2型豬鏈球菌N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脫乙酰酶基因的克隆表達(dá)及酶活性測(cè)定

錢(qián)思彤，龔秀芳，唐慧嫻，王依，潘秀珍，王長(zhǎng)軍

1.中國(guó)藥科大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.南京軍區(qū) 軍事醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 南京 210002

研究報(bào)告

2型豬鏈球菌N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脫乙酰酶基因的克隆表達(dá)及酶活性測(cè)定

錢(qián)思彤1，2，龔秀芳1，2，唐慧嫻1，2，王依2，潘秀珍2，王長(zhǎng)軍1，2

1.中國(guó)藥科大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.南京軍區(qū) 軍事醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 南京 210002

目的：克隆表達(dá)2型豬鏈球菌N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脫乙酰酶（NagA）的編碼基因，并測(cè)定其酶活性。方法：根據(jù)GenBank中05ZYH33基因組序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增NagA（SSU05_1259）基因，將其克隆到pET28a載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a:NagA，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)物通過(guò)SDS-PAGE與質(zhì)譜鑒定；利用Ni親和層析柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，獲得NagA重組蛋白后測(cè)定其酶活性。結(jié)果：在大腸桿菌中高效表達(dá)了NagA基因，重組表達(dá)的NagA相對(duì)分子質(zhì)量約為43×103，其酶促反應(yīng)最適溫度為37℃，最佳反應(yīng)時(shí)間為30 min，最適反應(yīng)pH值為7.5，最佳底物濃度為13 mmol/L。2型豬鏈球菌NagA的體外酶活為124 U/mL，酶比活為78 U/ mg。結(jié)論：在原核系統(tǒng)中表達(dá)了NagA基因，獲得的NagA蛋白具有良好的酶學(xué)活性。

2型豬鏈球菌；N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脫乙酰酶；原核表達(dá)；酶活性

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是一種重要的人獸共患病病原，屬于鏈球菌屬，是革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，可引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、敗血癥甚至急性死亡[1-2]。目前，世界范圍內(nèi)發(fā)生的該菌感染人的病例已逾400例，70余患者死亡[1]。2型豬鏈球菌（SS2）是豬鏈球菌35種血清型中致病力最強(qiáng)、臨床檢出率最高、呈全球性分布的血清型，是重要的人獸共患病病原[3]。我國(guó)江蘇海安和四川資陽(yáng)分別于1998、2005年暴發(fā)SS2感染人的公共衛(wèi)生事件，患者中出現(xiàn)了鏈球菌中毒性休克綜合征（streptococcal toxic shock syndrome，STSS），引起全世界的廣泛關(guān)注[3-4]。

豬鏈球菌的不同血清型菌株的致病性差異較大，這與其復(fù)雜的致病機(jī)制密切相關(guān)，主要涉及毒力因子的黏附、入侵、擴(kuò)散等方面，目前尚未完全闡明，報(bào)道較多的相關(guān)毒力因子有莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）、胞外因子（exracel?lular factor，EF）、溶菌酶釋放蛋白（muraminidase released protein，MRP）、溶血素（suilysin，SLY）等，可能在感染致病的不同階段先后或協(xié)調(diào)發(fā)揮作用[5-7]。蛋白酶是重要的功能分子，在細(xì)菌修飾、活化與代謝中發(fā)揮重要功能，也可參與細(xì)菌侵襲致病過(guò)程[8]。已發(fā)現(xiàn)N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸的脫乙酰作用是脂多糖合成和細(xì)胞壁再生的重要環(huán)節(jié)，葡萄糖胺-6-磷酸是GalNAc/GalN代謝通路的正常中間體，同時(shí)葡萄糖胺-6-磷酸還可通過(guò)NagS轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸。在革蘭陰性菌如大腸桿菌中，該反應(yīng)也是脂多糖合成和細(xì)胞壁氨基糖回收的重要途徑，負(fù)責(zé)催化該反應(yīng)的酶就是N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶（N-acetylglu?cosamine-6-phosphate deacetylase，NagA）[9-11]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)NagA在枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的致病性中發(fā)揮重要作用[12-14]，但SS2是否表達(dá)該酶以及其是否參與了細(xì)菌的致病過(guò)程尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題組在對(duì)SS2中國(guó)強(qiáng)毒株05ZYH33進(jìn)行全基因組測(cè)序和功能注釋時(shí)，在基因組中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與枯草芽孢桿菌和大腸桿菌NagA編碼基因同源性較高的類(lèi)似物，進(jìn)而構(gòu)建了適宜的原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)該基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，純化其表達(dá)產(chǎn)物，并進(jìn)一步分析其酶活性，為研究NagA在SS2糖代謝以及豬鏈球菌致病過(guò)程中可能發(fā)揮的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

