香葉木素的檢測(cè)方法與生物活性及其機(jī)制研究進(jìn)展

楊蕾磊，陳科力（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2014級(jí)，武漢 430065；2.教育部中藥資源和中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065）

香葉木素的檢測(cè)方法與生物活性及其機(jī)制研究進(jìn)展

楊蕾磊1＊，陳科力2#（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2014級(jí)，武漢 430065；2.教育部中藥資源和中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065）

目的：為香葉木素的研究與開發(fā)提供參考。方法：以“香葉木素”“生物活性”“Diosmetin”“Bioactivity”等為關(guān)鍵詞，組合查詢2000年1月－2016年3月在PubMed、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普等數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)香葉木素的檢測(cè)方法和生物活性及其機(jī)制進(jìn)行綜述。結(jié)果與結(jié)論：共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)50篇，其中有效文獻(xiàn)24篇。香葉木素可采用毛細(xì)管電泳-電化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、高效液相色譜法等方法進(jìn)行檢測(cè)，其具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤及雌激素樣作用。在信號(hào)通路、基因和相關(guān)蛋白酶的調(diào)控方面的研究，為香葉木素作為新型高效、低毒的抗癌輔助藥物開發(fā)提供了可能。建議加強(qiáng)香葉木素提取工藝、體內(nèi)藥效學(xué)和提高生物利用度的藥劑學(xué)研究，并對(duì)其用藥安全性進(jìn)行考察。

香葉木素；黃酮類化合物；生物活性；檢測(cè)方法

香葉木素是天然黃酮類化合物的一種，化學(xué)名稱為3′，5，7-三羥基-4′-甲氧基黃酮。香葉木素為黃色粉末，熔點(diǎn)為256～258℃，分子式為C16H12O6，分子量為300.26。可溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑。結(jié)構(gòu)式中3′，5，7這3個(gè)位置的羥基和C2＝C3雙鍵決定了香葉木素獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)活性，其中7位酚羥基可與不同的糖基結(jié)合發(fā)生糖苷化反應(yīng)而表現(xiàn)出不同的生物學(xué)活性。香葉木素在自然界中分布廣泛，主要以游離型或糖苷型存在，目前發(fā)現(xiàn)主要存在于菊花[1-2]、留蘭香[3]、蜘蛛香[4]等天然藥物和檸檬[5]、花生[6]等果實(shí)中。由于黃酮類化合物是人們?nèi)粘ｏ嬍车闹匾M成部分，且近年來(lái)飲食中的黃酮類化合物對(duì)癌癥的化學(xué)預(yù)防作用是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，因此筆者以“香葉木素”“生物活性”“Diosmetin”“Bioactivity”等為關(guān)鍵詞，組合查詢2000年1月－2016年3月在PubMed、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普等數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)文獻(xiàn)。結(jié)果，共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)50篇，其中有效文獻(xiàn)24篇?，F(xiàn)對(duì)香葉木素的檢測(cè)方法和生物活性及其機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為其研究與開發(fā)提供參考。

1 香葉木素的檢測(cè)方法

香葉木素可采用毛細(xì)管電泳-電化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、高效液相色譜法等方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.1 毛細(xì)管電泳-電化學(xué)法

毛細(xì)管電泳具有分析速度快、分離效率高、樣品和試劑用量少、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，是一種高效的分離分析技術(shù)。對(duì)于電活性物質(zhì)的檢測(cè)，毛細(xì)管電泳與電化學(xué)檢測(cè)聯(lián)用，具有更高的靈敏度和選擇性。傅亮等[7]采用毛細(xì)管電泳-電化學(xué)法分別測(cè)定不同產(chǎn)地蜘蛛香根中香葉木素、山柰酚、芹菜素、綠原酸以及咖啡酸等5種多元酚類化合物的含量。采用300 μm的碳圓盤電極為工作電極，檢測(cè)電位為+950 mV（vs.SCE），在50 mmol/L的硼砂緩沖溶液（pH＝9.23）中，上述各組分在23 min內(nèi)能完全分離。

