ELISA法在植物檢測(cè)中的應(yīng)用研究及改進(jìn)措施

張黎鳳++馬天文++曹海艷

摘要 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）目前是酶聯(lián)免疫技術(shù)中應(yīng)用最廣的方法。詳細(xì)分析了ELISA的基本原理，并對(duì)其基本類型及在植物病毒檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了研究。最后在理論分析的基礎(chǔ)上結(jié)合工作經(jīng)驗(yàn)，從提高ELISA的靈敏度、保持ELISA檢測(cè)的穩(wěn)定性、特異性、檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法等方面提出改進(jìn)策略，并對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞 酶聯(lián)免疫吸附法；植物病毒檢測(cè)；靈敏度；改進(jìn)策略

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）24-0137-02

早期植物病毒病的檢測(cè)一般采用傳統(tǒng)的生物學(xué)方法，而這種單一的生物學(xué)檢測(cè)病毒的方法需要耗費(fèi)大量的人力和物力，必須培育大量的接種植物，此法不僅費(fèi)工費(fèi)時(shí)，而且病毒癥狀表現(xiàn)的時(shí)間也較長(zhǎng)。因此，尋找靈敏度高、快速、可靠的植物病毒病檢測(cè)方法迫在眉睫。自從扇葉病毒向草本寄主轉(zhuǎn)接獲得成功后，免疫學(xué)技術(shù)開始蓬勃發(fā)展。免疫學(xué)技術(shù)包括細(xì)胞免疫技術(shù)、免疫制備技術(shù)、免疫血清學(xué)技術(shù)，其中以血清學(xué)技術(shù)應(yīng)用的最為普遍。血清學(xué)方法檢測(cè)植物病毒是利用血清反應(yīng)原理實(shí)現(xiàn)的。由于每一種植物病毒產(chǎn)生的抗血清都有各自的特性，因此通過(guò)已知病毒的抗血清可鑒定病毒種類。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是血清學(xué)技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的一種方法，并已滲透到各個(gè)研究領(lǐng)域，該方法是以酶催化的顏色反應(yīng)來(lái)指示抗原抗體的結(jié)合[1-2]。由于其具有靈敏、快速、特異性強(qiáng)、分析率高、花費(fèi)少等優(yōu)點(diǎn)，可用于大規(guī)模樣品調(diào)查，因此成為檢測(cè)植物病毒的關(guān)鍵技術(shù)。

1 酶聯(lián)免疫吸附法的基本原理

ELISA的基本原理是將酶標(biāo)記同抗原或抗體物理性地吸附于固相載體表面與酶的催化作用結(jié)合，并保持其免疫活性。酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其反應(yīng)的特異性，又保留了酶的活性。在測(cè)定時(shí)，ELISA用固相載體吸附抗原或抗體，固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物通過(guò)洗滌的方式與液體中的其他物質(zhì)分開，再加入通過(guò)酶標(biāo)記反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體，酶結(jié)合物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，此時(shí)待測(cè)抗原或抗體與有色產(chǎn)物的量呈一定的比例[3-4]。故可根據(jù)底物顯色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法具有很高的敏感度。

2 酶聯(lián)免疫吸附法的基本類型

ELISA目前是酶聯(lián)免疫技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。ELISA既可以用來(lái)測(cè)定抗原，也可以用來(lái)測(cè)定抗體。在使用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定時(shí)必須具有3種試劑，即固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）、酶標(biāo)記的抗體或抗原（結(jié)合物）、酶作用的底物。從酶聯(lián)免疫技術(shù)建立開始，經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)，已形成了各種不同類型的檢測(cè)方法。常用的方法有雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法和間接法等。這些方法的靈敏度較高、特異性強(qiáng)，已廣泛用于病毒的檢測(cè)。

