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    預(yù)知子籽提取物抑制HepG2肝癌細胞增殖作用及對SEPP1等分子表達的影響*

    2017-04-20 06:09:12盧文麗宋秋佳潘志強方肇勤
    關(guān)鍵詞:行氣活血肝癌基因

    盧文麗 宋秋佳 潘志強 方肇勤

    上海中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 (上海, 201203)

    原發(fā)性肝癌(PLC)是我國難治性惡性腫瘤之一,病死率高,腫瘤引發(fā)的侵襲、轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)是致死的主要原因[1]。在針對PLC的多種治療方法中,基于辨證論治理論的中醫(yī)藥療法,如健脾益氣、行氣活血、清熱解毒等治則治法及方藥,在預(yù)防和降低肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率等方面具有一定的優(yōu)勢[2~6]。我們前期研究發(fā)現(xiàn):行氣活血中藥預(yù)知子(又名八月札)具有抑制肝癌細胞增殖作用,且影響到HepG2肝癌細胞眾多基因,如整合素介導(dǎo)的細胞黏附通路基因表達。因此,我們擬進一步獲得預(yù)知子籽乙醇提取物(ATKS),設(shè)置不同的濃度和時間節(jié)點干預(yù)HepG2肝癌細胞,以觀察對其增殖和形態(tài)的影響;同時篩選該通路上的高表達基因SEPP1及其上游基因CAPNS1、ITGA2、ITGAV、ITGB1和ITGB5,觀察藥物作用后mRNA表達變化,以及SEPP1蛋白表達變化。

    1 材料與方法

    1.1 細胞株 HepG2人肝癌細胞株購自中國科學院上海細胞所。細胞置于含10% 胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液中,在37℃、5% CO2充分濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3~4 d 傳代一次,取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

    1.2 藥物與試劑 預(yù)知子購自上??禈蛑兴庯嬈邢薰尽PMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素-鏈霉素(100×)、0.25%胰酶-EDTA和Pierce BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自Thermo Fisher Scientific公司;四甲基偶氮哇藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma公司;Trizol購自Invitrogen 公司。鼠抗人SEPP1單克隆抗體購自Abcam公司,兔抗人GAPDH單克隆抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、BeyoECL Plus(超敏ECL化學發(fā)光試劑盒)等均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PrimeScriptTMRT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq均購自Takara公司。

    1.3 PCR引物設(shè)計及序列 引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成,引物序列見表1。

    表1 SEPP1等基因引物序列(5’-3’)

    1.4 主要儀器設(shè)備 R-220 SE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI );YJ-875G凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠);Model 310 二氧化碳培養(yǎng)箱(ThermoFisher);CKX41 熒光倒置相差顯微鏡(OLYMPUS);ELX-800 全自動酶標儀(BioTek Synerge 2,BioTek Instruments);7500 fast 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)(Life Technologies);WB小型垂直電泳槽(Bio-rad)、化學發(fā)光高靈敏度凝膠成像與分析系統(tǒng)FLuorChem E(Protein Simple)。

    1.5 中藥預(yù)知子乙醇提取物制備 乙醇回流法,從飲片中挑選出預(yù)知子的籽部分,60℃ 干燥過夜,粉碎;以10 倍量體積75%乙醇浸泡2h,80℃回流2 次,2h/次;合并回流液,過濾,濃縮,定容至0.5g /ml 濃度;濾過除菌,分裝標記,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.6 MTT法檢測細胞存活率 取對數(shù)生長期細胞接種入3 塊96 孔板中,過夜后待細胞融合率在50%作用,以不同濃度的預(yù)知子籽藥液(0.9mg/ml、1.2mg/ml、1.5mg/ml、1.8mg/ml、2.1mg/ml、2.4mg、2.7mg/ml、3.0 mg/ml)分別作用于細胞,另設(shè)空白組(無細胞及藥物)和對照組(含細胞,無藥物干預(yù)),每組設(shè)8個復(fù)孔。24 h、48 h 和72 h 后,分別進行MTT 檢測(72h檢測前于顯微鏡下觀察其細胞形態(tài)并快速拍照),吸棄原培養(yǎng)液后加入200μl /孔0.5 mg /ml MTT 溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,吸棄MTT 溶液,加入150μl /孔DMSO 溶液,避光振搖10 min 后,在全自動酶標儀490 nm 波長處檢測各孔的吸光度。計算細胞成活率(%) =(用藥孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%。

