高溫對體外培養(yǎng)的兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞的影響

楊冬萍 楊曉旭 俞 洋,2*.寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004；2.回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏 銀川 740004

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高溫對體外培養(yǎng)的兔視網(wǎng)膜色素上皮細胞的影響

楊冬萍1楊曉旭1俞 洋1,2*
1.寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004；2.回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏 銀川 740004

目的：觀察高溫對體外培養(yǎng)的兔視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial cells，RPE)細胞的影響。方法：以體外培養(yǎng)的兔RPE細胞為研究對象，采用55℃水浴加熱法對細胞進行不同時間(3、5、8min)加溫處理，處理結束后立即進行CCK-8法檢測細胞活性、流式細胞儀測定細胞凋亡、透射電鏡觀察細胞形態(tài)學變化。結果：55℃水浴各時間組OD值明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且55℃水浴各時間組組間差異也均較顯著(P<0.05)。對照組(37℃)細胞凋亡率為(5.92±0.87)%，55℃水浴3min組細胞凋亡率為(13.28±0.61)%，55℃水浴5min組細胞凋亡率為(50.82±3.72)%，55℃水浴8min組細胞凋亡率為(64.90±0.59)%。與對照組比較，55℃水浴各時間組細胞凋亡率均明顯增高，且組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在溫度恒定的前提下，表現(xiàn)為隨著水浴時間的延長，兔RPE細胞凋亡率越來越高。透射電鏡能明顯看到細胞凋亡形態(tài)的改變。結論：55℃水浴加熱3、5、8min均可造成兔RPE細胞凋亡，水浴時間越長，細胞凋亡率越高。

水浴加熱；兔RPE細胞；細胞凋亡

“凋亡(Apoptosis)”概念早在20世紀70年代初就由Kerr[1]等提出。隨著生物化學及分子生物學技術的不斷提高，國內(nèi)外學者對有關細胞凋亡的探索已經(jīng)深入到基因、分子水平。目前認為，細胞凋亡是由基因調(diào)控的、細胞主動有序死亡的一個過程，它主要參與機體內(nèi)細胞數(shù)目的精準調(diào)節(jié)，以及機體的發(fā)育，細胞分化和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。一旦機體內(nèi)外環(huán)境因素發(fā)生紊亂，便會引起細胞凋亡調(diào)節(jié)失衡，導致疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，許多因素(如缺氧、激光照射、藥物等)可誘導細胞發(fā)生凋亡，其中，激光作為一種新型光源，因其具有單色性強、發(fā)散角小、相干性好、能量高等優(yōu)勢，已被廣泛應用于軍事、醫(yī)學、工業(yè)等各種領域[2]。眼底激光作為眼底病治療的重要手段，應用甚廣，激光與眼部組織發(fā)生作用時，以光熱效應最為常見，光子在被生物組織吸收后，轉化為熱能，使局部組織溫度上升，導致組織性質(zhì)發(fā)生變化，即產(chǎn)生光熱效應。Gabay等[3]認為光能主要被視網(wǎng)膜色素上皮吸收，少部分被脈絡膜毛細血管吸收，其余則被脈絡膜大血管吸收，或被鞏膜散射，故熱損傷常發(fā)生在視網(wǎng)膜色素上皮和局部脈絡膜組織。因此，本研究以兔RPE細胞為研究對象，觀察55℃水浴加熱不同時間(3、5、8min)對細胞的影響。

1 儀器與材料

1.1 材料 CCK-8試劑(日本同仁化學)，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物有限公司)，兔RPE細胞(賽齊(上海)生物工程有限公司)。

1.2 儀器 E680酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-RAD公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；電熱恒溫水浴鍋(紹興木可橋醫(yī)療器械廠)。

2 方法

2.1 兔RPE細胞的培養(yǎng) 兔RPE細胞培養(yǎng)條件為：10% DMEM完全培養(yǎng)基(含100U/mL青霉素，100mg/L鏈霉素)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細胞處理 取若干瓶對數(shù)生長期的兔RPE細胞，棄舊培養(yǎng)液，溫PBS洗滌2遍，0.25%胰蛋白酶消化約3min,鏡下觀察細胞回縮變圓、變亮，立即終止消化，用吸管吸取部分培養(yǎng)液，輕輕將細胞從瓶壁吹打下來，分別移入若干離心管中。

