HLA基因及其多態(tài)性與IVF—ET治療結(jié)局的研究進展

何培+李正偉+許益娟+張若鵬

摘要：在不孕癥患者中，行體外受精-胚胎移植治療后，機體對其的反應(yīng)，在很大程度上取決于個體間基因組的差異。研究指出，人類白細(xì)胞抗原（HLA）多態(tài)性與體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局有關(guān)，現(xiàn)此文就該研究領(lǐng)域的進展做了綜述。

關(guān)鍵詞：HLA基因；基因多態(tài)性；IVF-ET治療結(jié)局；進展

20世紀(jì)60年代后期，Robert G Edwards與Steptoe開始了人類體外受精的臨床研究[1]。他們首先采用激素刺激不孕癥女性患者的卵巢，然后腹腔鏡下獲取成熟卵母細(xì)胞并成功進行體外受精，繼續(xù)體外培養(yǎng)發(fā)育到8細(xì)胞胚胎，并嘗試將胚胎移植回該患者的子宮內(nèi)。經(jīng)過上百次失敗并克服諸多關(guān)鍵技術(shù)難題，最終于1978年7月25日，世界第一例“試管嬰兒”Louise Brown誕生，宣告人類體外受精技術(shù)取得成功。此后，體外受精技術(shù)在全世界蓬勃開展。體外受精-胚胎移植[2]（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）是指將不孕癥患者夫婦的卵子與精子取出體外，在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中受精并發(fā)育成胚胎后，將胚胎移植入子宮腔內(nèi)以實現(xiàn)妊娠的技術(shù)。HLA即人類主要組織相容性復(fù)合體（MHC，major histocompatibility system），位于6號染色體短臂，長約4000 kb[3-5]。它由一系列緊密連鎖的基因座組成，是迄今為止所知的人類最復(fù)雜的遺傳系統(tǒng)，約占人類基因組的1/3000[6]。是人類基因組計劃完成并公布的人體中最復(fù)雜的免疫復(fù)合體，它具有種族、民族的特異性以及基因多態(tài)性，是人體在遺傳學(xué)方面重要的標(biāo)志[7]。近些年來，模式生物基因組、微生物基因組以及人類基因組得到充分認(rèn)識。

1 HLA基因分類

1.1 HLA I類區(qū)域 I類分子是由兩條多肽鏈組成，其中包括α微球蛋白和β2微球蛋白，α鏈有三個功能區(qū)，分別為α1、α2、α3，抗原多態(tài)性是由α1和α2功能區(qū)決定的，恒定區(qū)是α3功能區(qū)，經(jīng)典區(qū)HLA-A、B、C位點以及非經(jīng)典區(qū)HLA-E、F、G位點等都屬于HLA I類基因，它的產(chǎn)物表達在有核細(xì)胞的表面，其作用包括預(yù)防腫瘤、抵抗病毒以及在免疫系統(tǒng)中識別自我和非我。

1.2 HLAII類區(qū)域 α和β鏈組成的糖蛋白組成II類分子，經(jīng)典區(qū)HLA-DR、DQ、DP位點和非經(jīng)典區(qū)HLA-DN、DM、DO位點等組成了HLA II類基因，在巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞及活化的T細(xì)胞表面分布，其產(chǎn)物主要參與與抗原的處理、加工和提呈。