    1.7 分組及預(yù)知子提取物(ATKS)處理細胞 取對數(shù)生長期細胞接種入6 孔板中,過夜后待細胞融合率70~80%,以MTT檢測72h 致細胞抑制率約為50%的藥物濃度(即2.0mg/ml)作用于細胞,對照及中藥組均各設(shè)4個復(fù)孔。72h后,采用1×PBS漂洗各孔1次,再收集細胞,其中2孔用于提取RNA進行RT-qPCR,另2孔用于提取蛋白進行Western Blot實驗。

    1.7.1 RTqPCR方法檢測SEPP1 基因表達量 按Trizol 說明書抽提細胞總RNA,并按PrimeScript RTreagent Kit 和SYBR Premix Ex Taq說明書進行逆轉(zhuǎn)錄RT和實時熒光定量PCR,PCR反應(yīng)程序均為95℃×1min→95℃×30S,60℃×30s(40個循環(huán))。采用ΔΔCT法計算SEPP1基因mRNA相對表達量,以ACTB作為內(nèi)參基因。結(jié)束后取PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳。

    1.7.2 Western Blot檢測SEPP1 蛋白表達量 以RIPR裂解液[50mM Tris(pH 7.4),150mM NaCl,1% NP-40,0.5% sodium deoxycholate,0.1% SDS]收獲細胞,4℃條件下12000rpm離心15min,取上清液并測定蛋白濃度;蛋白上樣量為20μg,SDS-PAGE膠濃度為8%,蛋白被轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF膜上,SEPP1一抗(1:2000)4℃條件下?lián)u床孵育過夜,二抗(1:2000)室溫孵育1h,BeyoECL 顯色后采用成像與分析系統(tǒng)獲得條帶,以GAPDH作為內(nèi)參。采用Image J圖像軟件進行灰度值計算。

    2 結(jié)果

    2.1 ATKS對HepG2肝癌細胞存活率的影響 ATKS對HepG2肝癌細胞增殖存在抑制作用,且呈時效和量效關(guān)系,隨著時間延長,劑量加大,抑制作用越強。ATKS作用48h對HepG2肝癌細胞的半數(shù)抑制濃度約為2.3mg/ml;72h時間節(jié)點的半數(shù)抑制濃度約為2.0mg/ml,取該劑量用于后續(xù)實驗,見圖1。

    圖1 不同濃度和時間點ATKS對HepG2細胞的抑制作用

    2.2 ATKS干預(yù)72h對HepG2肝癌細胞形態(tài)的影響 在0.9mg/ml、1.2mg/ml等較低濃度ATKS作用下,細胞形態(tài)和數(shù)量幾乎沒有什么變化;隨著ATKS濃度的升高(1.5mg/ml~2.1 mg/ml),HepG2細胞數(shù)量逐漸減少,細胞形態(tài)開始受到影響;ATKS 2.4 mg/ml以上時細胞數(shù)量銳減,狀態(tài)變差,HepG2細胞所特有的重疊生長特征基本消失,藥物細胞毒作用凸顯,見插頁圖2。

    2.3 ATKS對SEPP1等基因表達量的影響 2.0mg/ml ATKS作用72h后,與對照組比較,SEPP1基因mRNA表達量明顯降低,其余5個基因卻出現(xiàn)上調(diào)趨勢,見表2和圖3。

    表2 ATKS作用72h后各基因表達量變化

    與對照組比較,*P< 0.05

    圖3 ATKS作用72h后各基因表達量變化

    2.4 ATKS對SEPP1蛋白表達量的影響 2.0mg/ml ATKS作用于HepG2細胞72h后,SEPP1蛋白表達量明顯降低,其相對表達量(SEPP1/GAPDH)為0.642±0.070(P< 0.05)。與mRNA表達量變化趨勢存在一致性。見圖4,圖5。

