化濁解毒愈潰方對潰瘍性結腸炎大鼠黏膜損傷的修復作用Δ

孫春霞，霍永利，郭喜軍，張曉艷，馬小順（.河北省中醫(yī)院脾胃病科，石家莊 0500；2.河北醫(yī)科大學中醫(yī)學院，石家莊 05009）

化濁解毒愈潰方對潰瘍性結腸炎大鼠黏膜損傷的修復作用Δ

孫春霞1＊，霍永利1，郭喜軍1，張曉艷1，馬小順2#（1.河北省中醫(yī)院脾胃病科，石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學中醫(yī)學院，石家莊 050091）

目的：探討化濁解毒愈潰方對潰瘍性結腸炎（UC）大鼠黏膜損傷的修復作用及機制。方法：將72只大鼠隨機分為空白組、模型組、美沙拉嗪組（陽性對照，0.3 g/kg）和化濁解毒愈潰方低、中、高劑量組（5、10、20 g/kg），各12只。除空白組外，其余各組大鼠均復制UC模型。造模4 d后，各給藥組大鼠ig相應藥物，空白組和模型組大鼠ig生理鹽水，每天1次，連續(xù)2周。給藥結束后，觀察大鼠疾病活動指數(shù)（DAI）與黏膜損傷指數(shù)（CMDI）；檢測血清中白細胞介素8（IL-8）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量及結腸組織中環(huán)氧合酶2（COX-2）表達情況。結果：與空白組比較，模型組大鼠DAI和CMDI評分升高，血清中IL-8、TNF-α含量增加，結腸組織中COX-2表達增強，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠DAI和CMDI評分降低，血清中IL-8、TNF-α含量減少，結腸組織中COX-2表達減弱，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與美沙拉嗪組比較，化濁解毒愈潰方中、高劑量組大鼠上述指標變化更為明顯（P＜0.05），且化濁解毒愈潰方的作用呈明顯的量效關系。結論：化濁解毒愈潰方可改善UC大鼠的疾病活動狀態(tài)、減輕結腸黏膜損傷，且中、高劑量作用優(yōu)于美沙拉嗪。其作用機制可能與減輕炎癥反應、抑制結腸組織中COX-2表達有關。

化濁解毒愈潰方；潰瘍性結腸炎；黏膜損傷；炎癥因子；環(huán)氧合酶2；大鼠

潰瘍性結腸炎（UC）是結腸黏膜及黏膜下的慢性非特異性炎癥反應及潰瘍，病變可累及直腸、乙狀結腸、近端結腸甚至回腸末端，臨床主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、黏液膿血便等，因其病情反復發(fā)作、纏綿不愈，且具有癌變傾向，被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為現(xiàn)代難治的消化道疾病之一[1]。UC發(fā)病機制尚不十分清楚，血清炎癥因子過度表達與免疫功能低下可能是其發(fā)病的主要原因[2-3]。目前西醫(yī)多采用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑等進行治療，療效欠佳且副作用大[4]?；瘽峤舛居鷿⒎綖楣曹娊淌诮Y合多年臨床經(jīng)驗研制而成的中藥方劑，由白頭翁、砂仁、黃連、白豆蔻、馬齒莧、敗醬草、地榆、陳皮、白術、防風、白芍、秦皮、甘草等藥材組成，具有化濁解毒、理氣和血、澀腸止瀉的功效。據(jù)報道，其可改善UC患者臨床癥狀，提高臨床療效[5]，但少有學者從炎癥因子等生化指標展開研究，難以準確揭示其治療UC的可能作用機制。故本研究以大鼠為模型動物，探討化濁解毒愈潰方對UC大鼠疾病活動指數(shù)（DAI）、黏膜損傷指數(shù)（CMDI）以及血清中白細胞介素8（IL-8）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和結腸組織中環(huán)氧合酶2（COX-2）的影響，為進一步闡明化濁解毒愈潰方治療UC的作用機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

HM-200電子天平（日本新光株式會社）；TDL-5-A離心機（上海安亭科學儀器廠）；7S800T-530HS三目數(shù)碼生物顯微鏡（深圳市西派克光學儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

化濁解毒愈潰方（廣州一方制藥有限公司，批號：20140809，規(guī)格：每1 g顆粒相當于12.5 g生藥）；美沙拉嗪腸溶片（葵花藥業(yè)集團佳木斯鹿靈制藥有限公司，批號：141020，規(guī)格：0.25 g/片）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（美國Sigma公司）；IL-8、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒和COX-2免疫組化試劑盒均購自北京雅安達生物技術有限公司。

