苧麻根際土壤水浸提液對(duì)擬南芥幼苗生長的化感效應(yīng)

劉楠楠，楊瑞芳，李林林，白玉超，李雪玲，崔國賢，2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所，長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙410128）

苧麻根際土壤水浸提液對(duì)擬南芥幼苗生長的化感效應(yīng)

劉楠楠1，楊瑞芳1，李林林1，白玉超1，李雪玲1，崔國賢1，2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所，長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙410128）

通過種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度（0、1、2、10 mL／皿）不同苧麻品種根際土壤水浸液對(duì)模式植物擬南芥幼苗生長的化感效應(yīng)，并運(yùn)用相對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR（QPCR）技術(shù)從基因水平探討了不同濃度根際土壤水浸提液處理后與擬南芥生長素合成相關(guān)基因YUC1（AT4G32540）的表達(dá)。結(jié)果表明，隨著苧麻根際土壤水浸液濃度的升高，擬南芥幼苗在中苧1號(hào)根際土壤處理下其根長與對(duì)照相比均呈現(xiàn)出抑制效應(yīng)，在湘苧7號(hào)根際土壤處理下其根長與對(duì)照相比呈現(xiàn)出低促高抑現(xiàn)象。在中苧1號(hào)根際土壤處理下擬南芥幼苗丙二醛（MDA）含量隨著苧麻根際土壤水浸提液濃度升高而上升，在湘苧7號(hào)根際土壤處理下擬南芥幼苗丙二醛（MDA）含量在低濃度時(shí)，與對(duì)照相比降低，當(dāng)濃度升高，其含量呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)。在不同濃度根際土壤水浸提液處理下，擬南芥幼苗的過氧化物歧化酶（SOD）活性均表現(xiàn)為隨處理濃度升高，SOD活性下降，且在中苧1號(hào)處理下，下降幅度較湘苧7號(hào)大。QPCR檢測(cè)結(jié)果表明，2個(gè)苧麻品種處理下YUC1其基因的表達(dá)量隨水浸提液濃度增加均降低，且中苧1號(hào)下降幅度較湘苧7號(hào)大?？梢姡S浸提液濃度升高，苧麻對(duì)擬南芥生長的化感脅迫性增強(qiáng)。

苧麻；根際土壤水浸提液；擬南芥；化感效應(yīng)；抗氧化酶；YUC1基因表達(dá)量

化感作用（Allelopathy）是指一種植物通過向環(huán)境釋放化學(xué)物質(zhì)而對(duì)另一種植物（包括微生物）所產(chǎn)生的直接或間接的傷害作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)植物釋放的化學(xué)物質(zhì)不僅僅是對(duì)其他植物有害，對(duì)自身也有毒害作用，特別是在作物、人工再生林方面表現(xiàn)明顯，所以自毒作用也是化感作用的一個(gè)部分［2］。植物化感物質(zhì)主要通過雨霧淋溶、自然揮發(fā)、根分泌和植株分解等4種途徑釋放到環(huán)境中，但種子萌發(fā)和花粉在風(fēng)或昆蟲作用下的傳播途徑也是化感物質(zhì)釋放到環(huán)境中的有效途徑。無論何種途徑，釋放到環(huán)境中的化感物質(zhì)只可能是水溶和油溶兩種性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)主要探討了苧麻根際土壤水溶性化感物質(zhì)對(duì)模式植物擬南芥幼苗的影響。

苧麻（Boehmeria niveaL.）是蕁麻科（Urticaceae）苧麻屬（Boehmeria）多年生宿根性旱地草本植物，是我國特色經(jīng)濟(jì)作物和纖維作物。一般情況下，苧麻可以宿根種植10～20年，然而在正常的栽培管理措施下出現(xiàn)了苧麻連續(xù)種植3～5年后，發(fā)生爛蔸或者缺蔸的現(xiàn)象，導(dǎo)致苧麻的產(chǎn)量和品質(zhì)均下降，嚴(yán)重的甚至引起全株死亡［3－4］。苧麻在長期多年的生長發(fā)育中經(jīng)常會(huì)受到連作栽培的影響，研究表明連作栽培極易產(chǎn)生化感自毒作用，而化感現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于土壤內(nèi)部化感物質(zhì)常年累加引起。朱四元等［5－6］研究也認(rèn)為，苧麻宿根生長障礙主要是由連作多年土壤中毒引起的。本實(shí)驗(yàn)以湖南地區(qū)主要栽培的2個(gè)苧麻品種（中苧1號(hào)和湘苧7號(hào)）為供體，擬南芥為受體，探討了苧麻根際土壤水浸提液對(duì)擬南芥種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，并運(yùn)用相對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)了經(jīng)土壤浸提液處理后與生長素合成相關(guān)基因YUC1（AT4G32540）的表達(dá)，初步揭示了苧麻的化感作用，為緩解苧麻敗蔸提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試苧麻品種為中苧1號(hào)、湘苧7號(hào)；供試受體為擬南芥（哥倫比亞生態(tài)型）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 浸提液制備