2.1 雙抗體夾心法測(cè)抗原

雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，適用于檢測(cè)多價(jià)抗原。樣品中的被檢測(cè)抗體分子分別與固相載體上的抗原和酶標(biāo)記的抗原相結(jié)合。包被特異性抗體與固相載體連接，經(jīng)洗滌加入含抗原的待測(cè)樣品使其與過(guò)量固相抗體結(jié)合，保溫反應(yīng)，形成復(fù)合物。再加入酶標(biāo)記特異性抗體，保溫反應(yīng)?？乖c酶標(biāo)記特異性抗體在固相復(fù)合物上相結(jié)合，洗滌未結(jié)合的。加入底物顯色，酶催化底物顯色，根據(jù)顯色程度，求出樣品中抗原的量（圖1）。

2.2 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原

小分子抗原可以采用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原。特異性抗體吸附到固相載體的表面，經(jīng)過(guò)洗滌后分為a/b 2種情況：a組加酶標(biāo)記抗原和被測(cè)抗原混合物，經(jīng)過(guò)溫育洗滌后加入底物顯色；b組僅僅加入酶標(biāo)記抗原，經(jīng)過(guò)溫育洗滌后加入底物顯色。a/b 這2組底物降解量的差就是所要測(cè)定的抗原的量（圖2）。

2.3 間接法測(cè)抗體

間接法測(cè)抗體也是常常采用的方法之一，酶標(biāo)記抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原。包被抗原經(jīng)過(guò)洗滌加含有抗體的樣品溫育反應(yīng)，再洗滌后加入酶標(biāo)記抗體，溫育洗滌后，加入底物顯色（圖3）。

3 酶聯(lián)免疫吸附法的應(yīng)用

伴隨與其他學(xué)科新技術(shù)的融合和其本身具有的優(yōu)點(diǎn)，ELISA得以廣泛的應(yīng)用。ELISA可以用于檢測(cè)一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測(cè)定溶液中的可溶性抗原。目前，國(guó)內(nèi)外在ELISA 檢測(cè)植物病毒方面做了大量的研究工作。

ELISA在植物病毒中的應(yīng)用：ElISA技術(shù)具有專屬性很強(qiáng)的特點(diǎn)，不僅可以測(cè)定不同病毒之間的親緣關(guān)系及株系關(guān)系，鑒別親緣關(guān)系很近的病毒，還可以對(duì)同一種病毒的不同的血清類型區(qū)分，有助于測(cè)定病毒株系和血清型的分化；可研究植物變異株系的分布情況對(duì)植物病毒的流行病學(xué)進(jìn)行研究；ELISA病毒檢測(cè)是實(shí)現(xiàn)無(wú)毒化栽培的關(guān)鍵，可以通過(guò)對(duì)樣品的初步檢測(cè)，篩選脫毒苗木；ELISA可檢測(cè)植物的真菌和細(xì)菌；檢測(cè)種子的健康，由于靈敏度比較高，可以測(cè)定單個(gè)種子中的植物病毒抗原，還可以檢測(cè)未發(fā)芽種子內(nèi)的某一微小部分如種皮、種胚、胚乳上的病毒，提供快速、準(zhǔn)確的種子質(zhì)量認(rèn)證和植物檢疫認(rèn)證，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比節(jié)約了大量的時(shí)間、人力和物力；可以大規(guī)模檢測(cè)果樹、葡萄、草莓等經(jīng)濟(jì)作物中的病毒；檢測(cè)傳播介體、土壤、播種工具中的植物病毒，對(duì)病情的預(yù)防和及時(shí)采取防治措施都有重要的影響；可以檢測(cè)自然寄主中的植物病毒；分子生物學(xué)中進(jìn)行樣品的篩選，可以用ELISA區(qū)分陰陽(yáng)性樣品，再用PCR進(jìn)一步判斷。