2.3 實驗分組 ①對照組，細胞不做任何處理；②55℃水浴3min組；③55℃水浴5min組；④55℃水浴8min組。

2.4 CCK-8法測定細胞活性 將加溫處理的各管細胞接種于96孔板中，每孔100μL，再避光加入CCK-8試劑，繼續(xù)孵育4h后，在酶標儀上測量其OD值。酶標儀的內(nèi)置檢測波長為450nm。

2.5 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡 上述各組細胞于處理時間結束后，1000rpm，低速離心5min，棄上清；預冷PBS洗滌1次，輕輕混勻成單細胞懸液，1000rpm，5min離心后，棄上清，此步驟重復2次；將細胞懸浮于400μL Annexin-V結合液中，避光加入5μL FITC，4℃放置15min，上機前5min避光加10μL PI,在1h內(nèi)完成流式細胞儀檢測。

2.6 透射電鏡觀察細胞凋亡 收集對照組及各實驗組細胞，2%戊二醛固定過夜(4℃)，后進行常規(guī)的電鏡脫水、包埋、雙鉛染色、超薄切片，透射電鏡下觀察細胞超微結構的改變。

2.7 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)運用SPSS17.0軟件處理，以均數(shù)加減標準差(x±s)表示，行t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果與分析

3.1 CCK-8法測定細胞活性 55℃水浴各時間組OD值明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且55℃水浴各時間組組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 55℃水浴加熱不同時間后各組細胞活性及凋亡率的比較 (x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05;與55℃水浴3min組比較，#P<0.05;與55℃水浴5min組比較，▲P<0.05;與55℃水浴8min組比較，△P<0.05。

3.2 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡 流式細胞儀檢測將每組測試細胞區(qū)分成4個細胞亞群，分別為機械損傷或壞死細胞、正常活細胞、中晚期凋亡及繼發(fā)性壞死細胞、早期凋亡細胞。這里主要分析早期凋亡細胞和中晚期凋亡以及繼發(fā)性壞死兩個指標。對兔RPE細胞進行55℃水浴加熱3min、5min、8min后，對照組(37℃)細胞凋亡率為(5.92±0.87)%，55℃水浴3min組細胞凋亡率為(13.28±0.61)%，55℃水浴5min組細胞凋亡率為(50.82±3.72)%，55℃水浴8min組細胞凋亡率為(64.90±0.59)%。與對照組比較，55℃水浴各時間組細胞凋亡率均明顯增高，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在溫度恒定的前提下，表現(xiàn)為隨著水浴時間的延長，兔RPE細胞凋亡率越來越高。見表1、圖1。

3.3 透射電鏡觀察細胞凋亡 正常對照細胞呈圓形或橢圓形，細胞膜完整，胞漿內(nèi)細胞器豐富，可見線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器，胞質(zhì)內(nèi)有大量黑色素顆粒，核染色質(zhì)分布均勻(圖2)。而經(jīng)過55℃水浴各時間處理過的細胞體積明顯變小，胞質(zhì)內(nèi)細胞器變少或消失，有大量的空泡，核染色質(zhì)聚集成團，邊聚、分散，或裂解成碎片(圖3)。

4 討論

細胞凋亡是指機體通過清除自身組織中無用的、有害的以及異常的細胞，以維持機體自身的穩(wěn)定，是一種由基因調(diào)控的、細胞自主有序的死亡，是維護多細胞生物體內(nèi)平衡的關鍵機制。細胞凋亡被認為是單個細胞的消亡過程，不引起炎癥反應[4]。在許多視網(wǎng)膜疾病中，視網(wǎng)膜色素上皮細胞的凋亡起著重要的作用，研究證實，在眼病中，細胞死亡的最終途徑是細胞凋亡的結果[5]。

本實驗采用CCK-8法進行細胞活性檢測、流式細胞儀測定細胞凋亡、透射電鏡進行細胞形態(tài)學觀察，主要探討了55℃水浴加熱不同時長(3、5、8min)對兔RPE細胞的影響。其中，CCK-8法細胞活性檢測結果顯示，55℃水浴各時間組OD值明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且55℃水浴各時間組組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。流式細胞儀測定細胞凋亡結果顯示，對照組(37℃)細胞凋亡率為(5.92±0.87)%，55℃水浴3min組細胞凋亡率為(13.28±0.61)%，55℃水浴5min組細胞凋亡率為(50.82±3.72)%，55℃水浴8min組細胞凋亡率為(64.90±0.59)%。與對照組比較，55℃水浴各時間組細胞凋亡率均明顯增高，且組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，實驗結果表明，55℃高溫可誘導細胞細胞發(fā)生凋亡，這與文獻相符[6-7]，且在一定的溫度下，兔RPE細胞凋亡率與加溫時間成正比。透射電鏡結果顯示：正常對照細胞呈圓形或橢圓形，細胞膜完整，胞漿內(nèi)細胞器豐富，可見線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器，胞質(zhì)內(nèi)有大量黑色素顆粒，核染色質(zhì)分布均勻。經(jīng)過55℃水浴各時間處理過的細胞體積明顯變小，胞質(zhì)內(nèi)細胞器變少或消失，有大量的空泡，核染色質(zhì)聚集成團，邊聚、分散，或裂解成碎片。實驗結果表明，高溫可造成RPE細胞損傷，且以凋亡為主，而這種損傷與加熱的溫度和時間密切相關。