取根際土壤樣（未烘干）6.5 kg按1∶2比例加入蒸餾水浸泡，不定期攪拌，浸泡48 h后用4層紗布進(jìn)行粗過濾收集得到粗浸提液，將粗濾液置于離心機(jī)（轉(zhuǎn)速：1000 r；時(shí)間：2 min）離心得到澄清的濾液，再將濾液先過定性濾紙?jiān)龠^孔徑0.45μm的微孔濾膜得到精濾液8500 mL，并濃縮至500 mL，得到濃度為8.5 g／mL（即1 mL水溶液中含有8.5 g土壤的浸提物）的液體作為母液，放置于4℃的冰箱待用。

1.2.2 種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

選取大小一致，顆粒飽滿的擬南芥種子，用15%的bleach消毒液消毒3 min，再用無菌蒸餾水沖洗5次，待用。配制1／2 MS培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)基中加入0（CK）、1、2、10 mL母液，調(diào)節(jié)pH＝5.8后于滅菌鍋121℃濕熱滅菌20 min后待用。在無菌操作臺(tái)中，進(jìn)行點(diǎn)種，每皿擬南芥種子40粒，每個(gè)處理重復(fù)3次，密封。放置于溫度25℃、濕度75%RH、光照2000 Lx的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天記錄種子發(fā)芽數(shù)直到種子不再萌發(fā)時(shí)分別測(cè)量幼苗下胚軸的長度。

1.2.3 丙二醛（MDA）含量的測(cè)定

使用硫代巴比妥酸酸（TBA）顯色法進(jìn)行MDA含量的測(cè)定，具體方法參照參考文獻(xiàn)［7－8］。

1.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）含量的測(cè)定

氮藍(lán)四唑法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活力，具體方法參照參考文獻(xiàn)［9］。

1.2.5 YUC1相對(duì)含量的測(cè)定

1.2.5.1 RNA的提取

選取生長在加入不同濃度苧麻土壤浸提液的1／2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d的擬南芥幼苗，將其整株置于離心管后迅速投入液氮中冷凍，參照sigma公司植物RNA提取試劑盒的說明書對(duì)擬南芥進(jìn)行RNA的提??；RNA逆轉(zhuǎn)錄參照TaKaRa生物公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄完的cDNA依據(jù)PCR檢查的亮度稀釋15～20倍。

1.2.5.2YUC1基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用Mx3000P型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，PCR反應(yīng)設(shè)置的條件為：95℃5 min，95℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，循環(huán)總數(shù)40個(gè)。實(shí)驗(yàn)所涉及的定量引物序列見表1，實(shí)驗(yàn)的均一化內(nèi)參以ACTIN－2基因表達(dá)的豐度為依據(jù)。10μL體系：5μL SYBR Green Mix，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，0.2μL Rox，3.8μL稀釋后的cDNA模板。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物序列Tab.1 Primer sequences used for Quantitative Real－time PCR（QPCR）

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（v7.05專業(yè)版）進(jìn)行方差顯著性分析，Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)及根長結(jié)果分析

