丹參酮Ⅰ通過(guò)誘導(dǎo)凋亡抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)

張英，龐博，鄭利華，黃芳，王健，王芃，劉貴建，李山虎

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 廣安門醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100053；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

丹參酮Ⅰ通過(guò)誘導(dǎo)凋亡抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)

張英1，2，龐博1，鄭利華1，黃芳2，王健2，王芃2，劉貴建1，李山虎2

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 廣安門醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100053；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

目的：研究丹參酮Ⅰ對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的影響。方法：MTT法檢測(cè)丹參酮Ⅰ對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響，Western印跡檢測(cè)經(jīng)丹參酮Ⅰ處理的HepG2細(xì)胞中凋亡標(biāo)志物c-Parp和周期蛋白D1的表達(dá)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡及周期分布。結(jié)果：MTT分析發(fā)現(xiàn)丹參酮Ⅰ可抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)；經(jīng)丹參酮Ⅰ處理的HepG2細(xì)胞中凋亡標(biāo)志物c-Parp表達(dá)升高，周期蛋白D1表達(dá)無(wú)明顯變化；流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果進(jìn)一步證明丹參酮Ⅰ可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，對(duì)細(xì)胞周期分布無(wú)明顯影響。結(jié)論：丹參酮Ⅰ通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞周期無(wú)明顯阻滯，為進(jìn)一步研究丹參酮Ⅰ的抗腫瘤作用分子機(jī)制提供了線索。

丹參酮Ⅰ；HepG2細(xì)胞；周期；凋亡

丹參（Savia miltiorrhiza）是常用傳統(tǒng)中藥，功擅活血化瘀，其主要化學(xué)成分為脂溶性的丹參酮類和水溶性的丹參酚酸類。丹參酮Ⅰ（tanshinoneⅠ，T1）是從丹參中分離提取的一種脂溶性紅色結(jié)晶（圖1），近年發(fā)現(xiàn)其能抑制STAT-3和AKT/ mTOR信號(hào)通路，抑制淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞P338和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453、MCF-7的生長(zhǎng)[1-2]，但其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的具體機(jī)制仍不清楚。為了進(jìn)一步研究T1的抗腫瘤作用，為丹參的抗腫瘤臨床應(yīng)用提供更廣泛的依據(jù)，我們初步探討了T1對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)、周期和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

丹參酮Ⅰ購(gòu)自北京盈澤納新化工技術(shù)研究院；人肝癌細(xì)胞HepG2為本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；MTT粉末購(gòu)自Sigma公司；c-Parp、周期蛋白D1抗體購(gòu)自CST公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基公司。

1.2 MTT分析

將HepG2細(xì)胞按3000/孔接種于96孔板，經(jīng)T1處理后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），37℃孵育4 h后吸盡培養(yǎng)液，按150 μL/孔加入DMSO，充分吹打混勻，用酶標(biāo)儀檢測(cè)D570nm值。將對(duì)照組設(shè)為1，處理組與對(duì)照組的比值即為相對(duì)細(xì)胞增殖率。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 Western印跡

將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在100 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%加T1（10 μmol/L）處理，提取細(xì)胞蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，封閉后加入一抗，4℃輕搖孵育48 h，用TBST洗膜3次，加入二抗，4℃輕搖孵育24 h，用TBST洗膜3次，滴加化學(xué)發(fā)光液，暗室膠片顯像。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡

用10 μmol/L T1分別處理HepG2細(xì)胞24和48 h，PBS洗2次，用75%冷乙醇于-20℃固定，2000 r/min離心3 min后加入25 mg/L RNase和50 mg/L PI，避光染色30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，用Modifit LT軟件分析數(shù)據(jù)。

凋亡檢測(cè)按凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用1 mL 1×上樣緩沖液懸浮細(xì)胞，300 RCF離心10 min后棄上清；用適量的1×上樣緩沖液調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/mL，取100 μL細(xì)胞液加入5 μL An?nexinⅤ-FITC，輕輕振蕩混勻，室溫避光孵育10 min；加入5 μL PI試劑，室溫避光孵育5 min；最后加PBS到500 μL，輕輕混勻后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，用Modifit LT軟件分析數(shù)據(jù)。

圖1 丹參酮Ⅰ的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)

2 結(jié)果

2.1 丹參酮Ⅰ抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)

分別用 0、2、4、6、8、10 μmol/L T1處理HepG2細(xì)胞48 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率（存活率=加藥組D570nm值/對(duì)照組D570nm值）。結(jié)果顯示，T1濃度為8 μmol/L時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，抑制率達(dá)67.4%，并且隨著T1濃度的增加抑制作用增強(qiáng)（圖2）。用8 μmol/L T1分別處理HepG2細(xì)胞24、48、72 h，T1對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制率（抑制率=1-存活率）隨時(shí)間的延長(zhǎng)而上升（圖3）。

圖2 不同濃度T1對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖3 T1處理不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.2 丹參酮Ⅰ誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡

用10 μmol/L T1分別處理HepG2細(xì)胞24和48 h，Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中凋亡標(biāo)志物c-Parp的表達(dá)。結(jié)果表明，T1處理能使c-Parp蛋白表達(dá)明顯升高，提示T1能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡（圖4）。

用10 μmol/L T1分別處理HepG2細(xì)胞24和48 h，與不加T1處理的對(duì)照組相比，早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞均明顯增多，早期凋亡率和晚期凋亡率平均值分別為4.36%和6.04%，證明T1可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡（圖5、6）。

