BRAFV600E基因檢測(cè)對(duì)良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷價(jià)值

錢偉明，姜協(xié)，邵榮，薛劍，王鵬

1.江蘇省常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 武進(jìn) 213003；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 附屬醫(yī)院，北京 100071

BRAFV600E基因檢測(cè)對(duì)良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷價(jià)值

錢偉明1，姜協(xié)1，邵榮1，薛劍2，王鵬1

1.江蘇省常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 武進(jìn) 213003；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 附屬醫(yī)院，北京 100071

目的：探討B(tài)RAFV600E基因檢測(cè)在甲狀腺結(jié)節(jié)中的診斷價(jià)值，評(píng)估其診斷良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的應(yīng)用價(jià)值。方法：選取2015年1～12月江蘇省常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院收治的甲狀腺結(jié)節(jié)患者，入院后測(cè)定BRAFV600E基因表型，采用細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)（FNAC）檢測(cè)其性質(zhì)，采用手術(shù)組織病理學(xué)對(duì)患者甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行良惡性鑒別，分析BRAFV600E基因與良惡性結(jié)節(jié)的相關(guān)性，評(píng)估其對(duì)于甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的指導(dǎo)價(jià)值。結(jié)果：共入組甲狀腺結(jié)節(jié)患者92例，其中惡性65例；多因素分析表明BRAFV600E基因突變與惡性甲狀腺結(jié)節(jié)呈相關(guān)性（P＜0.01），OR為44.42（95%CI：5.66～348.44）；BRAFV600E基因突變預(yù)測(cè)其惡性甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)生的敏感性和特異性分別為63%（95%CI：0.50～0.74）和96%（95%CI：0.79～0.99）。結(jié)論：BRAFV600E突變與甲狀腺癌的發(fā)生有顯著的相關(guān)性，其能顯著提高良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率。

BRAFV600E基因；甲狀腺結(jié)節(jié)；診斷價(jià)值

甲狀腺結(jié)節(jié)是指各種原因?qū)е碌募谞钕賰?nèi)出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)異常團(tuán)塊，臨床發(fā)生率逐年升高[1]。由于良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)兩者間并沒(méi)有特征性的差異征象，因而目前在臨床上還沒(méi)有無(wú)創(chuàng)檢測(cè)標(biāo)志物可以對(duì)二者進(jìn)行鑒別。細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)（fine-needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC）檢查是目前判定甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)最為常用的檢查方法[2]。但由于細(xì)針穿刺時(shí)所獲得的結(jié)節(jié)標(biāo)本量少，且診斷依賴于操作醫(yī)師及病理醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)，因而仍有較高的假陽(yáng)性率和假陰性率，嚴(yán)重影響診斷的準(zhǔn)確度，限制了其臨床的更廣泛應(yīng)用。

小鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1（V-raf mu?rine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因位于人染色體7q34，包含18個(gè)外顯子，編碼相對(duì)分子質(zhì)量約94×103的蛋白質(zhì)，包含783個(gè)氨基酸殘基，屬于絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶類[3]。研究表明，BRAFV600E基因突變與甲狀腺癌的發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)[3-4]，但是BRAFV600E基因檢測(cè)在甲狀腺結(jié)節(jié)中的診斷價(jià)值尚缺乏臨床證據(jù)，其與臨床常用的FNAC聯(lián)合診斷良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的應(yīng)用價(jià)值尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

在此，我們檢測(cè)了甲狀腺結(jié)節(jié)患者中BRAFV600E基因的突變水平，旨在討論其在甲狀腺結(jié)節(jié)定性診斷方面的診斷與應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2015年1～12月江蘇省常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院的甲狀腺結(jié)節(jié)患者92例。所有患者均行FNAC及手術(shù)切除甲狀腺結(jié)節(jié)，其中男性23例、女性69例，均無(wú)高血壓、冠心病、肝腎功能障礙、精神異常及長(zhǎng)期應(yīng)用藥物及其他腫瘤病史。年齡為26～67歲，平均43.38歲，甲狀腺結(jié)節(jié)大小1.2～2.8 cm。