1.3 HLAIII類區(qū)域 III類基因為補體區(qū)，位于HLA I類和HLA II類基因之間，編碼補體C2、C4A、C4B，備介素因子（Bf）和甾醇類21-羥化酶。

2 HLA-I類基因

2.1 HLA-A、B等位基因與高齡產(chǎn)婦 許多研究發(fā)現(xiàn)IVF-ET臨床結(jié)局與女性患者的年齡密切相關(guān)，因而以為年齡是影響臨床結(jié)局的重要因素之一。首先，隨著女性年齡增加， 其卵巢中儲備的卵母細(xì)胞數(shù)目逐漸減少[8]，卵基因巢儲備功能的下降導(dǎo)致即使應(yīng)用了較大劑量的促性激素仍不能夠得到滿意數(shù)量的卵泡，因而就難以產(chǎn)生足夠的優(yōu)質(zhì)胚胎；其次，隨年齡增加，卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的過氧化反應(yīng)增強，導(dǎo)致氧自由基增加，可損傷到細(xì)胞核DNA 和線粒體DNA，致使能量供應(yīng)物質(zhì)（ATP）減少，減數(shù)分裂受到不同程度的負(fù)面影響。如配子或胚胎發(fā)生了染色體異常和/或非整倍體，就會導(dǎo)致臨床妊娠率下降，自然流產(chǎn)率等不良妊娠結(jié)局增加。但近年來隨著老化免疫學(xué)的研究成為老化研究的熱點之一。老年人免疫指標(biāo)的改變對揭示人類長壽的原因有重要的實際意義，對于“長壽老年人”的免疫學(xué)機制，以及免疫指標(biāo)與HLA等位基因的相關(guān)性還有待于深入的研究，并結(jié)合不同年齡段人群的相關(guān)指標(biāo)做免疫動態(tài)研究。HLA是復(fù)雜的人類多態(tài)性遺傳系統(tǒng)，因人種、地域及研究角度的不同而存在很大的差異。有研究[9]發(fā)現(xiàn)HLA-A、B等位基因與人類的壽命有關(guān)聯(lián)，可以認(rèn)為HLA-A29和HLA-B13可能是人類長壽的有利基因，而HLA-B61可能是人類長壽的不利基因。這一研究的突破，將可能會使高齡對不良孕產(chǎn)婦行IVF-ET的治療，產(chǎn)生一個新的突破口。以期提高“試管嬰兒”的活嬰分娩率。

2.2 HLAI類基因多態(tài)性與免疫排斥反應(yīng) 免疫學(xué)研究以為，同種性質(zhì)的物質(zhì)移植的現(xiàn)象是妊娠，異種移植的排斥的結(jié)果是流產(chǎn)[10]。在臨床妊娠過程中，胚胎是一種半同體抗原但不受母體排斥而存在，這和蛻膜組織中有正常的免疫微環(huán)境有關(guān)。胚胎源性抗原與母體的免疫系統(tǒng)形成免疫平衡狀態(tài)，這是胚胎得以存活的前提條件，一旦這種平衡被打破，導(dǎo)致母體與胚胎免疫失衡，將可能造成反復(fù)胚胎種植失敗或流產(chǎn)的發(fā)生，在胚胎種植過程中免疫學(xué)調(diào)控發(fā)揮重要的角色[11]。有研究報道，人成纖維細(xì)胞被HLA-A2的反義核酸技術(shù)處理后再被移植入帕金森病大鼠紋狀體，異種移植排斥反應(yīng)程度可降低以及細(xì)胞的存活時間延長[12-14]。劉建生等人[15]根據(jù)這個原理，設(shè)計篩選出2個相對效果較好的小干擾 RNA片段，隨機選擇1個并將有效的序列克隆入慢病毒載體并進行包裝后， HLA-A2在 293T細(xì)胞中的表達能有效地沉默?？稍趯嶒炛蝎@得的siRNA-HLA-A2能有效沉默人胚肺中HLA-A2基因的表達，減弱或抑制感染了siRNA-HLA-A2的人胚肺成纖維細(xì)胞HLA-A2抗原的數(shù)量，從而達到減弱細(xì)胞的免疫有排斥反應(yīng)的發(fā)生。該實驗給了我們生殖醫(yī)學(xué)人員新的啟發(fā)，研究HLA某種基因有效沉默IVF-ET胚胎著床時的免疫排斥反應(yīng)，從而有效提高胚胎著床率，進一步提高子宮容受性，為提升IVF-ET臨床妊娠率找到了一個新的方向。

3 HLA基因多態(tài)性與流產(chǎn)

部分不良孕產(chǎn)婦行IVF-ET治療后，臨床妊娠后仍有些不明原因流產(chǎn)。研究表明，流產(chǎn)（abortion）是指妊娠不足28w、胎兒體重不足1000 g而終止者。是臨床常見的妊娠并發(fā)癥，約1%～3%的夫婦經(jīng)歷過流產(chǎn)。流產(chǎn)在婦產(chǎn)科疾病常見，妊娠婦女的身體健康受到極大傷害。但是目前仍有部分妊娠婦女流產(chǎn)原因不明。