SS2菌株05ZYH33、表達(dá)質(zhì)粒pET-28a由本實(shí)驗(yàn)室保存；受體菌大腸桿菌DH5α及BL21購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；pMD-19T質(zhì)粒、PCR擴(kuò)增試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ、DNA marker購(gòu)自TaKaRa有限公司；DNA割膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司；蛋白質(zhì)marker購(gòu)自晶美公司；NagA反應(yīng)底物N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸鈉鹽（GlcNAc-6-P）購(gòu)自Sigma-Alorich生物工程有限公司；紫外分光光度計(jì)UV2100為尤尼柯公司產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)05ZYH33基因組中NagA基因序列設(shè)計(jì)上游引物（5'-GAGGGATCCATGGTTATAACCAGT TT-3'，下劃線(xiàn)部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）、下游引物（5'-ATACTCGAGACCAAATCGTTTCACG-3'，下劃線(xiàn)部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），由上海賽百盛公司合成。

1.3 NagA基因的擴(kuò)增

常規(guī)PCR擴(kuò)增目的基因，25 μL反應(yīng)體系包括05ZYH33基因組DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTP混合液2 μL，10×PCR緩沖液（加Mg2+）2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，dd H2O 18.3 μL。

反應(yīng)參數(shù)：95℃ 3 min預(yù)變性；94℃ 30 s、54℃ 1 min、72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

1.4 pMD19-T克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

用DNA膠回收試劑盒回收瓊脂糖凝膠中的目的基因片段，連接至pMD19-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒；質(zhì)粒pMD19-T:NagA經(jīng)PCR和XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定正確后，送華大公司測(cè)序，分析結(jié)果。

1.5 pET28a:NagA質(zhì)粒的構(gòu)建

將1.4構(gòu)建的pMD19-T:NagA質(zhì)粒和pET28a載體分別用XhoⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收NagA目的片段和線(xiàn)性化的pET28a片段；用DNA高效連接酶于16℃連接2 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽(yáng)性單克隆，提質(zhì)粒；pET28a:NagA質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切鑒定正確后，送華大公司測(cè)序鑒定，分析結(jié)果。

1.6 重組質(zhì)粒pET28a:NagA的誘導(dǎo)表達(dá)

1.6.1 重組蛋白NagA表達(dá)形式鑒定 將重組質(zhì)粒pET28a:NagA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG于37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，收集菌體于冰浴中超聲波破碎，離心后取上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE，觀察分析是否有目的蛋白的表達(dá)。

1.6.2 重組蛋白NagA的純化 離心收集表達(dá)菌液破碎后的上清，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，過(guò)濾后的上清液與用PBS平衡過(guò)的Ni離子親和層析柱填料螯合，冰浴2 h，用90 mmol/L咪唑洗脫并收集目的蛋白，10%SDS-PAGE鑒定目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.7 目標(biāo)蛋白的質(zhì)譜分析

從SDS-PAGE膠上切取含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的條帶，經(jīng)膠內(nèi)酶解后用Q-TOF質(zhì)譜儀分析，提取質(zhì)譜數(shù)據(jù)，用Data Analysis軟件標(biāo)峰后進(jìn)行MAS?COT搜索，得到重組蛋白的LC-MS/MS報(bào)告單，從而判定是否為NagA。

1.8 NagA酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1.8.1 酶活性測(cè)定 37℃時(shí)每分鐘消耗1 μmol GlcNAc-6-P生成1 μmol產(chǎn)物的NagA量為一個(gè)酶單位（U）。GlcNAc-6-P于215 nm處酰胺基團(tuán)有紫外吸收，水解反應(yīng)后吸收消失，故可以通過(guò)1 min內(nèi)底物D215nm值的減少量來(lái)確定參與反應(yīng)的底物量，確定其酶活性。最后確定的檢測(cè)方法為：在總體積為 1mL的含 13mmol/L底物GlcNAc-6-P的Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH7.5）體系中，加入純化的重組NagA 1.6 μg，37℃反應(yīng)30 min，于沸水中5 min終止反應(yīng)，分別測(cè)量反應(yīng)前后的D215nm值，通過(guò)D215nm值的減少量計(jì)算參加反應(yīng)的底物量。按下式計(jì)算酶活性：

