人巨細胞病毒UL145相互作用蛋白的篩選和功能分析

鄒飛，王爽，吳思，孫崢嶸

（1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院生物樣本庫，沈陽110004；2.吉林大學第一醫(yī)院兒科，長春130021）

人巨細胞病毒UL145相互作用蛋白的篩選和功能分析

鄒飛1，2，王爽1，吳思1，孫崢嶸1

（1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院生物樣本庫，沈陽110004；2.吉林大學第一醫(yī)院兒科，長春130021）

目的應用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與人巨細胞病毒（HCMV）UL145編碼蛋白相互作用的來源于人胎腦cDNA文庫的組織蛋白。方法采用聚合酶鏈式反應擴增HCMVUL145片段，酶切及純化擴增的目的片段及酵母表達載體pGBKT7，連接HCMV UL145片段及載體pGBKT7，將連接后的重組誘餌表達載體pGBKT7?UL145轉化到酵母菌AH109中，再將人胎腦文庫DNA也轉化到酵母AH109中，篩選與HCMV UL145編碼蛋白相互作用的蛋白，并對陽性克隆進行測序和生物信息學分析。結果最終確認多個克隆與HCMV UL145編碼蛋白相互作用，BLAST結果顯示3個與FOXG1高度同源。結論利用酵母雙雜交系統(tǒng)成功篩選出與HCMV UL145編碼蛋白相互作用的人胎腦cDNA文庫蛋白FOXG1，推測該目的蛋白在HCMV感染所致神經系統(tǒng)損傷過程中起重要作用。

人巨細胞病毒；UL145蛋白；酵母雙雜交系統(tǒng)；人胎腦cDNA文庫

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）屬皰疹病毒科β亞科，基因組大小約230 000 bp，最大編碼數(shù)超過200多個病毒蛋白，是皰疹病毒科中最大的病毒［1］。約10%感染的新生兒出生后是有癥狀的，可以留有感音性神經性耳聾、小頭畸形、脈絡膜視網膜炎、視神經萎縮、肌張力減低和亢進等神經系統(tǒng)相關后遺癥［2］。但該病的致病機制仍缺少報道。

本研究通過對位于HCMV UL/b’區(qū)的UL145基因編碼蛋白互作蛋白的篩選及分析其可能的生物學功能，為研究HCMV UL145編碼蛋白在胎兒腦發(fā)育中的作用及探討HCMV感染所致中樞神經系統(tǒng)損傷機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

標本為傳代次數(shù)<5次的HCMV臨床分離株H，取材自就診于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院的HCMV感染患兒?；純耗挲g5個月，臨床表現(xiàn)包括宮內發(fā)育遲緩、直接膽紅素升高、轉氨酶升高、間質性肺炎和中樞神經系統(tǒng)影像學異常等。從已感染HCMV患兒的尿液中分離出臨床分離株H，UL145基因擴增模板采用人胚肺細胞培養(yǎng)的HCMV DNA。

Clontech公司生產的酵母雙雜交系統(tǒng)Match?maker GAL Two?Hybrid System；肖庚富所長（中科院武漢病毒所）惠贈的人胎腦cDNA文庫（Matchermak?erTM cDNA Libraries）；BECKMAN Allegra系列臺式超高速低溫離心機；Perkin Elmer Cetus公司PCR循環(huán)儀；美國Bio?rad MicroPulser電穿孔儀；美國英杰生命技術有限公司完成引物合成及測序。

1.2 方法

1.2.1 構建誘餌表達載體pGBKT7?UL145：利用HC?MV臨床分離株H感染人胚肺細胞，從中提取DNA，用其為UL145基因擴增的模板。設計用于擴增HC?MV UL145片段的上下游引物（設計軟件采用Oligo 6.0），含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點，序列UL145U：CCGGAATTCTTGTCGACCTACGGCGTCCTGGCTCA TTAC，UL145D：CGCGGATCCGGTACCTCAGTTAT CACTTCCACCCATC。選取HCMV DNA為模板，應用實時PCR技術擴增UL145目的基因片段，將獲取到的UL145目的片段及載體PGBK?T7進行雙酶切并切膠回收后純化，連接純化好的UL145片段與載體PGBK?T7。轉化連接后的pGBKT7?UL145到大腸桿菌TG1感受態(tài)細胞中，菌液進行抗性篩選。采用實時PCR技術鑒定重組克隆，將陽性克隆送至英杰生命技術有限公司，引物選取pGBKT7通用引物進行測序分析。