1.2 化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光是指在化學(xué)反應(yīng)的過(guò)程中，物質(zhì)分子吸收化學(xué)能后產(chǎn)生光輻射的現(xiàn)象。化學(xué)發(fā)光法是利用反應(yīng)體系中的待測(cè)物質(zhì)與體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在一定條件下呈線性關(guān)系的原理，通過(guò)儀器檢測(cè)體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，從而確定待測(cè)物含量的一種方法。李麗等[8]研究發(fā)現(xiàn)，香葉木素對(duì)高錳酸鉀（KMnO4）氧化堿性魯米諾（Luminol）的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)有非常明顯的增敏作用。除香葉木素外，納米銀（AgNPs）也對(duì)Luminol-KMnO4-NaOH體系的發(fā)光強(qiáng)度有增敏作用，但在AgNPs和香葉木素共同存在的條件下，此體系的發(fā)光強(qiáng)度可增加4倍多且發(fā)光速度加快，檢測(cè)香葉木素的靈敏度更高[4]。除此之外，香葉木素對(duì)鐵氰化鉀{K3[Fe（CN）6]}氧化堿性Luminol的化學(xué)反應(yīng)也有較強(qiáng)的增敏作用。李麗等[9]的試驗(yàn)結(jié)果表明，香葉木素加入K3[Fe（CN）6]和堿性Luminol的混合溶液中之后，在更短的時(shí)間內(nèi)，體系的發(fā)光強(qiáng)度增大了1倍多。

3種反應(yīng)體系測(cè)定香葉木素的線性范圍、檢出限和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）比較見表1。綜合3種反應(yīng)體系，Luminol-NaOH-KMnO4-AgNPs體系的抗干擾能力最強(qiáng)，其RSD最小。若待測(cè)定樣品中香葉木素的含量較低，可考慮使用Luminol-KMnO4-NaOH體系進(jìn)行檢測(cè)，此體系具有最低的檢出限。

表1 3種化學(xué)發(fā)光法比較

1.3 高效液相色譜法

鄧斌等[10]的研究表明，對(duì)于血漿中香葉木素含量的測(cè)定，可以采用高效液相色譜法。大鼠血漿與酶水解液（β-葡萄糖醛酸酶200 U/mL，硫酸酯酶10 U/mL）共同孵育16 h后，采用梯度洗脫方式進(jìn)行分析，流動(dòng)相為乙腈（A）-甲醇-0.2%磷酸溶液（50∶50，V/V，B）。結(jié)果，香葉木素在質(zhì)量濃度為0.02～50 μg/mL時(shí)與色譜峰面積比之間的線性關(guān)系良好，加樣回收率為76.1%～81.9%，精密度RSD為5.8%～11.9%。

植物性食物中的香葉木苷，在體內(nèi)腸道菌群和消化酶的作用下，可水解為香葉木素。Kanaze FI等[11]采用高效液相色譜法對(duì)人血漿中的香葉木素進(jìn)行分析，取血漿樣品經(jīng)液-液萃取后，用C8反相色譜柱進(jìn)行分析，流動(dòng)相為甲醇-水-醋酸（55∶43∶2，V/V/V）。結(jié)果，香葉木素質(zhì)量濃度在10～300 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，加樣回收率為89.7%，精密度RSD為1.6%～5.3%。

Campanero MA等[12]使用C18反相色譜柱分析人血漿中的香葉木素。在pH值為2的條件下，用甲基叔丁基醚萃取血漿樣品后注入液相色譜柱進(jìn)行分析，以甲醇-1%甲酸（58∶42，V/V）為流動(dòng)相。結(jié)果，香葉木素質(zhì)量濃度在0.25～500 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率為89.2%，精密度RSD為2.8%～12.5%。