酶活性（U/mL）=（ΔD215nm×1000）/（0.331×30）其中，ΔD215nm為反應(yīng)前后的吸光度差值，1000為將1 μL稀釋酶液的酶活性折算為1 mL的酶活性，30為反應(yīng)時(shí)間（30 min），0.331為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)系數(shù)。

1.8.2 GlcNAc-6-P吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 據(jù)文獻(xiàn)[15]，GlcNAc-6-P的吸收峰為200～300 nm，在215 nm處有特征吸收。配制濃度分別為0、0.5、1、1.5、2、2.5 mmol/L的GlcNAc-6-P溶液，定容至1 mL，各取200 μL測(cè)定D215nm值（以下所有吸光度值均為測(cè)量3次后的平均值），制作GlcNAc-6-P吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.8.3 最適溫度 為確定溫度對(duì)NagA活性的影響，在pH7.5、反應(yīng)時(shí)間30 min時(shí)分別測(cè)定25℃、30℃、37℃、42℃、50℃、60℃和70℃時(shí)的酶活性。

1.8.4 最適反應(yīng)時(shí)間 為確定酶促反應(yīng)的最適反應(yīng)時(shí)間，在37℃、pH7.5條件下，分別測(cè)定反應(yīng)10、15、20、25、30、35、40、45、50、60及90 min時(shí)的酶活性。

1.8.5 最適pH值 為確定pH值對(duì)NagA活性的影響，在37℃、反應(yīng)時(shí)間30 min時(shí),測(cè)定pH值分別為3、5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10時(shí)的酶活性。

1.8.6 底物濃度對(duì)酶活的影響 為探索底物濃度對(duì)NagA活性的影響，在pH7.5、37℃條件下，分別將底物濃度設(shè)為1、3、5、7、9、11、13、15、20 mmol/ L，觀察該酶的活性。

2 結(jié)果

2.1 2型豬鏈球菌NagA基因序列分析

以05ZYH33菌株為模板，PCR擴(kuò)增得到約1200 bp的目的條帶，測(cè)序結(jié)果顯示序列全長(zhǎng)1191 bp，編碼397個(gè)氨基酸殘基，讀框正確無(wú)誤。進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)NagA蛋白在豬鏈球菌不同菌株中高度保守，氨基酸序列相似性在90%以上，與牛鏈球菌（S.ovis）、嗜熱鏈球菌（S.ther?mophilus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus cereus）、S.merio?nis等的氨基酸序列相似性分別為85%、63%、61%和61%，其氨基酸序列比對(duì)結(jié)果如圖1，圖2為擴(kuò)增片段的電泳圖譜。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a:NagA的構(gòu)建和鑒定

pET28a:NagA質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3，pET28a: NagA經(jīng)雙酶切后得到明顯的2條帶，其中1200 bp左右的小片段為目的基因NagA，3500 bp左右的大片段為pET28a線(xiàn)性化載體，而pET28a空載體經(jīng)雙酶切得到大于4500 bp的大片段。測(cè)序結(jié)果顯示，目的基因與GenBank中SS2中國(guó)強(qiáng)毒株05ZYH33的NagA基因的序列一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 NagA蛋白的氨基酸序列比對(duì)圖

2.3 NagA的表達(dá)及純化

2.3.1 重組質(zhì)粒pET28a:NagA的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌經(jīng)超聲波裂解后離心，進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖4），發(fā)現(xiàn)目的蛋白大部分存在于沉淀中，約占60%，上清中含有少部分，約占30%。顯示目的蛋白主要以包涵體形式存在。

2.3.2 重組蛋白NagA的純化 選取上清中可溶性蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE，在相對(duì)分子質(zhì)量約43×103處出現(xiàn)新生蛋白條帶，大小與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)His親和層析柱純化，電泳結(jié)果顯示純化產(chǎn)物為單一特異性條帶（圖5）。

2.4 NagA重組蛋白的質(zhì)譜分析

圖2 NagA基因的PCR擴(kuò)增

圖3 pET28a:NagA重組質(zhì)粒的XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定

圖4 NagA重組蛋白的可溶性表達(dá)鑒定

質(zhì)譜結(jié)果顯示NagA重組蛋白與預(yù)測(cè)的NagA序列相似度較高，結(jié)果如下，其中劃線(xiàn)部分為氨基酸序列完全一致的區(qū)域：

