達(dá)相關(guān)。見表1、圖1。

2.4 應(yīng)用葛根素及抑制劑預(yù)處理可抑制由急性脊髓缺血再灌注引起的CDK5升高

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分，灌注48 h后的脊髓梗死體積，P35、P25表達(dá)及CDK5活性水平比較Tab.1 Comparison of neurological function score，spinal infarction volume，P35，P25 and CDK5

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分，灌注48 h后的脊髓梗死體積，P35、P25表達(dá)及CDK5活性水平比較Tab.1 Comparison of neurological function score，spinal infarction volume，P35，P25 and CDK5

1）P<0.01 vs NC group；2）P<0.05 vs IR+S group.

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圖1 各組大鼠P35、P25蛋白表達(dá)比較Fig.1 Comparison of P35 and P25 protein expression

IR+S組與NC組比較CDK5活性顯著升高（P<0.01）；IR+P組、IR+R組與IR+S組比較CDK5活性明顯抑制（P<0.05），提示對CDK5的抑制作用是葛根素在治療缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護(hù)性機(jī)制之一。見表1。

2.5 應(yīng)用葛根素及抑制劑預(yù)處理可減少細(xì)胞凋亡

結(jié)果顯示，NC組大鼠未見凋亡細(xì)胞，但I(xiàn)R+S組可見大量凋亡細(xì)胞［（13.1±1.8）%］。與IR+S組比較，IR+P組凋亡細(xì)胞顯著減少［（7.66±2.4）%，P< 0.01］。IR+R組凋亡細(xì)胞也減少［（7.26±1.8）%，P< 0.01］。見圖2。

圖2 各組大鼠再灌注48 h后凋亡細(xì)胞比較×200Fig.2 Comparison of apoptotic cells after reperfusion for 48 hours×200

3 討論

研究［1?3，7?9］表明，葛根素的神經(jīng)保護(hù)作用涉及包括氧化應(yīng)激、炎癥效力及神經(jīng)元凋亡等在內(nèi)的多種機(jī)制，但具體機(jī)制仍待研究。眾所周知，急性脊髓缺血可導(dǎo)致脊髓梗死，而缺血之后再灌注則會導(dǎo)致脊髓的繼發(fā)再損傷。缺血和再灌注都是能夠產(chǎn)生氧自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。主動脈的再灌注導(dǎo)致組織的進(jìn)一步損傷，能引起災(zāi)難性的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。細(xì)胞凋亡很大程度上參與到繼發(fā)損傷過程中，并受半胱氨酸蛋白酶活性調(diào)節(jié)。因此猜想，某種可抑制半胱氨酸蛋白酶的化學(xué)劑也許能夠阻止繼發(fā)損傷過程中的細(xì)胞凋亡。

CDK5是絲氨酸/蘇氨酸激酶CDK家族的成員，對脊髓神經(jīng)元的遷移過程至關(guān)重要。CDK5活性升高與神經(jīng)元凋亡直接相關(guān)。一些數(shù)據(jù)［10?12］已證明細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑能抑制CDK5的活性，防止神經(jīng)元凋亡。

本研究結(jié)果顯示，抑制劑預(yù)處理可防止缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡，提示脊髓缺血再灌注通過CDK5的超活化導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。此外，缺血再灌注損傷提高了CDK5和P25的表達(dá)。缺血再灌注損傷后P25的表達(dá)上調(diào)和P35的表達(dá)下調(diào)，提示了P35向P25的裂解，P25刺激CDK5的活性升高。與以往研究發(fā)現(xiàn)一致［13?15］。

目前研究［10?12］顯示CDK5的抑制劑——細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑明顯防止細(xì)胞凋亡，改善脊髓運(yùn)動功能，提示脊髓缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡與CDK5的活化相關(guān)。本研究顯示，除了細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑有特異性神經(jīng)保護(hù)作用，葛根素也發(fā)揮了類似抑制劑的功能，提示葛根素對ASII神經(jīng)保護(hù)作用是通過抑制CDK5和P25實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，對CDK5和P25活性的抑制是葛根素治療急性脊髓損傷的重要機(jī)制之一。細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑是CDK5的選擇性抑制劑，而葛根素涉及多種不同機(jī)制，并不僅僅是抑制CDK5。因此，對于葛根素治療脊髓缺血再灌注損傷中存在的其他可能的機(jī)制（清除氧自由基的特性或其他神經(jīng)性調(diào)節(jié)等）應(yīng)進(jìn)行更廣泛的研究。

綜上所述，葛根素明顯防止了缺血再灌注所引起的脊髓損傷及神經(jīng)元凋亡。CDK5超活化參與缺血再灌注所致的脊髓神經(jīng)元凋亡，葛根素的神經(jīng)保護(hù)性作用與抑制CDK5和P25相關(guān)。

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（編輯 武玉欣）

The Mechanism of Neuroprotective Effects of Puerarin for the Treatment of Acute Spinal Ischemia?reperfusion Injury in Rats

JI Xianglu，TIAN Feng，WANG Bin，XIAO Wanan
（Department of Orthopedic Surgery，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110024，China）

ObjectiveTo explore the mechanism of neuroprotective effects of puerarin for the treatment of acute spinal ischemia?reperfusion inju?ry in a rat model.MethodsAcute spinal ischemia?reperfusion injury was induced via aortic occlusion in 28 male Sprague?Dawley rats.The ani?mals were randomly divided into four groups，as follows：group negative contrast（NC sham operation），group positive control group（IR+S isch?emia/reperfusion+saline），group puerarin（IR+P ischemia/reperfusion+puerarin），group roscovitine（IR+R ischemia/reperfusion+roscovitine）. The motor function，spinal infarction volume，apoptosis indices，and CDK5 and P25 activities were examined.ResultsSpinal ischemia?reperfu?sion caused the injury of the spines and was associated with motor deficit，elevation of CDK5 and P25 activities，and increase in the spinal apopto?sis and spinal infarction volume.Puerarin improved motor function and decreased apoptosis，spinal infarction volume，and CDK5 and P25 activi?ties.ConclusionThe findings of the present study indicated that puerarin treatment?mediated reduction of spinal injury was associated with the inhibition of CDK5 and P25，and that the inhibition was one among the neuroprotective mechanisms of puerarin against acute ischemia/reperfusion?induced spinal injury in rats.

puerarin；spinal ischemia?reperfusion；cyclin?dependent kinase 5；cyclin B kinase inhibitor；rat

R34

A

0258-4646（2017）04-0313-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.04.007

遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（l2015589）

季相祿（1981-），男，講師，碩士.

田峰，E-mail：tianfeng2002@sina.com

2016-09-01

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：