過去針對流產(chǎn)與HLA的相關(guān)研究很多，但是針對不同人種，會產(chǎn)生不同的研究結(jié)果，有一項針對印度人的調(diào)查顯示，HLA-G*010105和HLA-G*010108兩個等位基因在正常生育的婦女中檢測不出來，但是這兩個基因在反復(fù)流產(chǎn)婦女中卻可以檢測其出現(xiàn)的頻率，而且在正常生育的婦女中HLA-G010103的頻率明顯低于反復(fù)流產(chǎn)患者[16]。結(jié)果顯示，反復(fù)妊娠丟失與HLA-G的多態(tài)性有關(guān)[17]。另一項在波蘭人的研究中，在正常生育婦女和反復(fù)流產(chǎn)患者中12個HLA-G等位基因頻率無太大的差異[18]?；蛟S是人種和地區(qū)的差異造成了這一現(xiàn)象。某項研究認(rèn)為[19]，人類白細(xì)胞抗原DQBI*0303單元型可能與RSA發(fā)病密切相關(guān)，但是對于DQBI*0303單元型如何引起RSA的作用機制應(yīng)該進一步研究，以便明確其在RSA發(fā)生中的具體作用。研究表明[20]HLA區(qū)域中TNF等位基因以及它與TNF水平的關(guān)系與不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)有關(guān)，并根據(jù)對比研究，結(jié)論表明：TNF-B G252A 基因多態(tài)性與不明原因流產(chǎn)相關(guān)。如何改變、抑制或敲出TNF-B G252A 基因多態(tài)性，改善不明原因流產(chǎn)的妊娠結(jié)局，將是我們生殖醫(yī)學(xué)醫(yī)務(wù)工作者另一個研究方向。

4 HLA基因多態(tài)性與妊娠

最新外文研究報道[21]：在行IVF-ET移植后，將患者分為妊娠失敗組和成功組，利用高通量基因表達譜測序比較兩者在3個不同階段（IVF-ET-I期、卵巢刺激-II期、胚胎移植后15 d階段-III期）的差異表達基因并進行分析，結(jié)果顯示 基于KEGG富集通路分析，選擇主要組織相容性復(fù)合體-A（HLA-A）、 白介素-1β（IL-1β）、主要組織相容性復(fù)合體-DQA1（HLA-DQA1）、血紅蛋白D（HBD）、微小染色體維持缺陷蛋白4（MCM4）等5個基因?qū)θ焉锝Y(jié)局影響最為重要。并且顯示在妊娠失敗組中，階段II中，HLA-A表達降低，而在階段III中表達急劇升高；而在妊娠成功組中，妊娠期間HLA-A表達逐漸降低，遠(yuǎn)低于妊娠失敗組。妊娠失敗組中， HLA-DQA1在妊娠持續(xù)期間表達增加；而在妊娠成功組中，表達持續(xù)降低，但表達量始終高于妊娠失敗組。妊娠失敗組中，IL-1β在妊娠持續(xù)期間表達增加；研究顯示HLA-A和 HLA-DQA1與妊娠發(fā)育、持續(xù)密切相關(guān)，提示HLA-A和 HLA-DQA1也可作為妊娠預(yù)測的分子標(biāo)記物。并為IVF-ET反復(fù)妊娠失敗的患者提供了靶向治療的可能。

另外還有報道指出[22]，在進化過程中，HLA的多態(tài)性越來越豐富，單倍型數(shù)目也逐步增加。研究 HLA單倍型與疾病的關(guān)系，可以得到比研究單個HLA位點等位基因與疾病的相關(guān)性更多的信息。這將會對于不良孕產(chǎn)婦行IVF-ET治療提供新的方向。

參考文獻：

[1]黃國寧.輔助生殖實驗室技術(shù)[M].1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014： 73.