1.3 動物

健康清潔級Wistar大鼠72只，♂，體質(zhì)量為250～300 g，購于河北省疾病控制中心實驗動物中心[許可證號：SYXK（冀）2010-0043]。動物適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗，喂養(yǎng)期間自由飲食。本次實驗研究報醫(yī)院動物倫理委員會批準。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

2.1.1 分組 72只大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、美沙拉嗪組（陽性對照）和化濁解毒愈潰方低、中、高劑量組，每組12只。

2.1.2 造模 除空白組外，其余各組大鼠均采用TNBS-乙醇法復制UC模型[6]。造模前大鼠禁食不禁水24 h，以排空腸道。造模后第4天，分別取各組大鼠1只，斷頭處死后取結腸組織，若見結腸膜出現(xiàn)充血、水腫并伴有潰瘍形成，則提示建模成功。

2.1.3 給藥 從造模后第4天開始，空白組大鼠繼續(xù)正常喂養(yǎng)；模型組大鼠按4 mL/kg的劑量ig生理鹽水；美沙拉嗪組大鼠按0.5 g/kg的劑量（換算后相當于成人臨床用量的10倍）ig給予0.15 g/mL美沙拉嗪混懸液；化濁解毒愈潰方低、中、高劑量組大鼠分別按8.6、17.1、34.3 g/kg的劑量（換算后相當于成人臨床用量的5、10、20倍）ig給予1.2、2.5、5 g/mL藥物混懸液，每天1次，連續(xù)2周。觀察首次給藥前和末次給藥后各組大鼠大便、便血及體質(zhì)量情況。

2.2 標本采集與處理

給藥2周后，將各組大鼠禁食不禁水飼養(yǎng)24 h，稱體質(zhì)量后以斷頭法處死。每只大鼠留取血液標本4 mL，以離心半徑為10 cm、3 000 r/min離心15 min，收集上層血清，置于－20℃冰箱中冷凍保存，待用。解剖大鼠，留取病理變化明顯處的結腸組織，沿腸系膜縱軸剪開，對CMDI進行評分。

2.3 DAI、CMDI評分

2.3.1 DAI評分 參照文獻[7]方法進行DAI評分。其中，體質(zhì)量下降百分比評分標準：體質(zhì)量不變?yōu)?分，下降1%～5%為1分，下降6%～10%為2分，下降11%～15%為3分，下降15%以上為4分；大便黏稠度評分標準：正常為0分，松散為2分，稀溏便為4分；大便出血情況評分標準：正常為0分，隱血陽性為2分，顯性出血為4分。DAI＝（體質(zhì)量下降百分比評分+大便黏稠度評分+大便出血情況評分）/3。

2.3.2 CMDI評分 參考文獻[8]方法進行CMDI評分。用福爾馬林固定后，將結腸標本腸黏膜層平鋪于硬紙板上，固定后置于生理鹽水中，采用放大鏡觀察結腸黏膜損傷程度。其中，0分：黏膜無損傷；1分：黏膜輕度充血、水腫，表面光滑，無潰瘍及糜爛：2分：黏膜充血、水腫，表面粗糙，有糜爛或粘連；3分：黏膜高度充血、水腫，伴表面壞死，潰瘍最大縱徑＜1 cm，腸壁增厚；4分：在評分為3分的病理基礎上潰瘍最大縱徑＞1 cm，全腸壁壞死。

2.4 血清中IL-8、TNF-α水平及結腸組織中COX-2表達

取待檢血清，采用ELISA法檢測血清中IL-8、TNF-α水平，采用免疫組化法檢測結腸組織中COX-2水平，具體操作按照相應試劑盒說明書進行。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 DAI、CMDI評分結果

與空白組比較，模型組大鼠DAI、CMDI評分明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠DAI、CMDI評分明顯降低，其中化濁解毒愈潰方中、高劑量組大鼠的DAI、CMDI評分較美沙拉嗪組更低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且化濁解毒愈潰方的作用具有劑量依賴性，結果見表1。

3.2 血清中IL-8、TNF-α水平與結腸組織中COX-2表達水平測定結果

與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-8、TNF-α水平及結腸組織中COX-2表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠上述生化指標均明顯降低，其中化濁解毒愈潰方中、高劑量組大鼠血清中IL-8、TNF-α水平及結腸組織中COX-2表達水平較美沙拉嗪組更低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且化濁解毒愈潰方的作用具有劑量依賴性，結果見表2。

表1 各組大鼠DAI和CMDI評分測定結果（s）Tab 1 Results of DAI，CMDI scores of rats in each group（s）

表1 各組大鼠DAI和CMDI評分測定結果（s）Tab 1 Results of DAI，CMDI scores of rats in each group（s）