黃酮苷的水解過(guò)程受到酸、堿和酶的影響。為了篩選出從菊花粉末中提取香葉木素、木犀草素和芹菜素的最優(yōu)水解條件，Li FG等[13]采用4因素3水平的正交試驗(yàn)法對(duì)水解條件進(jìn)行了優(yōu)化，提取液中香葉木素、木犀草素和芹菜素的含量采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。以甲醇-0.25%磷酸（51∶49，V/V）為流動(dòng)相，Zorbax SB-C18液相色譜柱為固定相，二極管陣列檢測(cè)器用于檢測(cè)。此方法精密度RSD為0.38%～2.0%，回收率為100.04%。

2 香葉木素的主要生物學(xué)活性及其機(jī)制

香葉木素具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤及雌激素樣作用，其機(jī)制涉及清除自由基、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞等。

2.1 抗氧化作用

阿爾茨海默病是老年人群中最常見的認(rèn)知功能障礙疾病，過(guò)度產(chǎn)生并積累的β-淀粉樣肽（Aβ）被認(rèn)為是導(dǎo)致阿爾茨海默病的主要原因。晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）與Aβ之間有密切的相互作用，而AGEs及其受體利用細(xì)胞內(nèi)的活性氧傳遞信號(hào)。Chandler D等[14]的研究表明，香葉木素具有清除這些活性氧的能力，可延緩AGEs及其受體的產(chǎn)生，因此被認(rèn)為是一種天然的抗氧化劑。

衛(wèi)強(qiáng)等[1]通過(guò)比較加入香葉木素前后含有1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的95%乙醇溶液在517 nm波長(zhǎng)下吸光度值的變化，對(duì)香葉木素的體外抗氧化活性進(jìn)行考察。結(jié)果，加入香葉木素后，溶液吸光度值減小，說(shuō)明香葉木素與DPPH·的單電子配對(duì)，溶液中的DPPH·濃度才降低，證明香葉木素具有清除DPPH·自由基能力，抗氧化活性較強(qiáng)。

采用鄰苯三酚自氧化反應(yīng)測(cè)定香葉木素對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用。在堿性條件下，鄰苯三酚自氧化生成有色中間物和超氧陰離子自由基。超氧陰離子自由基不僅是反應(yīng)中間產(chǎn)物，還能加快反應(yīng)進(jìn)程。當(dāng)反應(yīng)體系中有抗氧化劑存在時(shí)，超氧陰離子自由基的含量降低，反應(yīng)也受到抑制，有色中間物含量降低，溶液在322 nm波長(zhǎng)處的吸光度值減小。鄒淑君等[15]的試驗(yàn)結(jié)果顯示，加入香葉木素后，在322 nm波長(zhǎng)處吸光度值明顯減小，說(shuō)明香葉木素抑制了反應(yīng)的進(jìn)行，對(duì)超氧陰離子自由基有顯著的清除能力，具有一定的抗氧化作用。

2.2 雌激素樣作用

絕經(jīng)婦女體內(nèi)內(nèi)源性雌激素分泌不足，將會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、血液中膽固醇升高、更年期綜合征等一系列疾病。人工合成的雌激素作為代替品對(duì)此類疾病有一定的預(yù)防和治療效果。人乳腺癌細(xì)胞MCF-7是一種對(duì)雌激素敏感的乳腺癌細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的雌激素受體與具有雌激素活性的配體結(jié)合后，可誘發(fā)一系列激素依賴性的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，最終反應(yīng)為對(duì)細(xì)胞增殖的影響。Yoshikawa M等[16]采用人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增敏試驗(yàn)對(duì)洋芫荽中分離出的黃酮類成分進(jìn)行了體外雌激素檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明，香葉木素在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖具有促進(jìn)作用，半數(shù)效應(yīng)濃度為2.9 μmol/L。

