藏藥甘肅馬先蒿有效成分提取工藝研究Δ

曹馨元，李茂星，毛 婷，陶 銳，王先敏，劉延彤，馬 強(qiáng)（.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科/全軍高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 70050；2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 70000；.銀川市婦幼保健院藥劑科，銀川75000；.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院消化科，蘭州 70050）

·民族醫(yī)藥·

藏藥甘肅馬先蒿有效成分提取工藝研究Δ

曹馨元1，2＊，李茂星1，2#，毛 婷1，2，陶 銳3，王先敏1，劉延彤1，馬 強(qiáng)4（1.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科/全軍高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050；2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730000；3.銀川市婦幼保健院藥劑科，銀川750001；4.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院消化科，蘭州 730050）

目的：優(yōu)化藏藥甘肅馬先蒿提取工藝并比較不同產(chǎn)地甘肅馬先蒿中2種成分毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷的含量差異。方法：以毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷及干膏得率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)提取溶劑、溶劑量、提取時(shí)間及提取次數(shù)進(jìn)行考察以優(yōu)化提取工藝，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。比較甘肅、青海及四川3個(gè)產(chǎn)地的甘肅馬先蒿中2種成分毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷的含量。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝為加8倍量的50%乙醇提取3次，每次90 min。驗(yàn)證試驗(yàn)中毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷含量及干膏得率平均值分別為3.49%、1.26%、37.99%（RSD分別為1.28%、1.32%、1.97%，n＝3）。以青海產(chǎn)甘肅馬先蒿中毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷含量相對(duì)較高。結(jié)論：優(yōu)化的提取工藝合理、穩(wěn)定、可行，不同產(chǎn)地的甘肅馬先蒿中指標(biāo)成分的含量存在一定的差異。本試驗(yàn)可為甘肅馬先蒿提取物的開發(fā)利用、藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)的深入研究提供依據(jù)。

甘肅馬先蒿；毛蕊花糖苷；異毛蕊花糖苷；正交試驗(yàn)；提取工藝；含量比較

藏藥甘肅馬先蒿是玄參科馬先蒿屬植物，廣泛分布在甘肅省、青海省及四川省海拔1 825～4 000 m的地區(qū)[1]。對(duì)該植物進(jìn)行的化學(xué)成分研究表明，該植物富含苯乙醇苷、環(huán)烯醚萜苷、黃酮、生物堿等多種化合物，同時(shí)具有滋陰補(bǔ)腎、補(bǔ)中益氣、健脾和胃、清熱解毒、利尿、保肝等作用[2-5]。毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷是苯乙醇苷類的主要成分，因具有抗炎、抗腫瘤、保肝、抗病毒、增強(qiáng)記憶等多種藥理作用[1，6-9]，受到廣大學(xué)者的關(guān)注。目前關(guān)于甘肅馬先蒿中苯乙醇苷類成分定量測定的文獻(xiàn)報(bào)道較少，筆者以毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的含量及干膏得率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)[10-12]，考察其最優(yōu)提取工藝；同時(shí)，對(duì)3種不同產(chǎn)地甘肅馬先蒿中的毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷的含量進(jìn)行比較，以期為該藏藥材的開發(fā)利用及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考，為其單體生物活性的進(jìn)一步研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

600-996系列高效液相色譜（HPLC）儀，包括1525四元梯度泵、2998二極管陣列檢測器、2707自動(dòng)進(jìn)樣器、TCM柱溫箱（美國Waters公司）；BP210S電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

3種不同產(chǎn)地甘肅馬先蒿分別于2014年8月采自甘肅省武威市天?？h天堂鄉(xiāng)、青海省西寧市、四川省諾爾蓋草原，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志剛教授鑒定為玄參科馬先蒿屬甘肅馬先蒿（Pedicularis kansuensis Maxim）的干燥根莖；毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷對(duì)照品（均由本實(shí)驗(yàn)室于2015年8月自制，經(jīng)質(zhì)譜、核磁共振確定其結(jié)構(gòu)，HPLC法測定其含量均大于97.5%）；75%乙醇（山東利爾康消毒科技股份有限公司，批號(hào)：130619）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測定毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的含量

[13-14]方法測定。

2.1.1 色譜條件 色譜柱為SinoChrom ODS-BP（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-水（B）（35∶65）等度洗脫，流速為1 mL/min；檢測波長為330 nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取10 g天堂鄉(xiāng)甘肅馬先蒿藥材，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案提取后合并乙醇提取液，過濾，即得。

2.1.3 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷對(duì)照品5.00 mg，分別置于10 mL量瓶中，以35%甲醇溶解定容至刻度，并將2種對(duì)照品溶液等量混合即得。