1.2 FNAC穿刺方法及細(xì)胞學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 FNAC穿刺方法 患者排除細(xì)針穿刺術(shù)禁忌癥，術(shù)前簽署知情同意書。取仰臥位，使其肩部墊高約15°～30°，充分暴露頸前區(qū)。超聲波定位穿刺點(diǎn)，消毒，鋪無(wú)菌洞巾，2%利多卡因局部麻醉，使用一次性穿刺活檢針，在超聲波引導(dǎo)下沿預(yù)定針道進(jìn)入結(jié)節(jié)中心，每個(gè)結(jié)節(jié)穿刺3針，標(biāo)本涂片3～4張，95%乙醇固定。

1.2.2 細(xì)胞學(xué)分類 所有入組病例均獲得細(xì)胞學(xué)診斷，按照甲狀腺細(xì)胞病理分類標(biāo)準(zhǔn)［①無(wú)法診斷；②良性病變；③不能明確意義的濾泡病變或不典型病變；④濾泡性或嗜酸性腫物；⑤可疑惡性；⑥惡性］，本研究將⑤、⑥統(tǒng)一歸類為細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性，將①～④歸類為細(xì)胞學(xué)陰性[5-6]。

1.3 BRAFV600E基因突變檢測(cè)

采用熒光PCR法檢測(cè)BRAFV600E基因，血液基因組提取試劑盒由天根生化科技公司提供，檢測(cè)試劑盒為北京華邁生物科技公司生產(chǎn)的人類BRAFV600E基因突變熒光PCR檢測(cè)試劑盒。取500 μL EDTA抗凝靜脈血，提取基因組DNA。基因組DNA濃度為20～200 ng/μL，DNA的D260nm/D280nm為1.7～2.0。利用熒光定量PCR儀對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算ΔCt值（ΔCt值=突變檢測(cè)Ct值-質(zhì)控檢測(cè)Ct值），結(jié)果定性分析。若ΔCt≥28，樣本為陽(yáng)性；若ΔCt＜28，樣本為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以x±s表示，通過(guò)t檢驗(yàn)分析；計(jì)數(shù)資料通過(guò)卡方檢驗(yàn)分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)患者BRAFV600E基因突變類型比較

共入組92例甲狀腺結(jié)節(jié)患者，所有患者均經(jīng)手術(shù)切除。術(shù)后病理結(jié)果示：惡性65例，其中乳頭狀癌63例、濾泡狀癌2例；良性27例，全部為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，其中3例伴局部濾泡上皮異性增生。根據(jù)手術(shù)切片病理結(jié)果，將患者分為惡性組與良性組，比較2組間BRAFV600E基因突變比例。同時(shí)對(duì)可能的甲狀腺結(jié)節(jié)的相關(guān)危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析，比較了2組間年齡、性別、糖代謝能力（糖代謝異常包括糖尿病前期和2型糖尿?。?、結(jié)節(jié)數(shù)、累積腺葉情況、結(jié)節(jié)回聲結(jié)構(gòu)及FNAC穿刺結(jié)果。見(jiàn)表1。

2.2 BRAFV600E基因突變類型與惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的多因素分析

多因素logistic回歸分析顯示BRAFV600E基因突變與惡性甲狀腺結(jié)節(jié)呈相關(guān)性（P＜0.01），是惡性甲狀腺結(jié)節(jié)高?；颊叩莫?dú)立危險(xiǎn)因素（OR= 44.42；95%CI：5.66～348.44）。同時(shí)，甲狀腺結(jié)節(jié)回聲結(jié)構(gòu)也是良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的可能危險(xiǎn)因素，其囊性回聲結(jié)節(jié)與混合性回聲結(jié)節(jié)均提示其良性甲狀腺結(jié)節(jié)的可行性，結(jié)節(jié)為實(shí)性結(jié)構(gòu)的患者惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的風(fēng)險(xiǎn)增加3.2倍（OR=3.23；95%CI：2.36～5.27）。見(jiàn)表2。

2.3 BRAFV600E基因突變?cè)\斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的敏感性與特異性

對(duì)BRAFV600E基因突變預(yù)測(cè)其后甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性程度的敏感性與特異性進(jìn)行了分析。所有入組患者中，BRAFV600E基因突變預(yù)測(cè)其惡性甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)生的敏感性和特異性分別為63%（95% CI：0.50～0.74）和96%（95%CI：0.79～0.99）。與臨床目前常用的細(xì)針穿刺相比，其診斷特異性顯著升高。不僅如此，本研究表明基因檢測(cè)聯(lián)合穿刺檢測(cè)能顯著提高其診斷敏感性（77%，95%CI：0.65～0.86）與特異性（0.96，95%CI：0.79～0.99），見(jiàn)表3。