注：與空白組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與美沙拉嗪組比較，ΔP＜0.05；與化濁解毒愈潰方低劑量組比較，▽P＜0.05；與化濁解毒愈潰方中劑量組比較，☆P＜0.05Note：vs.blank group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs. mesalamine group，ΔP＜0.05；vs.Huazhuo jiedu yukui formula low-dose group，▽P＜0.05；vs.Huazhuo jiedu yukui formula medium-dose group，☆P＜0.05

CMDI 0.465±0.112 3.726±0.914＊1.465±0.322#1.472±0.334#0.865±0.226#Δ▽0.572±0.145#Δ▽☆組別空白組模型組美沙拉嗪組化濁解毒愈潰方低劑量組化濁解毒愈潰方中劑量組化濁解毒愈潰方高劑量組n 12 11 11 11 11 11 DAI 0.00±0.00 3.52±0.37＊1.13±0.25#1.47±0.24#0.91±0.23#Δ▽0.62±0.20#Δ▽☆

表2 各組大鼠血清中IL-8、TNF-α含量及黏膜組織中COX-2表達測定結果（s）Tab 2 Determination results of IL-8，TNF-α contents in serum and COX-2 expression in mucosal tissue of rats in each group（s）

表2 各組大鼠血清中IL-8、TNF-α含量及黏膜組織中COX-2表達測定結果（s）Tab 2 Determination results of IL-8，TNF-α contents in serum and COX-2 expression in mucosal tissue of rats in each group（s）

注：與空白組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與美沙拉嗪組比較，ΔP＜0.05；與化濁解毒愈潰方低劑量組比較，▽P＜0.05；與化濁解毒愈潰方中劑量組比較，☆P＜0.05Note：vs.blank group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs. mesalamine group，ΔP＜0.05；vs.Huazhuo jiedu yukui formula low-dose group，▽P＜0.05；vs.Huazhuo jiedu yukui formula medium-dose group，☆P＜0.05

COX-2 0.23±0.07 0.51±0.03＊0.31±0.01#0.33±0.01#0.32±0.01#Δ▽0.24±0.01#Δ▽☆組別空白組模型組美沙拉嗪組化濁解毒愈潰方低劑量組化濁解毒愈潰方中劑量組化濁解毒愈潰方高劑量組n 12 11 11 11 11 11 IL-8，pg/mL 250.32±12.32 486.25±32.14＊365.24±45.32#371.02±46.32#312.14±35.24#Δ▽286.45±32.14#Δ▽☆TNF-α，pg/mL 56.12±6.14 100.65±10.42＊78.28±8.23#80.02±8.45#68.45±7.65#Δ▽60.24±7.24#Δ▽☆

4 討論

UC是免疫、遺傳、腸道細菌、環(huán)境等因素共同作用的結果，細胞因子在其中發(fā)揮著重要作用[9]。IL-8是UC發(fā)生過程中重要的炎性遞質(zhì)，TNF-α是一種可造成組織損傷的促炎癥因子。IL-8是在IL-1、TNF-α的刺激下，由單核細胞、T淋巴細胞等產(chǎn)生的一種中性粒細胞趨化和活化因子，可特異性趨化中性粒細胞達到炎癥部位，脫顆粒并釋放多種炎癥介質(zhì)，誘發(fā)炎癥反應和組織損傷[10]。COX-2是一種兼具環(huán)氧化酶、過氧化物酶活性的誘導型酶，廣泛參與機體炎癥的病理生理過程。在生理狀態(tài)時，COX-2通常不表達或低表達，當其被多種細胞因子和炎癥遞質(zhì)誘導時則表達明顯增強[11]。在各種刺激因素作用下，細胞膜磷脂被水解后生成花生四烯酸，COX-2可將花生四烯酸分解為多種內(nèi)源性前列腺素（PGs），后者介導引起舒張血管、組織水腫及疼痛等炎癥反應。相關研究表明，UC患者血清中IL-8、TNF-α以及結腸組織中COX-2表達明顯升高[12]，本文實驗結果也支持這一觀點。

祖國醫(yī)學認為，UC屬“腹痛”“泄瀉”“腸風下血”范疇，病因系感受外泄、邪伏腸腑、損耗正氣，當飲食不節(jié)、食滯腸胃、大腸傳導失常而致糟粕合污而將，發(fā)為泄瀉之?。恢我送ǜシe、化濁解毒、澀腸固脫[13]?；瘽峤舛居鷿⒎街邪最^翁、砂仁共為君藥，苦寒以清熱解毒，芳香以醒脾化濁；黃連、白豆蔻為臣藥，清熱燥濕、芳香醒脾、行氣化濕，助君藥清熱解毒、化濁止瀉[14]；馬齒莧、敗醬草、地榆合用解毒消腫、涼血活血；陳皮、白術、防風、白芍合用疏肝理氣、健脾止瀉；秦皮、訶子、石榴皮澀腸止痢、止瀉固脫；甘草性平味甘，引藥入經(jīng)、調(diào)和諸藥；諸藥合用，共為佐助，將濁毒之邪逐步化解，全方共奏化濁解毒，兼顧理氣和血、澀腸止瀉之功。現(xiàn)代藥理研究證實，白頭翁可抑制外陰道念球菌病模型小鼠血清中IL-6、TNF-α水平的升高[15]，黃連中主要成分鹽酸小檗堿能顯著降低結腸炎小鼠結腸黏膜組織中COX-2表達[16]，從而緩解胃腸道黏膜炎癥狀。