1.2.2 篩選與HCMV UL145互作的胎腦文庫蛋白：（1）對人胎腦cDNA文庫進行擴增，采用堿裂解法提取文庫質粒，文庫酵母表達載體為pACT2（含轉錄激活域）。（2）應用小劑量醋酸鋰酵母轉化法轉化pGB?KT7?UL145誘餌表達載體到酵母細胞AH109中，計算轉化效率后進行篩選，將提取的文庫質粒也轉化到酵母細胞AH109中。（3）已轉化誘餌質粒及文庫質粒計算轉化效率并做顯色反應篩選顯藍色的陽性單克隆。（4）將陽性單克隆擴增后提取酵母質粒，再將質粒轉化到大腸桿菌TG1中，篩選出人胎腦cDNA文庫克隆。（5）提取文庫克隆質粒并將其回轉到含有誘餌載體pGBKT7?UL145的酵母AH109中進行驗證，涂二缺平板后計算轉化效率，涂四缺平板做顯色反應。挑選與HCMV?UL145相互作用的cDNA文庫進行測序，利用GenBank的數(shù)據(jù)庫資源進行比較，對結果進行BLAST分析。

2 結果

2.1 成功構建誘餌表達載體pGBKT7?UL145并鑒定

成功擴增出HCMVUL145基因片段，長度大小為393 bp，瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶大小與預期一致且無非特異性條帶，將已成功連接HCMVUL145目的片段與pGBKT7的誘餌載體命名為pGBKT7?UL145。應用PCR技術鑒定（引物選取pGBKT7兩端及UL145片段的上下游引物）含pGBKT7?UL145質粒的陽性克隆顯示結果正確。用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內切酶對提取的pGBKT7?UL145質粒進行雙酶切鑒定，結果顯示可見大小約393 bp及7 500 bp 2條目的條帶，送測序分析顯示與預期結果一致，見圖1。

圖1 pGBKT7?UL145的成功克隆Fig.1 Cloning of pGBKT7?UL145

2.2 文庫的篩選及顯色反應

轉化胎腦cDNA文庫質粒到含有誘餌載體pGB?KT7?UL145的酵母細胞AH109中，菌液涂二缺平板后共長出132個克隆，計算轉化效率為4.6×103cfu/μg，符合后續(xù)實驗要求。在四缺培養(yǎng)基做顯色反應有28個菌落呈藍色，挑取顯藍色的酵母菌落進行擴增，成功提取酵母質粒。

2.3 篩選的酵母質?；剞D含UL145基因的酵母菌中

采用電轉化法將成功提取的酵母質粒轉化到大腸桿菌中，菌液涂含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基，鑒定轉化后的文庫信息，將選出的7個陽性克隆質?；剞D到含誘餌載體pGBKT7?UL145的酵母細胞AH109中，菌液涂布于二缺及四缺固體培養(yǎng)基中生長狀況。送測序提示與UL145編碼蛋白發(fā)生相互作用的陽性克隆為7個，運用BLAST分析顯示其中3個克隆與FOXG1高度同源，見表1，圖2。

3 討論

圖2 轉化菌落的PCR鑒定Fig.2 Identification of transformed colonies by PCR

HCMV通過編碼蛋白實現(xiàn)對宿主的致病性，同時也決定其毒力的強弱［3］。目前認為HCMV臨床株含有19個新基因，位于長獨特序列UL與反向重復序列b’區(qū)的交界區(qū)（UL/b’區(qū)），在病毒體內復制、潛伏、免疫逃逸和對宿主的致病性方面起重要作用。而HCMVUL145正是這19個基因之一，具有高度保守性且為細胞核內調節(jié)因子直接與DNA相互作用，故UL145對病毒的復制和傳播可能起到重要作用［4］。文獻報道HCMVUL145基因含有兩種轉錄本結構，它既可以與上游的UL144基因形成多順反子轉錄，還可以在感染晚期做為單順反子轉錄［5］。臨床株HCMV UL145編碼蛋白似乎不是分泌型蛋白，它含有蛋白激酶C和酪蛋白激酶磷酸化位點，可以直接與核酸發(fā)生相互作用［6］。通過核轉染技術將UL129、UL145和UL148傳遞到ATM缺陷型細胞系胞核內，觀察其對基因組入核的影響，結果顯示UL129和UL145基因產物的過表達可能對細胞具有毒性［7］。