表1 良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)患者臨床資料比較

表2 BRAFV600E基因突變與惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的多因素分析

表3 不同檢查方式診斷良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的敏感性與特異性

3 討論

隨著影像學(xué)檢查和超聲波檢查的普及與廣泛應(yīng)用，無(wú)癥狀甲狀腺結(jié)節(jié)的發(fā)生率明顯增多。甲狀腺炎癥、增生及良惡性腫瘤等多種疾病均可表現(xiàn)為甲狀腺結(jié)節(jié)，不同發(fā)病原因所致的甲狀腺結(jié)節(jié)其處理方式截然不同，惡性結(jié)節(jié)應(yīng)盡早行外科手術(shù)處理，良性結(jié)節(jié)可保守內(nèi)科治療[1,7]。因此，對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性鑒別是其后續(xù)治療的基礎(chǔ)與前提。

然而，良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)缺乏特征性的差異表現(xiàn)，二者在臨床上尚無(wú)直接有效的鑒別手段。既往研究表明，性別、年齡、糖代謝能力，以及結(jié)節(jié)的超聲波特征如結(jié)節(jié)數(shù)、累及腺葉、結(jié)節(jié)回聲結(jié)構(gòu)等因素為甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的相關(guān)危險(xiǎn)因素[4,8]。本研究結(jié)果表明，除甲狀腺結(jié)節(jié)超聲波回聲結(jié)構(gòu)外，其他因素在良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)鑒別中均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)差異，意味著僅僅根據(jù)患者病例特征和結(jié)節(jié)超聲波特點(diǎn)無(wú)法對(duì)良惡性結(jié)節(jié)進(jìn)行有效鑒別。

本研究結(jié)果表明BRAFV600E突變與甲狀腺癌的發(fā)生有顯著的相關(guān)性，其能顯著提高良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率。BRAFV600E基因突變是目前研究最為深入的甲狀腺癌基因突變類型。BRAFV600E基因位于人染色體7q34，既往研究證實(shí)其突變大多位于第1799位點(diǎn)，BRAFFT1799A（V600E）位點(diǎn)與RAS蛋白結(jié)合后發(fā)生谷氨酸至纈氨酸的點(diǎn)突變，因而引起了MAPK通路中REK和MEK的腫瘤基因的級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)[4,9]。另一項(xiàng)多中心臨床研究表明[5-6]，BRAFV600E突變與甲狀腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯、癌癥復(fù)發(fā)及甲狀腺癌Ⅲ、Ⅳ期明顯相關(guān)。隨后很多研究也證實(shí)BRAFV600E突變與甲狀腺乳頭狀癌的復(fù)發(fā)顯著相關(guān)[10-13]。不僅如此，BRAFV600E突變與復(fù)發(fā)性甲狀腺乳頭狀癌的放射性碘親和性降低有一定的相關(guān)性，其可能與放射性碘治療效果不佳有關(guān)[14]。BRAFV600E突變可導(dǎo)致甲狀腺癌的侵襲性增加，最終使甲狀腺癌治療失敗。BRAFV600E突變也能導(dǎo)致很多促腫瘤分子的過(guò)表達(dá)，如VEGF、MET等[15]。本研究入組92例患者中，僅有1例突變術(shù)后病理未達(dá)診斷標(biāo)準(zhǔn)，提示BRAFV600E突變對(duì)于惡性甲狀腺結(jié)節(jié)有高度的特異性。既往文獻(xiàn)表明，BRAFV600E基因突變是甲狀腺乳頭狀癌形成的重要環(huán)節(jié)，在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。但是獨(dú)立的BRAFV600E突變檢測(cè)的敏感性低于FNAC，獨(dú)立檢測(cè)也難以滿足臨床需求。