[2]中華醫(yī)學(xué)會.臨床診療指南·與精子庫分冊輔助生殖技術(shù)[M].1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：64.

[3]Bmnson PG，Mack SJ，Edich HA，et a1.A sequence-based approach demonstrates that balancing selection in classical human leukocyte antigen（HLA）loci is asymmetric[J].Hum Mol Genet，2013，15，22（2）：252-261.

[4]Hussain N，Jaffery G.Distribution of human leukocyte antigen alleles in systemic lupus erythematosus patients with angiotensin converting enzyme insertion/deletion polymorphism[J].Bosn J Basic Med Sci，2013，13（1）：57-62.

[5]Saba I，Maszocco G，Plewczynski D.Erratum to：Consensus classiflcation of human leukocyte antigen class II proteins[J].Immunogeneties，2013，65（4）：313.

[6]何淼，康冰.河南地區(qū)漢族人群原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳雜志，2014，31（04）：504-507.

[7]曾明星.HLA-A、B、DRB高分辨等位基因與IgA腎病所致慢性腎功能衰竭的關(guān)聯(lián)性研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2015.

[8]李萍，丁露.影響IVF-ET妊娠結(jié)局的相關(guān)因素分析[J].中國婦幼保健，2013，28（14）：2246-2248.

[9]王卓.HLA-A、B等位基因多態(tài)性與"長壽年齡"的關(guān)聯(lián)及其可能的免疫學(xué)機制[D].大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2005.

[10]Schoolcraft WB，surrey ES，Minjare DA，et al.Management of poor reaponders； can outcomes be improved with a novel gonndotropin relasing. hormone antagonist letrozole protocol[J].FetrilSteril，2008，89（1）： 151-156.

[11]Makrigiannakis A，Petsas G，Toth B，et al.Recent advances in understanding immunology of reproduetive failure[J].Reprod Immunol，2011， 90：96-104.

[12]段德義，張海燕，徐群淵，等.反義HLA A2和GDNF共表達逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建和鑒定[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2005，21（2）：103-107.

[13]Sawada Y，Komori H，Tsunoda Y，et al.Identification ofHLA-A2 or HLA-A24-restricted CTL epitopes for potential HSP105-targeted immunotherapy in colorectal cancer[J].Oncol Rep，2014，31（3）：1051-1058.

[14]李穎，楊慧，徐群淵，等.反義HLA A2 cDNA抑制人成纖維細(xì)胞于大鼠腦內(nèi)移植后的免疫排斥反應(yīng)[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2005，21（2）：113-118.

[15]劉建生，趙剛.HLA-A2小干擾RNA的設(shè)計及沉默效果檢測[J].中國組織工程研究，2014，18（29）：4605-4610.

[16]AbbasA，Tripathi P，Naik S，et al.Analysis of human leukocyte antigen（HLA）G polymorphism in normal women and in women with recurrent spontaneous aboaions[J].Eur J Immunogenet，2004，31（6）：275-278.

[17]魯平，張愛愛，于峰，等.習(xí)慣性流產(chǎn)與抗心磷脂抗體檢測的相關(guān)性分析[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，45（16）：606-607.

[18]Sipak SO，Cybulski C，Lubinski J，et al.HLA-G polymorphism in a Polish population and reproductive failure[J].Tissue Antigens，2008，71（1）：67-71.

[19]楊旭，阿米娜，王琳.習(xí)慣性流產(chǎn)與人類白細(xì)胞抗原DQB1基因多態(tài)性的相關(guān)性[J].臨床研究，2013，20（19）：51-52.

[20]周蕓.腫瘤壞死因子及其基因多態(tài)性與不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)的關(guān)系的研究[D].廣州：廣州醫(yī)學(xué)院，2006.

[21]Zhang R，Yu C，Wu R，et al.RNA-Seq-Based Transcriptome Analysis of Changes in Gene Expression Linked to Human Pregnancy Outcome After in Vitro Fertilization-Embryo Transfer[J].Reprod Sci，2016，23（1）：134-145

[22]陳麗娜.1626個中國家系的HLA單倍型分析及新等位基因的鑒定[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2014，4.

編輯/成森