2.1.4 專屬性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品與供試品溶液（正交試驗(yàn)3號(hào)）各適量，進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，供試品中的毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷譜峰與相鄰成分的色譜峰可達(dá)到基線分離，其他成分對(duì)測定無干擾。理論板數(shù)以毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷計(jì)均大于3 000，目標(biāo)成分與相鄰峰間的分離度大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液100、300、500、900、1 100、1 300 μL定容至5 mL，進(jìn)樣測定。分別以毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為y＝1 387 714.03x－238 358.05（r2＝0.999 6）、y＝849 105.78x－351 765.15（r2＝0.999 7）。結(jié)果表明二者檢測質(zhì)量濃度線性范圍為5～65 μg/mL。

2.1.6 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按相關(guān)方法學(xué)要求進(jìn)行試驗(yàn)。精密度試驗(yàn)中毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.75%、0.27%（n＝6）；24 h穩(wěn)定性試驗(yàn)中RSD分別為1.80%、1.38%（n＝6）；重復(fù)性試驗(yàn)中RSD分別為1.92%、1.51%（n＝6）；準(zhǔn)確度試驗(yàn)中加樣回收率分別為102.32%、99.65%（RSD分別為2.03%、1.94%，n＝6）。

2.1.7 樣品含量測定 取供試品溶液3份，以“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算含量即得。

2.2 干膏得率的測定

參考文獻(xiàn)[15]方法測定。精密量取供試品溶液10 mL，置于干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃烘干至恒質(zhì)量，取出，冷卻后精密稱定，計(jì)算干膏得率（干膏質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%）。

2.3 提取工藝單因素考察試驗(yàn)

2.3.1 提取溶劑的考察 分別稱取天堂鄉(xiāng)甘肅馬先蒿6份，每份10 g，分別加入10倍量10%、30%、50%、70%、90%的乙醇及水，加熱回流提取2次，每次60 min，濾過，合并2次濾液。精密量取10 mL濾液，以相應(yīng)的溶劑定容至100 mL，進(jìn)樣，測定提取液中毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的含量。結(jié)果各體積分?jǐn)?shù)乙醇及水提取后毛蕊花糖苷的含量分別為1.06%、1.87%、2.17%、1.99%、1.89%、1.01%，異毛蕊花糖苷的含量分別為0.74%、0.88%、0.85%、0.76%、0.74%、0.59%。這提示50%乙醇提取液中2種成分含量相對(duì)較高，故采用50%乙醇為提取溶劑進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.3.2 提取溶劑量的考察 除提取溶劑選取50%乙醇外，其余操作及條件同“2.3.1”項(xiàng)，考察分別加入6、8、10、12、15、20倍量50%乙醇后提取液中2種成分的含量。結(jié)果毛蕊花糖苷的含量分別為2.37%、3.09%、2.43%、2.10%、1.82%、1.61%，異毛蕊花糖苷的含量分別為0.74%、0.89%、0.84%、0.81%、0.73%、0.66%。采用8～12倍量乙醇進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.3.3 提取時(shí)間的考察 除提取溶劑選取8倍量50%乙醇外，其余操作及條件同“2.3.1”項(xiàng)，考察每次分別提取30、60、90、120、150、180 min后提取液中2種成分的含量。結(jié)果毛蕊花糖苷的含量分別為2.11%、2.59%、3.17%、2.02%、1.89%、1.77%，異毛蕊花糖苷的含量分別為0.84%、0.97%、1.18%、0.81%、0.76%、0.60%。采用提取30～90 min進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.3.4 提取次數(shù)的考察 除提取溶劑選取8倍量50%乙醇、每次提取90 min外，其余操作及條件同“2.3.1”項(xiàng)，分別考察加熱回流提取1、2、3、4、5次后提取液中2種成分的含量。結(jié)果毛蕊花糖苷的含量分別為2.02%、2.14%、2.58%、1.95%、1.70%，異毛蕊花糖苷的含量分別為0.83%、0.97%、1.21%、0.86%、0.72%。采用提取次數(shù)1～3次進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

分別稱取天堂鄉(xiāng)甘肅馬先蒿6份，每份10 g，根據(jù)單因素考察結(jié)果，以50%乙醇為提取溶劑，以溶劑量（A，倍）、提取時(shí)間（B，min）、提取次數(shù)（C）為考察因素，選用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以干膏得率、毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷的含量3項(xiàng)考察指標(biāo)的綜合評(píng)分優(yōu)化工藝，權(quán)重系數(shù)分別為0.2、0.4、0.4，綜合評(píng)分＝（毛蕊花糖苷含量/最高毛蕊花糖苷含量）×0.4×100+（異毛蕊花糖苷含量/最高毛蕊花糖苷含量）×0.4×100+（干膏得率/最高干膏得率）×0.2×100。各因素與水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