由圖1及圖2可知，在不同濃度中苧1號(hào)和湘苧7號(hào)根際土壤水浸提液處理下，擬南芥幼苗在處理后第一天萌發(fā)數(shù)差異較大，種子萌發(fā)數(shù)呈現(xiàn)出CK＞1 mL＞2 mL＞10 mL趨勢(shì)，在處理的后幾天時(shí)間里，10 mL／皿處理的萌發(fā)數(shù)總體均小于CK及1 mL和2 mL處理。由圖3可知，在不同濃度中苧1號(hào)根際土壤水浸提液處理下，2 mL及10 mL濃度處理下根長與CK相比顯著抑制，1 mL濃度處理下根長與CK差異不顯著；在不同濃度湘苧7號(hào)根際土壤水浸提液處理下，在1 mL及2 mL濃度處理下根長與CK相比差異不顯著，10 mL濃度處理下根長顯著被抑制。在同一濃度處理下，中苧1號(hào)根際土壤處理的擬南芥幼苗根長均小于湘苧7號(hào)根際土壤處理的幼苗根長。

2.2 MDA含量及SOD含量檢測(cè)分析

由圖4可知，中苧1號(hào)根際土壤水浸提液處理下，擬南芥幼苗的MDA含量隨處理濃度的提高呈上升趨勢(shì)，10 mL濃度處理下MDA含量最高；湘苧7號(hào)根際土壤水浸提液處理下，擬南芥幼苗的在1 mL濃度處理下MDA含量較CK低，隨著處理濃度的加大，擬南芥幼苗的MDA含量呈上升趨勢(shì)，在10 mL濃度處理下含量最高。在同一濃度處理下，湘苧7號(hào)根際土壤處理的擬南芥幼苗MDA含量均低于中苧1號(hào)根際土壤處理的幼苗。

由圖5可知，隨著處理的土壤浸提液濃度的增加，2個(gè)品種和處理下，SOD含量均呈下降趨勢(shì)，且在同一濃度不同品種處理下，中苧1號(hào)處理下幼苗SOD含量較湘苧7號(hào)處理下低。

2.3 YUC1相對(duì)含量檢測(cè)結(jié)果分析

由圖6可知，隨著處理的土壤浸提液濃度的增加，兩個(gè)品種處理下，YUC1基因的相對(duì)表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)，且與對(duì)照差異顯著，且在不同品種同一濃度處理下，中苧1號(hào)土壤處理下YUC1基因相對(duì)表達(dá)量較湘苧7號(hào)少。

圖1 不同濃度中苧1號(hào)根際土壤水浸提液處理下擬南芥種子萌發(fā)數(shù)Fig.1 Different concentrations of Zhongzhu－1 rhizosphere soilwater extract number of arabidopsis seed germination under processing

圖2 不同濃度湘苧7號(hào)根際土壤水浸提液處理下擬南芥種子萌發(fā)數(shù)Fig.2 Different concentrations of Xiangzhu－7 rhizosphere soil water extract number of arabidopsis seed germination under processing

圖3 不同品種不同濃度苧麻根際土壤水浸提液對(duì)擬南芥根長的影響Fig.3 Different varieties of different concentration of ramie rhizosphere soilwater extract on arabidopsis root long effec

圖4 不同品種不同濃度苧麻根際土壤水浸 提液處理對(duì)擬南芥MDA含量的影響Fig.4 Different varieties of different concentration of ramie rhizosphere soilwater leaching solution treatment effect on MDA content in arabidopsis thaliana

圖5 不同品種不同濃度苧麻根際土壤水浸提液處理對(duì)擬南芥SOD含量的影響Fig.5 Different varieties of different concentration of ramie rhizosphere soil water leaching solution treatment effect on SOD content in arabidopsis thaliana

圖6 不同品種不同濃度苧麻根際土壤水浸提液 處理對(duì)擬南芥YUC1相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.6 Different varieties of different concentration of ramie rhizosphere soil water leaching solution treatment on the influence of the relative expression of arabidopsis YU C1

3 討論

苧麻敗蔸對(duì)麻纖維的產(chǎn)量和質(zhì)量均有較大的影響［10］。前期對(duì)苧麻敗蔸原因的分析主要集中在病蟲害嚴(yán)重、栽培管理粗放、除草劑和化肥施用不當(dāng)?shù)确矫妫欢?，苧麻敗蔸除了受外界因素影響外，不同基因型品種的敗蔸情況差別也很大，白玉超［11］等人的前期研究表明，頻繁刈割下苧麻的敗蔸率為中苧1號(hào)最高，湘苧7號(hào)敗蔸率最低，本實(shí)驗(yàn)主要從化感效應(yīng)方面探討了敗蔸率差異較大的2個(gè)苧麻品種。