2.3 抗菌作用

肺結(jié)核是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的肺部感染性疾病，全球每年有幾百萬(wàn)人死于肺結(jié)核，并且不斷有新的感染者。如何提高肺結(jié)核的治愈率以及研發(fā)新的抗結(jié)核藥物，已成為全球關(guān)注的健康問(wèn)題。在菲律賓臨床上常用一種名為毛魚臭木的傳統(tǒng)中草藥來(lái)治療肺結(jié)核。Lirio SB等[17]為了進(jìn)一步研究毛魚臭木用于治療肺結(jié)核的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)毛魚臭木甲醇提取物的體外抗菌活性進(jìn)行了觀察。通過(guò)比較香葉木素及其他提取物對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的最小抑菌濃度，可知毛魚臭木內(nèi)含有具有抗菌活性的化合物，這為毛魚臭木用于肺結(jié)核治療提供了理論依據(jù)。

為了研究香葉木素的體外抑菌活性，Meng JC等[18]選擇了大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉和紅色毛癬菌，一共3種細(xì)菌和3種真菌作為實(shí)驗(yàn)菌種，進(jìn)行了體外抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，香葉木素在一定濃度下可以抑制枯草芽孢桿菌和紅色毛癬菌的增殖，具有一定抗菌活性。

2.4 抗炎作用

許多疾病的形成與發(fā)展，都伴隨有炎癥現(xiàn)象的出現(xiàn)，比如動(dòng)脈粥樣硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。Mueller M等[19]為了探究日常飲食中的水果和蔬菜是否有助于降低炎癥反應(yīng)、起到預(yù)防炎癥相關(guān)疾病的作用，對(duì)幾種常見的從水果和蔬菜中分離得到的化合物進(jìn)行了體外抗炎活性研究。結(jié)果顯示，香葉木素具有降低促炎性白細(xì)胞介素6和腫瘤壞死因子α分泌的作用，表明其具有一定的體外抗炎活性。

佛波酯（TPA）誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹模型，由于其造模方法簡(jiǎn)單、模型穩(wěn)定，被廣泛用于評(píng)價(jià)化合物的抗炎活性。TPA是巴豆油的主要活性成分，將其涂抹于小鼠耳朵局部，6 h左右即可出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。Domínguez M等[20]為探究香葉木素是否具有抗炎活性，將香葉木素用于TPA誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹模型。結(jié)果，香葉木素對(duì)于小鼠耳腫脹具有明顯的抑制作用，其半數(shù)有效量為每只耳0.45 mg，表明其具有較好的抗炎活性。

2.5 抗腫瘤作用

2.5.1 乳腺癌 乳腺癌和宮頸癌是婦科最常見的2種惡性腫瘤，其中乳腺癌發(fā)病率在我國(guó)女性人群中一直居高不下，且隨著人們的健康意識(shí)逐漸增強(qiáng)以及我國(guó)醫(yī)療水平的提高，越來(lái)越多的早期乳腺癌患者被確診并進(jìn)行治療，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)乳腺癌發(fā)病人群呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。Wiseman M等[21]研究表明，遺傳因素并不是導(dǎo)致癌癥發(fā)生的主要因素，很大一部分癌癥患者并沒有腫瘤相關(guān)的家族病史，反而環(huán)境因素對(duì)腫瘤發(fā)病率的影響成為研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)。這也從另一個(gè)方面說(shuō)明，在理論上，癌癥是可以預(yù)防的。

Androutsopoulos VP等[22]以人乳腺癌細(xì)胞MDAMB-468和人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A為細(xì)胞模型，采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)香葉木素對(duì)乳腺細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果，香葉木素能選擇性抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468的半數(shù)抑制濃度（IC50）為4.5 μmol/L；而對(duì)人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A的影響并不明顯，IC50值為100 μmol/L。流式細(xì)胞術(shù)的試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了香葉木素對(duì)乳腺癌腫瘤細(xì)胞的選擇性作用：10 μmol/L的香葉木素作用于人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468 48 h之后，使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組比較，有13.5%的細(xì)胞被阻滯在G1期；而相同濃度的香葉木素作用于人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A，并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞阻滯現(xiàn)象。