直觀分析結(jié)果顯示，3個(gè)因素的主次關(guān)系為B＞C＞A；每個(gè)因素的3個(gè)水平之間的趨勢為A1＞A2＞A3、B3＞B2＞B1、C3＞C1＞C2。故確定最優(yōu)工藝為A1B3C3，即8倍量50%乙醇提取3次，每次90 min。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了保證提取工藝的重復(fù)性及可行性，對(duì)優(yōu)化的方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。稱取天堂鄉(xiāng)甘肅馬先蒿3份，每份200 g，分別加入8倍量的50%乙醇溶液，提取3次，每次90 min，濾過，合并2次濾液。精密量取10 mL濾液，以相應(yīng)的溶液定容至100 mL，取樣測定，計(jì)算得提取液中毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的含量，詳見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of verification test

表4結(jié)果表明，該優(yōu)化的醇提工藝穩(wěn)定、重復(fù)性好。

2.6 不同產(chǎn)地甘肅馬先蒿毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷含量測定

分別稱取甘肅天堂鄉(xiāng)、青海西寧及四川諾爾蓋的甘肅馬先蒿各10 g，按照“2.4”項(xiàng)確定的提取工藝進(jìn)行提取，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定各成分的峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地甘肅馬先蒿中毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷含量存在一定的差異，詳見表5。

表5 不同產(chǎn)地甘肅馬先蒿中指標(biāo)成分的含量測定結(jié)果（n＝6）Tab 5 Determination results of index constituents in P.kansuensis from different habitats（n＝6）

3 討論

考慮到苯乙醇苷類成分化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基基團(tuán)，提取溶劑的極性大小將對(duì)該類化合物的提取率影響顯著，故本試驗(yàn)在單因素考察過程中優(yōu)先選用了10%、30%、50%、70%、90%的乙醇及水為提取溶劑，結(jié)果顯示毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加，且以50%乙醇提取所得目標(biāo)成分含量最高。同時(shí)考察了不同提取溶劑用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)目標(biāo)成分提取率的影響，并以毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷及干膏得率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化藏藥甘肅馬先蒿中目標(biāo)成分的醇提工藝。結(jié)果表明，提取時(shí)間及提取次數(shù)影響顯著，提取溶劑的量影響較小。優(yōu)化所得的最優(yōu)工藝為8倍量50%乙醇提取3次，每次90 min。本試驗(yàn)在測定過程中嚴(yán)格控制了各因素水平，確保了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性。

本文以藏藥甘肅馬先蒿中主要苯乙醇苷類成分毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷為檢測指標(biāo)，篩選出提取工藝，較以單一成分為指標(biāo)進(jìn)行篩選更為科學(xué)合理、省時(shí)節(jié)能，為藏藥甘肅馬先蒿苯乙醇苷類成分的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了重要依據(jù)。

本試驗(yàn)采用HPLC法考察了3個(gè)不同產(chǎn)地甘肅馬先蒿的品質(zhì)差異，結(jié)果指標(biāo)成分含量均有差異，可能與藥材所生長的地區(qū)海拔、氣候等因素有關(guān)。此結(jié)果可為進(jìn)一步保護(hù)資源、開發(fā)擴(kuò)大用藥部位及資源的可持續(xù)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Li MX，He XR，Tao R，et al.Phytochemistry and pharmacology of the genus Pedicularis used in traditional Chinese medicine[J].Am J Chin Med，2014，42（5）：1071-1098.

[2] 李茂星，曹馨元，陶銳，等.HPLC測定馬先蒿屬植物中的桃葉珊瑚苷[J].華西藥學(xué)雜志，2015，30（6）：718-719.

[3] 曹馨元，曹文龍，陶銳，等.HPLC法測定不同產(chǎn)地馬先蒿屬植物中的毛蕊花苷[J].中成藥，2016，38（1）：126-129.

[4] Zhang BB，Shi K，Liao ZX，et al.Phenylpropanoid glycosides and triterpenoid of Pedicularis kansuensis Maxim [J].Fitoterapia，2011，82（6）：854-860.

[5] Hongbiao C，Ninghua T，Yumei Z.Chemical constituents from Pedicularis rex C.B.Clarke[J].Zeitschrift Für Naturforschung，2007，62（11）：1465-1470.