表1 陽性克隆與GeneBank同源序列比較Tab.1 Comparison of positive clones with samples available in GenBank and percent homology

本研究結果顯示HCMVUL145基因編碼產物與轉錄因子FOXG相互作用。FOXG1屬于Fork?head轉錄因子基因家族，進化上高度保守，細胞內定位受翻譯后控制，在胞質和胞核交替出現(xiàn)，具有轉錄活化和轉錄抑制雙重作用。FOXG1基因定位于人類最大的染色體—14號染色體上，1條或者2條同源染色體的FOXG1基因發(fā)生易位、缺失、突變等情況均導致神經系統(tǒng)疾病。FOXG1基因廣泛表達于大腦皮層，轉錄因子誘導FOXG1蛋白表達劑量不足［8］，可造成中樞神經系統(tǒng)發(fā)育障礙，表現(xiàn)為人腦體積縮小及形態(tài)異常，引起癲癇及智力低下。研究［9］表明FOXG1單倍劑量不足導致小鼠和人視皮質功能損傷。部分重要的神經系統(tǒng)疾病中發(fā)現(xiàn)FOXG1基因存在突變或失常，包括存在神經系統(tǒng)發(fā)育異常的瑞氏綜合征，其伴有早期癲癇和先天癥狀的多樣性和FOXG1基因的突變相關［10］。在孤獨癥譜系障礙疾病中，過多的GABA能神經元造成了體內谷氨酸/GABA神經元比率的失衡，被認為參與了孤獨癥譜系障礙疾病的發(fā)病過程中，而轉錄因子FOXG1過表達正是GABA能神經元產量過多的原因［11］。FOXG1的亞細胞定位可能在細胞分化、復制和生物能量轉化中起到重要作用，并將線粒體功能與胚胎發(fā)育和病理狀態(tài)相聯(lián)系起來［12］。

本研究推測HCMV入侵人體后UL145編碼蛋白通過改變其自身細胞定位，對正常細胞分化、復制產生影響，提示FOXG1在巨細胞病毒感染引起的中樞神經系統(tǒng)損傷也可能與此相關，其具體機制有待更深層次的功能性研究。未來的研究計劃是采用免疫共沉淀及pull down技術闡明HCMV UL145編碼蛋白與FOXG1之間的關系，為解釋本病的致病機理奠定分子基礎。

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（編輯 于溪）

Screening and Analysis of Proteins Interacting with HCMV UL145 from a Human Fetal Brain cDNA Library

ZOU Fei1，2，WANG Shuang1，WU Si1，SUN Zhengrong1
（1.BioBank，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Pediatrics，The First Hospital of Jilin University，Changchun 130021，China）

ObjectiveTo screen a human fetal brain cDNA library for proteins that can interact with HCMV UL145 using a yeast two?hybrid sys?tem.MethodsA bait plasmid（pGBKT7?UL145）was constructed.Using HCMVUL145as bait，a human fetal brain cDNA library was screened and proteins interacting withUL145were identified using bioinformatic methods to sequence and analyze the positive clones.ResultsThree clones interacting with HCMV UL145 were found，and identified as FOXG1.ConclusionSeveral proteins interacting with HCMV UL145 in the human fetal brain cDNA library were identified as FOXG1，indicating that this protein may play an important role in the course of HCMV infection.

human cytomegalovirus；UL145 protein；yeast two?hybrid system；human fetus brain cDNA library

R373

A

0258-4646（2017）04-0309-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.04.006

國家自然科學基金（81171581）

鄒飛（1983-），女，主治醫(yī)師，碩士.

孫崢嶸，E-mail：sunzr@sj?hospital.org

2016-10-12

網絡出版時間：