柳氮磺胺嘧啶屬于氨基水楊酸類藥，是治療輕、中度潰瘍性結腸炎的首選藥，但服用后可產(chǎn)生頭痛、惡心嘔吐、白細胞減少等不良反應，而美沙拉嗪服用劑量僅為柳氮磺胺嘧啶的一半，不良反應顯著低于柳氮磺胺嘧啶[17]，因此本研究以其為陽性對照。本研究結果顯示，化濁解毒愈潰方呈劑量依賴性地降低UC大鼠DAI、CMDI評分，這提示其有助于緩解UC大鼠癥狀，減輕腸道黏膜損傷。進一步分析可知，其還可劑量依賴性地降低UC模型大鼠血清中IL-8、TNF-α含量和降低結腸組織中COX-2表達，且中、高劑量作用強于美沙拉嗪。

綜上所述，解毒愈潰方能有效改善UC模型大鼠的疾病活動狀態(tài)，修復結腸黏膜損傷，這可能與其減輕炎癥反應、抑制結腸組織中COX-2表達有關。但是，本研究僅為動物實驗研究，由于人體與動物對藥物反應程度不同，化濁解毒愈潰方治療UC的可能作用機制還有待于更多的臨床研究與基礎研究去證實。

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Repairing Effect of Huazhuo Jiedu Yukui Formula on Mucosal Damage of Rats with Ulcerative Colitis

SUN Chunxia1，HUO Yongli1，GUO Xijun1，ZHANG Xiaoyan1，MA Xiaoshun2（1.Dept.of the Spleen and Stomach，Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050011，China；2.School of TCM，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050091，China）

OBJECTIVE：To explore the repairing effect and mechanism of Huazhuo jiedu yukui formula on the mucosal damage of rats with ulcerative colitis（UC）.METHODS：72 rats were randomly divided into blank group，model group，mesalamine group（positive control，0.3 g/kg），Huazhuo jiedu yukui formula low-dose，medium-dose，high-dose groups（5，10，20 g/kg），12 in each group.Except for blank group，other groups were induced UC model.After 4 d of modeling，rats in administration groups received related medicines，ig，blank group and model group received normal saline，ig，once a day，for 2 weeks.After administration，disease activity index（DAI）and mucosal damage index（CMDI）of rats were observed；IL-8，TNF-α contents in serum and cyclooxygenase 2（COX-2）expression in colon tissue were detected.RESULTS：Compared with blank group，DAI and CMDI scores in model group were increased；IL-8，TNF-α contents in serum were increased；COX-2 expression in colon tissue was enhanced，with statistical significances（P＜0.05）.Compared with model group，DAI and CMDI scores in model group were decreased；IL-8，TNF-α contents in serum were reduced；COX-2 expression in colon tissue was weakened，with statistical significances（P＜0.05）.Compared with mesalamine group，the above-mentioned indicators in Huazhuo jiedu yukui formula medium-dose，high-dose groups changed more obviously（P＜0.05），and effects of Huazhuo jiedu yukui formula showed significant dose-effect relationship.CONCLUSIONS：Huazhuo jiedu yukui formula can improve disease activity status of UC rats and reduce colon mucosal damage，and the effects of medium-dose and high-dose Huazhuo jiedu yukui formula were better than mesalamine，which may be related to reducing inflammatory reaction and inhibiting COX-2 expression in colon tissue.

Huazhuo jiedu yukui formula；Ulcerative colitis；Mucosal damage；Inflammatory cytokines；Cyclooxygenase-2；Rats

R285.5

A

1001-0408（2017）10-1329-04

2016-10-09

2017-02-25）

（編輯：林 靜）

河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目（No.2013036）

＊副主任醫(yī)師，碩士。研究方向：惡性腫瘤的中西醫(yī)結合治療。電話：0311-85990114。E-mail：Lxbch@163.com

#通信作者：副教授，碩士。研究方向：中醫(yī)臨床。電話：0311-69095202。E-mail：54637709@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.09