2.3 丹參酮Ⅰ對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布無(wú)明顯阻滯作用

為了探究T1是否影響HepG2細(xì)胞的周期分布，用10 μmol/L T1分別處理HepG2細(xì)胞24和48 h，Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中周期蛋白D1的表達(dá)。結(jié)果表明，T1處理的HepG2細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)沒(méi)有明顯變化，提示T1對(duì)HepG2細(xì)胞的周期分布沒(méi)有明顯影響（圖7）。

用10 μmol/L T1分別處理HepG2細(xì)胞24和48 h，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)G1、G2、S各期細(xì)胞分布與不加T1處理的對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異，G2/G1期細(xì)胞比例依次為1.92（對(duì)照組）、1.92（T1處理24 h）和1.93（T1處理48 h），各組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明T1對(duì)HepG2細(xì)胞的周期分布沒(méi)有顯著影響（圖8、9）。

圖4 T1處理HepG2細(xì)胞的c-Parp蛋白表達(dá)

圖5 T1處理HepG2細(xì)胞的凋亡率

圖6 流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡

3 討論

中醫(yī)理論中，活血化瘀是治療癌癥的主要方法之一。丹參作為常用的活血化瘀中藥，具有抗腫瘤作用，已被用于肝癌、胃癌、白血病等多種腫瘤的治療[3]。近年來(lái)研究表明丹參酮是丹參抗腫瘤的主要活性成分，對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接的殺傷作用[4-5]。目前，在對(duì)眾多丹參抗腫瘤成分的研究中，關(guān)于丹參酮Ⅰ抗腫瘤的報(bào)道較少。有研究提示，與抗腫瘤作用研究最為廣泛和深入的丹參酮ⅡA相比，丹參酮Ⅰ具有更強(qiáng)的藥效，值得深入探討[6]。我們的研究表明丹參酮Ⅰ通過(guò)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，顯著抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。我們檢測(cè)了經(jīng)丹參酮Ⅰ處理的HepG2細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)與腫瘤關(guān)系最為密切、能夠促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換速度、導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控而發(fā)生癌變的周期蛋白D1的表達(dá)沒(méi)有明顯變化，證明丹參酮Ⅰ對(duì)HepG2細(xì)胞的周期分布無(wú)顯著影響。我們的研究結(jié)果證明，丹參酮Ⅰ抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖作用的機(jī)制與阻滯細(xì)胞周期無(wú)關(guān)，是通過(guò)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡和其他未知途徑如自噬等實(shí)現(xiàn)的，這為丹參酮Ⅰ抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制研究提供了重要線索。同時(shí)，我們證明了丹參酮Ⅰ是丹參中有效的抗腫瘤活性成分之一，為丹參用于臨床治療腫瘤提供了依據(jù)。

圖7 T1處理HepG2細(xì)胞的周期蛋白D1的表達(dá)

圖8 T1處理后HepG2細(xì)胞周期分布變化

圖9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T1處理后HepG2細(xì)胞的周期分布

[1]Li H,Zhang Q,Chu T,et al.Growth inhibitory and apoptosis inducing effects of tanshinones on hematolog?ical malignancy cells and their structure activity rela?tionship[J].Anticancer Drug,2012,23(8):846-855.

[2]Wang Yan,Li Jia-Xin,Wang Ying-Qing,et al.Tan?shinone I inhibits tumor angiogenesis by reducing STAT3 phosphorylation atTYR705 and hypoxia-in? duced HIF-1αaccumulation in both endothelial and tu?mor cells[J].Oncotarget,2015,6(18):16031-16042.

[3]張民慶,龔惠明.抗腫瘤中藥的臨床應(yīng)用[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1998:256-258.

[4]陳堅(jiān),林庚金.丹參酮抗腫瘤的研究進(jìn)展[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2003,30(6):626-628.

[5]張偉偉,陸茵.丹參抗腫瘤活性成分研究新進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2010,35(3):389-382.

[6]郝文慧,趙文文,陳修平.丹參酮類抗腫瘤作用與機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2014,30(8):1041-1044.

TanshinoneⅠInhibits the Growth of HepG2 Cells by Induc?ing Apoptosis

ZHANG Ying1,2,PANG Bo1,ZHENG Li-Hua1,HUANG Fang2, WANG Jian2,WANG Peng2,LIU Gui-Jian1*,LI Shan-Hu2*
1.Clinical Laboratories,Guang'anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053; 2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;China

Objective:To study the influence of TanshinoneⅠon HepG2 cells proliferation,cell cycle and cell apoptosis.Methods:The proliferation of cells was detected by MTT assay.Western blotting was used to detect the c-Parp and cyclin D1.The cell apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometer.Results:MTT re?sults showed that tanshinoneⅠinhibits the growth of HepG2 cells.Western blotting proved that tanshinoneⅠcan make the apoptosis marker c-Parp increase in HepG2 cells,but didn't change cyclin D1.Flow cytometry results showed that tanshinoneⅠcan induce apoptosis of HepG2 cells and had no effect on the cycle distribution.Conclu?sion:TanshinoneⅠinhibits the growth of HepG2 cells by inducing apoptosis,which provided a clue for further study on the molecular mechanism of anti-tumor action of tanshinoneⅠ.

tanshinoneⅠ;HepG2 cells;cell cycle;cell apoptosis

Q25

A

1009-0002（2017）02-0105-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.007

2016-11-17

國(guó)家自然科學(xué)基金（81470138，81372770，81372140）

張英（1989-），女，碩士研究生

李山虎，（E-mail）lishanhu6@163.com；劉貴建，（E-mail）liuguijian@hotmail.com

*Co-corresponding anthors,LI Shan-Hu,E-mail:lishahuhu6@163.com;LIU Gui-Jian,E-mail:liuguijian@hotmail.com