激光醫(yī)學作為現(xiàn)代科技發(fā)展的一門新興醫(yī)學，其應用只有四十多年的歷史，故中醫(yī)在激光性視網(wǎng)膜損傷發(fā)病機理以及治療作用方面報道甚少，但隨著激光醫(yī)學的快速發(fā)展，激光光熱效應所造成的視網(wǎng)膜損傷已成為醫(yī)學領域一個不可忽視的問題。岳紅云等[8]發(fā)現(xiàn)，中藥毓明方(羚羊角、枸杞、當歸、白芍、川芎、防風、黃連、草決明等)可有效改善激光光凝治療區(qū)視野視點的平均視閾值，對治療性視網(wǎng)膜損傷具有一定的防治作用。其中，毓明方中羚羊角為君藥，黃連、防風、草決明為佐藥，傅仁宇[9]曰：“......防風，黃連......羚角，草決明......散滯瀉熱，解結明目也，陰弱不能配陽之病，并宜服之”。激光作為一種高能量的單色光，可辨為熱毒外邪，傅仁宇認為“六陽賊火上炎”為其發(fā)病機理，故治以“清心滋腎為先”。詹宇堅等[10]用具有健脾益氣、活血化瘀的精明Ⅱ號丸治療激光光凝兔視網(wǎng)膜病變，發(fā)現(xiàn)精明Ⅱ號丸可很好的促進視網(wǎng)膜色素上皮細胞和視細胞的修復。

目前，激光已廣泛應用于工業(yè)、醫(yī)療等領域，隨著激光暴露普遍化，激光眼損傷光熱效應也受到越來越多的關注。如在傳統(tǒng)光凝治療中，眼組織溫度一般升高40～60℃，導致視網(wǎng)膜全層損傷，并可累及到脈絡膜[11]。因此，在利用激光的光熱效應治療眼部疾病時，必須嚴格監(jiān)控視網(wǎng)膜溫度和時間的變化，從而達到安全有效的治療目的。對于從事激光工業(yè)的工作人員，須自覺加強自我保護意識，戴好防護眼鏡和防護眼罩等，避免由激光光熱效應引發(fā)的RPE細胞凋亡。

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Effect of High Temperature on Cultured Rabbit Retinal Pigment Epithelium Cells

YANG Dongping1YANG Xiaoxu1YU Yang1,2*

1. Traditional Chinese Medical College of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China 2. Key Laboratory of Ministry of Education to the Modernization of Hui Medicine Department, Yinchuan 740004，China

Objective To observe the effect of high temperature on cultured rabbit retinal pigment epithelial cells. Methods Rabbit retinal pigment epithelial cells were cultured in vitro by heating at 55 ℃ for 3 min, 5 min and 8 min. The cell viability was measured by CCK-8 method immediately after the treatment,cell apoptosis was determined by flow cytometry,morphological changes of cells were observed by transmission electron microscopy(TEM).Results 55℃water bath OD value was significantly lower than the control group,the difference was statistically significant,and between 55℃ water bath each time group group differences was statistically significant difference (P<0.05).The control group (37℃) cell apoptosis rate was (5.92±0.87)%, 55℃ 3min group cell apoptosis rate was (13.28±0.61)%, 55℃ 5min group cell apoptosis rate was (50.82±3.72)%, 55 C 8min group cell apoptosis rate was (64.90±0.59)%. Compared with the control group, the apoptotic rate of the 55 ℃ water bath group was significantly higher than that of the control group (P<0.05). Under the constant temperature condition, with the prolongation of water bath time, Retinal pigment epithelial cell apoptosis rate is getting higher and higher.TEM can clearly see the changes apoptotic morphology.Conclusion The apoptosis of retinal pigment epithelial cells can be induced by heating at 55 ℃ for 3min, 5min and 8min, water bath time is longer, the higher the rate of cell apoptosis.

Water Bath; Retinal Pigment Epithelial Cells; Apoptosis

國家自然科學基金(81360557)。

楊冬萍(1990-)，女，回族，在讀碩士研究生。研究方向為中醫(yī)藥防治眼底病。E-mail: 948319488@qq.com

俞洋(1973-)，男，教授，博士，碩士研究生導師，研究方向為中醫(yī)藥對眼底病的防治研究。E-mail: yaon999@126.com

R446.63

A

1007-8517(2017)07-0035-04

2017-01-24 編輯：程鵬飛)