Androutsopoulos V等[23]選用人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為細(xì)胞模型，通過(guò)MTT法對(duì)香葉木素的體外抗腫瘤活性進(jìn)行研究。結(jié)果，香葉木素在一定濃度范圍內(nèi)可抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖，其IC50值為20 μmol/L。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，香葉木素的抗腫瘤活性與細(xì)胞色素P450酶介導(dǎo)的去甲基化反應(yīng)有關(guān)。

2.5.2 肝癌 目前臨床上主要采用化學(xué)療法對(duì)肝癌患者進(jìn)行治療，但化療藥物在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)也對(duì)宿主體內(nèi)的正常細(xì)胞及免疫系統(tǒng)有一定的損害。癌癥患者在治療之后往往伴隨有免疫力下降從而導(dǎo)致其他感染并發(fā)癥。近年來(lái)，特異性和有效性已經(jīng)成為抗腫瘤新藥的研究熱點(diǎn)。

Androutsopoulos VP等[24]研究了香葉木素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)和增殖的影響，MTT試驗(yàn)結(jié)果表明香葉木素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2有一定的生長(zhǎng)抑制作用，能誘發(fā)細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞術(shù)和蛋白質(zhì)印跡法的試驗(yàn)結(jié)果表明，加入香葉木素后，人肝癌細(xì)胞HepG2被阻滯在G2/M期；且伴隨著細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和c-Jun氨基端激酶蛋白表達(dá)量增加，腫瘤相關(guān)基因p53和p21表達(dá)得以增強(qiáng)。

3 結(jié)語(yǔ)

香葉木素是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物，廣泛存在于植物界。在信號(hào)通路、基因和相關(guān)蛋白酶的調(diào)控方面的研究，為香葉木素作為新型高效、低毒的抗癌輔助藥物開發(fā)提供了可能；同時(shí)，現(xiàn)有的各種檢測(cè)方法又為其質(zhì)量控制和藥物代謝的研究提供了技術(shù)條件。但目前關(guān)于香葉木素的研究尚有以下不足：（1）需要加強(qiáng)提取工藝研究。雖然香葉木素在植物界分布廣泛，且已有文獻(xiàn)報(bào)道從植物類中藥的樹皮、葉、花和果實(shí)中提取分離出香葉木素，但天然香葉木素提取率并不高，體外合成途徑的安全性也不理想，關(guān)于香葉木素工業(yè)化生產(chǎn)還處于“瓶頸”期。（2）雖然已有香葉木素抗乳腺癌和肝癌細(xì)胞系的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，但還缺少香葉木素針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的在體研究。（3）缺少提高香葉木素生物利用度的藥劑學(xué)研究以及相應(yīng)的藥動(dòng)學(xué)研究。（4）香葉木素的毒性、安全劑量和不良反應(yīng)等研究也不容忽視。

香葉木素作為日常飲食中容易獲得的黃酮類化合物，具有巨大的生物學(xué)潛力和較好的開發(fā)前景。但當(dāng)香葉木素主要以天然化合物的形式入藥時(shí)，需要加強(qiáng)其提取工藝、體內(nèi)藥效學(xué)和提高生物利用度的藥劑學(xué)研究，并對(duì)其用藥安全性進(jìn)行考察。

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（編輯：余慶華）

R969

A

1001-0408（2017）10-1426-04

2016-04-09

2016-08-02）

＊碩士研究生。研究方向：中藥資源及其品質(zhì)研究。電話：027-68890106。E-mail：llyangchn@163.com

#通信作者：教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥資源及其品質(zhì)研究。電話：027-68890106。E-mail：kelichen@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.35