FNAC是目前甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)判定最為常用的檢查方法，也是術(shù)前評(píng)估甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性敏感性和特異性較高的方法。有研究入組了數(shù)百名甲狀腺結(jié)節(jié)患者，比較其FNAC與術(shù)后組織病理檢查的差異，F(xiàn)NAC的假陽(yáng)性率和假陰性率分別為1.9%、10.5%，敏感性和特異性分別為89.5%、98%[12]。FNAC的檢查結(jié)果多依賴于操作者的熟練程度和細(xì)胞病理學(xué)檢查水平的要求。本研究入組的92例患者中共有16例甲狀腺癌（15例乳頭狀甲狀腺癌，1例濾泡狀癌）患者被診斷為良性，考慮細(xì)針穿刺時(shí)未取得結(jié)節(jié)中惡性病變部位所致可能，計(jì)算其單獨(dú)FNAC穿刺鑒別良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的敏感性為74%，特異性為78%。因此，不可否認(rèn)，單獨(dú)采用FNAC作為鑒別甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的檢測(cè)手段缺乏可靠性。針對(duì)FNAC不能明確的甲狀腺結(jié)節(jié)的問(wèn)題，很多學(xué)者提出通過(guò)檢測(cè)甲狀腺組織或甲狀腺細(xì)針穿刺樣本中的甲狀腺癌分子標(biāo)志物來(lái)明確診斷。

本研究將BRAFV600E與FNAC聯(lián)合進(jìn)行良惡性診斷的預(yù)測(cè)，其結(jié)果表明二者聯(lián)合診斷的敏感性與特異性為77%和96%，進(jìn)一步計(jì)算診斷的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值分別為98%和63%，提示聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于甲狀腺結(jié)節(jié)患者良惡性的診斷有很強(qiáng)的指導(dǎo)意義。BRAFV600E基因突變對(duì)于惡性甲狀腺結(jié)節(jié)有高的敏感性，其有助于在FNAC穿刺細(xì)胞形態(tài)學(xué)不典型和取樣效果不佳的情況下做出有效的鑒別診斷，對(duì)細(xì)胞形態(tài)不典型和可疑時(shí)對(duì)明確腫瘤的性質(zhì)具有重要意義。

綜上所述，本研究證實(shí)BRAFV600E突變與甲狀腺癌的發(fā)生有顯著的相關(guān)性，其能顯著提高良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率。但BRAFV600E突變檢測(cè)的敏感性較低，獨(dú)立檢測(cè)難以滿足臨床需求。而B(niǎo)RAFV600E與FNAC聯(lián)合檢測(cè)可以有效識(shí)別甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的高危患者，為臨床醫(yī)生的早期治療策略提供重要依據(jù)。

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Value of BRAFV600EGenetic Testing for Diagnosis of Benign and Malignant Thyroid Nodules

QIAN Wei-Ming1,JIANG Xie1,SHAO Rong1,XUE Jian2,WANG Peng1*
1.Changzhou Wujin Chinese Medicine Hospital,Wujin 213003;2.Affiliated Hospital of Academy of Military Medi?cal Sciences,Beijing 100071;China

Objective:To evaluate the diagnostic value of the BRAFV600Egenetic testing in thyroid nodules and as?sess its value diagnosis combined with fine-needle aspiration cytology（FNAC）of benign and malignant thyroid nod?ules used in clinical.Methods:We enrolled the thyroid nodules patients treated in Wujin Chinese Medicine Hospi?tal from January to December 2015.We determinated the BRAFV600Ephenotype and FNAC after admission,using the surgical histopathology performed on patients with benign and malignant thyroid nodules.Results:A total of 92 thyroid nodules patients were enrolled,including 65 cases of malignant nodules.Multivariate results showed that the mutation of BRAFV600Eand malignant thyroid nodules were correlated,the risk increased 44.42 times（OR= 44.42,95%CI:5.66～348.44）.The mutation of BRAFV600Epredicts the occurrence of malignant thyroid nodules sen?sitivity and specificity were 63%（95%CI:0.50～0.74）and 96%（95%CI:0.79～0.99）.Conclusion:The mutation of BRAFV600E,which can significantly improve the detection of benign and malignant thyroid nodules rate incidence of thyroid cancer has a significant correlation with the incidence of thyroid cancer.

BRAFV600Egene;thyroid nodulesl;diagnostic value

R446;Q789

A

1009-0002（2017）02-0123-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.011

2016-10-09

錢偉明（1973-），男，副主任醫(yī)師

王鵬，（E-mail）wangpengwjzyyy@163.com

*Corresponding anthor,E-mail:wangpengwjzyyy@163.com