兩個(gè)苧麻品種根際土壤水浸提液對(duì)擬南芥幼苗的根長均有影響，總體呈現(xiàn)出低促高抑的趨勢(shì)，且高濃度根際土壤水浸提液處理下會(huì)使擬南芥幼苗體內(nèi)的超氧化物歧化酶SOD的活性降低，前期研究表明，化感物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致受體植物體內(nèi)SOD活性降低，從而使受體植物體內(nèi)活性氧增多，啟動(dòng)膜脂過氧化，從而破壞膜的結(jié)構(gòu)，增加膜透性，K＋溢出，最終導(dǎo)致受體植物生長受阻［12］。同時(shí)，高濃度根際土壤水浸提液處理下擬南芥幼苗體內(nèi)的丙二醛MDA含量增加，MDA是膜脂過氧化最終分解的產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明根際土壤水浸提液中所含物質(zhì)對(duì)擬南芥幼苗的細(xì)胞膜膜和細(xì)胞造成了傷害。

兩個(gè)苧麻品種根際土壤水浸提液對(duì)擬南芥幼苗的生長素合成相關(guān)基因YUC1均有影響，總體呈現(xiàn)出隨處理液濃度的加大，YUC1該基因的相對(duì)表達(dá)量減少，且下降幅度表現(xiàn)為：中苧1號(hào)處理大于湘苧7號(hào)處理［1］。

苧麻根際土壤水浸提液中的化學(xué)物質(zhì)對(duì)其他植物生長的抑制作用表明了苧麻自身釋放了化感物質(zhì)，其可能為導(dǎo)致苧麻敗蔸的內(nèi)因之一，由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及大田觀測(cè)苧麻地幾乎無雜草兩方面初步推測(cè)苧麻自身釋放了一些化學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)隨著種植年限的積累對(duì)其自身及周圍植物均有害，所以出現(xiàn)連作多年的麻敗蔸率提高，本實(shí)驗(yàn)為延緩苧麻敗蔸提供了新的探究方向。

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The Allelopathy of Ram ie Rhizosphere SoilWater Extract on Arabidopsis Thaliana Seed ling Grow th

LIU Nannan1，YANG Ruifang1，BAIYuchao1，LIXueling1，CUIGuoxian1，2
（1.Ramie Research Institute of Hunan Agricultural University，Changsha 410128 China；2.Hunan Agricultural University，Changsha 410208 China）

The seed germination experiment is used to study the different concentrations（0，1 and 2，10 mL／dish）and the different ramie varieties rhizosphere soil water extract allelopathic effect on the model plantArabidopsis thalianaseedlings，and relative real－time quantitative PCR（QPCR）technology was applied to probe into the YUC1（AT4G32540）gene expression related to auxin biosynthesis after treatment.Results showed that different concentration ofwater extracts from rhizosphere soil of ramie had certain allelopathy on theArabidopsis thaliana，and the allelopathy enhanceswith the increase of concen-tration.Themalondialdehyde（MDA）content ofArabidopsis thalianaseedlings riseswith the increase in concentration of extract under the rhizosphere ZhongZhu 1 treatment.Compared with control，malondialdehyde（MDA）content of seedlings reduced in lower concentration and increased in higher concentration of extract under the rhizosphere Xiangzhu 7 treatment.The superoxide dismutase（SOD）activity decreased with the rising of treatment concentration.QPCR detection results showed that the gene expressive quantity of YUCI reduced with the increase ofwater extract concentration under the processing of two ramie varieties.In conclusion，with the increase of the extract concentration，ramie has an increase Allelopathy onArabidopsisgrowth.

ramie；rhizosphere soilwater extract；Arabidopsis thaliana；allelopathic effect；antioxidant enzymes；YUC1 gene expression quantity

S563.1

A

1671－3532（2017）02－0064－05

2016－10－31

國家麻類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS－19－E20）；國家自然科學(xué)基金（31471543）；湖南省研究生科研創(chuàng)新（CX2015B232）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP－IBFC07）

劉楠楠（1991－），女，湖北棗陽人，碩士研究生，主要從事苧麻生理與生化研究。E－mail：422721493＠qq.com

*通訊作者：崔國賢（1963－），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事麻類栽培育種、生理生態(tài)及植物營養(yǎng)生理研究。E－mail：gx－cui＠163.com