    圖4 ATKS作用72h后SEPP1蛋白表達量變化

    圖5 ATKS作用72h SEPP1蛋白條帶

    3討論

    我們早期針對肝癌臨床辨證論治的流行病學調(diào)查研究[2-4],以及相應(yīng)中藥復(fù)方用藥規(guī)律的回顧性分析發(fā)現(xiàn),各治法下所使用藥物及頻次有其客觀規(guī)律[5,6]:行氣活血藥中,預(yù)知子(又名八月扎)、丹參、赤芍、桃仁、柴胡、郁金使用較多,其中預(yù)知子的用藥頻次接近43%,提示其在肝癌治療用藥中的重要性。但是,以往預(yù)知子在腫瘤抑制方面的機制研究較少,推測與預(yù)知子多以組分的形式出現(xiàn)在腫瘤治療的復(fù)方中有關(guān)。僅有少量研究報導(dǎo),預(yù)知子水提物、預(yù)知子籽醇提物、以及從預(yù)知子中提取的木通皂苷類成分具有抗腫瘤活性[13,15]。因此,預(yù)知子的藥效及作用機制存在較大的研究空間,涉及單味藥、聯(lián)合用藥以及有效成分等多個方面。

    因此,我們采用健脾益氣、行氣活血、清熱解毒等治法代表性復(fù)方制劑,進行體外實驗,觀察其對肝癌細胞惡性增殖作用的影響,發(fā)現(xiàn)行氣活血復(fù)方對肝癌細胞惡性增殖具有一定的抑制作用,且隨著劑量的加大,其抑制肝癌細胞增殖的作用顯著增強[7]。我們進一步在行氣活血復(fù)方中篩選可能起著主要作用的藥物,發(fā)現(xiàn)預(yù)知子的抑制作用值得關(guān)注[8]。之后,進一步分拆預(yù)知子的不同部位,發(fā)現(xiàn)預(yù)知子籽的藥效最為顯著[9,10]。預(yù)知子籽的正丁醇萃取物影響到HepG2細胞眾多通路基因表達,其中整合素介導(dǎo)的細胞黏附通路(KEGG PATHWAY Database)值得關(guān)注,而前期芯片結(jié)果顯示,藥物未作用前,SEPP1及其上游的CAPNS1、ITGA2、ITGAV、ITGB1和ITGB5等6個基因是該通路中最高及較高的差異表達基因[11]。SEPP1基因與多種腫瘤相關(guān),涉及細胞黏附、轉(zhuǎn)移、增殖等[12~16]。在涉及腫瘤組織SEPP1的表達及調(diào)控機制時,多圍繞抗氧化應(yīng)激展開,但許多內(nèi)在機制仍未被闡明。

    在此背景下,我們進一步設(shè)置了不同的濃度和時間節(jié)點,觀察到預(yù)知子籽的乙醇提取物(ATKS)確實能有效抑制HepG2肝癌細胞增殖,并具有量效和時效關(guān)系;ATKS處理后SEPP1基因表達明顯下調(diào),CAPNS1、ITGA2、ITGAV、和ITGB1等基因表達上調(diào),與前期芯片結(jié)果一致;但是ITGB5的上調(diào)趨勢與前期芯片結(jié)果相反,可能是由于預(yù)知子籽的正丁醇萃取物和乙醇萃取物中有效成分差異所致。此外,鑒于SEPP1是該通路中的最高表達基因,且與其他基因存在不同的變化趨勢,我們進一步觀察了其在蛋白層面上的變化,發(fā)現(xiàn)與其mRNA水平的變化存在一致性的下調(diào)??傮w上認為,以上基因或蛋白層面上的變化,體現(xiàn)了ATKS對HepG2細胞增殖抑制作用的部分機制。

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