4 酶聯(lián)免疫吸附法的改進(jìn)提高

4.1 提高ELISA檢測(cè)靈敏度的方法

酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng)，ELISA樣品的前處理在檢測(cè)中處于重要地位。不同的前處理方式對(duì)檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果[5]。以植物樣品為例，選取不同的陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和抗血清濃度都會(huì)影響到檢測(cè)結(jié)果。病毒的檢測(cè)不僅要選擇合適的檢測(cè)方法，而且樣品的取樣部位和取樣時(shí)間都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。因此，在ELISA分析中樣品的前處理至關(guān)重要。根據(jù)不同的待測(cè)樣品，選取與之適合的前處理方式是建立高靈敏度的檢測(cè)方法的首要條件。

抗原、抗體的固相化在ELISA檢測(cè)系統(tǒng)中有著重要的地位，親和力常數(shù)越高，ELISA方法靈敏度就越高?？乖?、抗體的固相化是固相免疫測(cè)定的前提。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，物理吸附技術(shù)是一種簡(jiǎn)單的固定技術(shù)，但在此過(guò)程中會(huì)發(fā)生折疊，惰性蛋白封閉劑會(huì)遮蔽功能部位，進(jìn)而影響了生物分子的功能，檢測(cè)的靈敏度就會(huì)受到影響?；瘜W(xué)共價(jià)偶聯(lián)方法比物理吸附方法的固定強(qiáng)度高、特異性好，可以提高ELISA檢測(cè)的靈敏度。提高ELISA檢測(cè)的靈敏度需要采取合適的方法制備出親和力強(qiáng)的抗體，先進(jìn)的固相化技術(shù)，為抗原或抗體提供適當(dāng)?shù)沫h(huán)境[6-7]。

4.2 保持ELISA檢測(cè)的穩(wěn)定性

穩(wěn)定劑一般由蛋白質(zhì)、緩沖液、糖類、防腐劑和其他一些能夠起穩(wěn)定作用的物質(zhì)組成。商業(yè)化免疫檢測(cè)試劑的酶結(jié)合物穩(wěn)定劑大多不公開，性能也存在著一定的差異，開發(fā)出性能較好的酶結(jié)合物穩(wěn)定劑，是維持免疫檢測(cè)穩(wěn)定性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

4.3 確保ELISA檢測(cè)的特異性

在選擇ELISA檢測(cè)方法的抗體時(shí)，應(yīng)該避免選用交叉反應(yīng)嚴(yán)重的抗體以確保檢測(cè)的特異性。在保證檢測(cè)靈敏度的前提下，調(diào)整好合適的酶濃度控制好檢測(cè)背景，可確保ELISA檢測(cè)的特異性。

4.4 ELISA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

ELISA操作步驟繁復(fù)，影響試驗(yàn)結(jié)果的因素較多，固相介質(zhì)表面的吸附能力和抗原、抗體之間的相互作用是直接影響ELISA檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵性因素。因此在定量測(cè)定時(shí)，不同的樣品用不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在同等條件下制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)區(qū)域。

一般的信號(hào)系統(tǒng)是通過(guò)酶催化底物顯色，通過(guò)顯色的情況對(duì)被檢測(cè)的物質(zhì)進(jìn)行分析。一些微量待測(cè)物質(zhì)在樣品中的含量比較低，在樣品的前處理過(guò)程中可能存在提取不徹底等原因，致使ELISA的信號(hào)系統(tǒng)對(duì)待測(cè)物不能準(zhǔn)確的定量?？赏ㄟ^(guò)使用信號(hào)放大系統(tǒng)進(jìn)行修正。合理的信號(hào)放大有利于提高ELISA檢測(cè)的靈敏度。

5 展望

ELISA方法具有選擇性好、靈敏度高、設(shè)備價(jià)格便宜、折舊損耗小等請(qǐng)多的優(yōu)點(diǎn)，在人類、動(dòng)物、植物、微生物、環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。但是ELISA技術(shù)也有其局限性和不足。而生物技術(shù)發(fā)展迅速，如dsRNA分析、分子雜交、PCR等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，使得病毒檢測(cè)的方法得到補(bǔ)充和完善。相信在各個(gè)領(lǐng)域里會(huì)有廣泛的應(yīng)用前景。

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