2.5 重組NagA的酶活性測(cè)定

2.5.1 GlcNAc-6-P吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 215 nm下繪制的底物標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖6。

2.5.2 溫度對(duì)酶活性的影響 在一定條件下，一種酶只在特定的反應(yīng)溫度下表現(xiàn)出最大的活性，該溫度即為最適溫度。在pH7.5、反應(yīng)時(shí)間30 min的條件下，當(dāng)溫度低于37℃時(shí)，酶活性隨溫度的升高而升高，37℃時(shí)酶活性達(dá)到峰值，此后酶活性保持在一個(gè)較低水平，當(dāng)反應(yīng)溫度高于60℃時(shí)酶活性急劇下降（圖7）。因此，該酶最適反應(yīng)溫度約為37℃。

圖5 SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)和純化

圖6 GlcNAc-6-P吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.5.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活性的影響 在pH7.5、37℃條件下分別檢測(cè)不同反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的酶活性，結(jié)果如圖8。在10～30 min內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，NagA酶促反應(yīng)速度顯著增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)反應(yīng)速度達(dá)到最大值，反應(yīng)時(shí)間超過(guò)30 min時(shí)反應(yīng)速度降低，反應(yīng)呈低水平抑制狀態(tài)，推測(cè)NagA酶促反應(yīng)產(chǎn)物之一的N-氨基葡糖-6-磷酸（GlcN-6-P）可能是NagA的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑[15]，NagA酶的脫乙酰作用可能受其產(chǎn)物濃度的影響，故SS2中NagA酶的最適反應(yīng)時(shí)間約為30 min。見(jiàn)圖8。

2.5.4 pH值對(duì)酶活性的影響 同一種酶在不同pH值環(huán)境中所表現(xiàn)的活性不同，在特定條件下，酶顯示最大活性的pH值即為該酶的最適pH值。在37℃、反應(yīng)時(shí)間30 min的條件下，測(cè)定不同pH值對(duì)NagA酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)該酶在酸性條件下的活性高于堿性條件，且在pH7.5時(shí)顯示最高活性（圖9）。

2.5.5 底物濃度對(duì)酶活的影響 測(cè)定pH7.5、37℃時(shí)酶活性與底物濃度的關(guān)系，結(jié)果如圖10。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?～13 mmol/L時(shí)，NagA酶活性隨底物濃度的增加而增加，底物濃度為13 mmol/L時(shí)酶促反應(yīng)達(dá)到飽和?？紤]到相關(guān)成本因素，默認(rèn)當(dāng)?shù)孜餄舛葹?3 mmol/L時(shí)酶活性最大。

2.5.6 酶活性測(cè)定 根據(jù)底物GlcNAc-6-P吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及NagA活計(jì)算公式，可得純化后的2型豬鏈球菌NagA的體外酶活為124 U/mL。通過(guò)One-Drop測(cè)定純化后的重組NagA蛋白含量為1.6 mg/mL，計(jì)算可得酶比活為78 U/mg。

圖7 反應(yīng)溫度與酶活性的關(guān)系

圖8 反應(yīng)時(shí)間與酶活性的關(guān)系

3 討論

細(xì)菌可以有效利用氨基糖合成細(xì)胞壁中的肽聚糖和細(xì)胞膜中的脂多糖，同時(shí)氨基糖也是細(xì)菌生長(zhǎng)與增殖中良好的碳源與氮源[15]。當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境中存在氨基糖時(shí)，會(huì)自發(fā)誘導(dǎo)產(chǎn)生與氨基糖類(lèi)吸收和代謝相關(guān)的酶。N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脫乙酰酶是氨基糖代謝過(guò)程中一種重要的酶，可以將N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸水解為N-氨基葡糖-6-磷酸和醋酸[16]，該步驟是N-乙酰氨基葡糖同化作用和氨基糖核苷酸生物合成中的第一個(gè)關(guān)鍵步驟[17]。本課題組在進(jìn)行05ZYH33全基因組注釋時(shí)發(fā)現(xiàn)了可能編碼NagA的基因SSU1259，其推導(dǎo)的氨基酸序列與牛乳鏈球菌及枯草芽孢桿菌中的NagA氨基酸序列具有較高的同源性，推測(cè)其編碼NagA蛋白?；诖?，本研究克隆表達(dá)了編碼該酶的目的基因，分析了重組蛋白的酶學(xué)活性與功能，為確定其在SS2可能的致病性中的作用以及相關(guān)疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖9 pH值與酶活性的關(guān)系