[6] Arthur H，Joubert E，De Beer D，et al.Phenylethanoid glycosides as major antioxidants in Lippia multiflora herbal infusion and their stability during steam pasteurisation of plant material[J].Food Chem，2011，127（2）：581-588.

[7] Laleh K，Abbas D，F(xiàn)arzaneh L，et al.Antioxidant and antimicrobial activity of Pedicularis sibthorpii Boiss.and Pedicularis wilhelmsiana Fisch ex[J].Adv Pharm Bull，2012，2（1）：89-92.

[8] Zhou B，Li M，Cao X，et al.Phenylethanoid glycosides of Pedicularis muscicola Maxim ameliorate high altitudeinduced memory impairment[J].Physiol Behav，2016，157：39-46.

[9] Luo X，Li JY，Xu YH，et al.Preventive effect of phenylethanoid glycosides from Cistanche Salsa on rats with high-altitude cerebral edema[J].Central South Pharmacy，2014，12（7）：747-750.

[10] 黃木土，廖懷回，肖俊峰，等.腎衰康顆粒的提取純化工藝研究[J].中藥材，2015，38（6）：1306-1308.

[11] 于寧，何承輝，黃偉，等.香青蘭有效成分提取工藝考察及不同產(chǎn)地香青蘭中有效成分量的比較[J].中草藥，2015，46（6）：846-852.

[12] 李玲，王冰，張彤，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選左歸丸的醇提和水提工藝[J].中藥材，2015，38（8）：1724-1727.

[13] 李茂星，張超，烏蘭，等.HPLC法測定藏藥螃蟹甲中苯乙醇苷類化合物的含量[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2011，29（5）：379-381.

[14] 楊素德，胡軍華，李家春，等.HPLC法同時(shí)測定蓯蓉總苷膠囊中松果菊苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的含量[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015，17（3）：609-613.

[15] 沈濤，李季文，梁海寧，等.多指標(biāo)優(yōu)選益氣固本顆粒澄清工藝[J].中國藥房，2016，27（1）：76-79.

Study on the Extraction Technology for Active Constituents of Tibetan Medicine Pedicularis kansuensis

CAO Xinyuan1，2，LI Maoxing1，2，MAO Ting1，2，TAO Rui3，WANG Xianmin1，LIU Yantong1，MA Qiang4（1.Dept.of Pharmacy，Lanzhou General Hospital of PLA&Key Laboratory of the Prevention and Cure for the Plateau Environment Damage，PLA，Lanzhou 730050，China；2.College of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；3.Dept.of Pharmacy，Yinchuan Maternity and Child-care Hospital，Yinchuan 750001，China；4. Dept.of Gastroenterology，Lanzhou General Hospital of PLA，Lanzhou 730050，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Tibetan medicine Pedicularis kansuensis and compare content of verbascoside and isoverbascoside differences in P.kansuensis from various habitats.METHODS：Using verbascoside and isoverbascoside and dry paste yield as comprehensive evaluation indexes，single factor test and orthogonal test were used to investigate the extraction solvent，solvent dosage，extraction time and times to optimize extraction technology，and the verification test was conducted.Contents of the 2 constituents verbascoside and isoverbascoside in P.kansuensis from Gansu，Qinghai and Sichuan werecompared.RESULTS：The optimal extraction technology was as follows as 8-fold 50%ethanol，extraction for 3 times，90 min each time.The verification results showed that the average contents of verbascoside and isoverbascoside were 3.49%（RSD＝1.28%，n＝3），1.26%（RSD＝1.32%，n＝3），and average dry paste yields were 37.99%（RSD＝1.97%，n＝3）.The contents of verbascoside and isoverbascoside in P.kansuensis from Qinghai were relatively higher.CONCLUSIONS：Optimized extraction technology is reasonable，stable，feasible；the contents of index constituents in P.kansuensis from different habitats have certain differences.The study can provide scientific evidence for the development and utilization of extraction，and the in-depth study of quality evaluation for medicinal material.

Pedicularis kansuensis；Verbascoside；Isoverbascoside；Orthogonal test；Extraction technology；Content comparison

R284.2

A

1001-0408（2017）10-1357-04

2016-06-02

2016-07-28）

（編輯：劉 萍）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81374019）；甘肅省中醫(yī)藥管理局科研課題（No.GZK-2015-59）；全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金課題（No.CLZ15JA05）

＊碩士研究生。研究方向：天然藥物化學(xué)、中藥新藥研究與開發(fā)。電話：0931-8994676。E-mail：caoxy2014@aliyun.com

#通信作者：副教授，博士。研究方向：中藥活性成分研究與開發(fā)。電話：0931-8994676。E-mail：limaox2005@aliyun.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.16