圖10 底物濃度與酶活性的關(guān)系

本研究克隆表達(dá)的中國(guó)強(qiáng)毒株05ZYH33中NagA基因全長(zhǎng)1191 bp，編碼由397個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，質(zhì)譜檢測(cè)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約43×103。經(jīng)原核表達(dá)及His親和層析獲得高純度的NagA重組蛋白，進(jìn)一步酶活性檢測(cè)表明SS2的NagA與其他已知來(lái)源的NagA蛋白既具有相似的酶學(xué)功能，也具有其獨(dú)有的酶學(xué)特性。SS2來(lái)源的NagA酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，而大腸桿菌[15]和棲熱菌Thermus caldophilus[16]的NagA酶的最適反應(yīng)溫度分別為30℃、70℃[16]，猜測(cè)可能與SS2是人豬共患病病原有關(guān)，其最適反應(yīng)溫度與宿主溫度接近。SS2的NagA最適pH值范圍較窄，為7～7.5，偏離上述條件時(shí)酶活性迅速下降；而大腸桿菌NagA酶的最適反應(yīng)pH值為7.5，T.caldophilus中NagA的最適反應(yīng)pH值為7.0[15-16]。上述不同來(lái)源的NagA酶在溫度和pH值敏感性上的差異可能是微生物適應(yīng)各自宿主環(huán)境的表現(xiàn)，也可能是自然選擇的結(jié)果[18]。此外，不同來(lái)源的NagA酶的最適反應(yīng)時(shí)間與最適底物濃度也不盡相同，本研究中NagA的最適反應(yīng)時(shí)間是30 min，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，酶促反應(yīng)呈低水平抑制狀態(tài)，推測(cè)NagA酶促反應(yīng)產(chǎn)物之一的GlcN-6-P可能是NagA的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值后，酶促反應(yīng)達(dá)到飽和，其反應(yīng)速率不再隨底物濃度的增加而增加。

綜上所述，我們克隆表達(dá)了SS2中的NagA基因，獲得了純度較高的N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脫乙酰酶蛋白，對(duì)其酶活特性進(jìn)行了系統(tǒng)分析。研究結(jié)果為進(jìn)一步分析NagA在2型豬鏈球菌糖代謝及感染致病過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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Gene Cloning,Expression and Identification of the NAcetylglucosam ine-6-Phosphate Deacetylase of Streptococcus suis serotype 2

QIAN Si-Tong1,2,GONG Xiu-Fang1,2,TANG Hui-Xian1,2, WANG Yi2,PAN XIU-Zhen2,WANG Chang-Jun1,2*
1.School of Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing 211198;
2.Institute of Military Medical Sciences,Nanjing Military Region,Nanjing 210002;China

Objective:To clone and prokaryotically express the gene encoding N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase（NagA）of Streptococcus suis serotype 2 and to measure the enzymatic activity of the recombinant pro?tein.Methods:The gene encoding NagA was amplified by PCR from the template S.suis 05ZYH33 genomic se?quence,and was cloned into vector pET28a to obtain the recombinant plasmid pET-28a:NagA,then it was trans?formed into E.coli BL21.The recombinant NagA protein was induced to express by IPTG,and analyzed with SDSPAGE and LC-MS/MS,purified by Ni affifnity chromatography,followed by enzymatic activity measurement.Re?sults:NagA gene（SSU05_1259）was expressed in E.coli with Mrabout 43×103.The optimum temperature,action time,pH and the substrate concentration of the purified NagA protein were 37℃,30 min,7.5 and 13 mmol/L,re?spectively.Enzymatic activity of NagA was 124 U/mL,specific activity was 78 U/mL.Conclusion:The NagAgene has been expressed in prokaryotic system,and the purified recombinant protein has the best enzymatic activi?ty in optimum experimental condition.

Streptococcus suis seroptype 2;N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase;prokaryotic expres?sion;enzymatic activity

Q78

A

1009-0002（2017）02-0069-08

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.001

2016-11-18

國(guó)家自然科學(xué)基金（81471920，81501725）；江蘇省自然科學(xué)青年基金（BK20140096）；南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新課題（ZX39）

錢(qián)思彤（1992-），女，碩士研究生

王長(zhǎng)軍，（E-mail）science2008@hotmail.com

*Corresponding anthor,E-mail:science2008@hotmail.com