禽致病性大腸桿菌的分離鑒定及致病性研究

王傳春 袁東方 孫秋艷 李 舫

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）

禽致病性大腸桿菌的分離鑒定及致病性研究

王傳春 袁東方 孫秋艷 李 舫*

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）

禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌所引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要細(xì)菌性傳染病之一。本試驗(yàn)對壽光市某養(yǎng)殖場送檢的具有典型大腸桿菌病的臨床癥狀的15只病死雞進(jìn)行剖檢，病理組織學(xué)觀察，分離鑒定出禽致病性大腸桿菌；并用分離純化的細(xì)菌對7日齡的雛雞進(jìn)行注射，連續(xù)觀察7d，研究其致病性及感染雛雞發(fā)病特點(diǎn)，同時對死亡雛雞進(jìn)行了系統(tǒng)的病理組織學(xué)觀察，分析了大腸桿菌感染雛雞的致病規(guī)律。為臨床上雛雞大腸桿菌病的診斷和防治提供理論依據(jù)。

禽致病性大腸桿菌 分離鑒定 致病性

日齡的肉雞發(fā)病流行最嚴(yán)重，主要經(jīng)雞的呼吸道、消化道和種蛋等途徑進(jìn)行傳播[5]。為了解APEC的致病性及感染雛雞的發(fā)病特點(diǎn)，本研究對濰坊市壽光市某養(yǎng)殖場送檢的具有典型大腸桿菌病的臨床癥狀的15只病、死雞進(jìn)行剖檢，病理組織學(xué)觀察，分離鑒定，并對7日齡的雛雞進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，為臨床上雛雞大腸桿菌病的診斷和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 濰坊市壽光市某養(yǎng)殖場送檢的15只病、死雞。

1.2 試劑 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MAC(麥康凱)培養(yǎng)基、

PC(普通營養(yǎng)瓊脂)培養(yǎng)基、EMB(伊紅美藍(lán))培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基均購自于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)動物 購自山東某種禽孵化場的7日齡的雛雞30羽份。

1.4 病理剖檢及樣本采集 對送檢的15只病死雛雞進(jìn)行剖檢，詳細(xì)記錄各個器官的病理變化，無菌采集病死雞的心、肝、脾、肺、腎等組織，一部分用于細(xì)菌分離培養(yǎng)，一部分用4%多聚甲醛固定48 h用于切片制作。

1.5 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 以上病料在MAC上接種劃線，37℃恒溫箱培養(yǎng)18h。觀察菌落形態(tài)并選取單個粉紅色典型菌落接種于PC上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。取擴(kuò)大培養(yǎng)的菌落接種于EMB、SS培養(yǎng)基再次培養(yǎng)并鑒別；取典型菌落置于肉湯之中在37 18h℃ 的條件下純培養(yǎng)，用少量石炭酸生理鹽水洗去菌苔、稀釋制成菌懸液(細(xì)菌約1×109個/ml)，儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)室鑒定 （1）鏡檢：于顯微鏡下觀察細(xì)菌的染色情況與形態(tài)。（2）生化試驗(yàn)：將分離的菌株接種于葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、枸櫞酸鹽等微量糖發(fā)酵管，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。

1.7 禽大腸桿菌致病性的研究 30羽試驗(yàn)雛雞隨機(jī)分試驗(yàn)組(A組)、對照組(B組)兩組，取上述儲備菌液(1×109個/ml)分別接種A組15羽七日齡雛雞，每只雛雞于頸部采取皮下注射3ml菌液。B組雛雞分別在相同部位皮下接種3ml滅菌生理鹽水。記錄兩組雛雞初始體重，然后將其置于33℃左右燈光取暖的溫室中，按照(8g/只)集中供給全飼料，全天候供水，每天上、下午各一次記錄并拾取死亡雛雞個數(shù)，剖檢，拍照，采取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟用10%福爾馬林固定48h以上留做病理切片制作觀察，同時每日稱量殘存雛雞體重。飼養(yǎng)7d后，將剩余存活雛雞處死。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及剖檢變化 病雞表現(xiàn)為精神沉郁、翅膀下垂，呼吸困難等臨床癥狀。剖檢病死雞嗉囊積食，肝腫大，膽囊擴(kuò)張(圖A)，可見胸腔有少量纖維素性滲出物或卵黃樣滲出物，卵黃吸收不良(圖B)；肝臟淤血，脂肪變性呈土黃色腫大，膽囊擴(kuò)張(圖C)；腺胃漿膜面有點(diǎn)狀出血(圖D)，肌胃外觀沒有明顯病變。疑似禽致病性大腸桿菌侵襲。

圖A：病死雞嗉囊積食，肝腫大，膽囊擴(kuò)張

圖B：胸腔有少量纖維素性滲出物，卵黃吸收不良

2.2 細(xì)菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)檢查 MAC上18h后呈現(xiàn)紅色菌落；PC上圓形凸起、光滑、濕潤、半透明、灰白色菌落；EMB上黑色帶金屬光澤菌落；SS培養(yǎng)基一般不生長，部分生長者較差，生長者為紅色菌落。肉湯均勻混濁，管底有粘性沉淀，液面管壁有菌環(huán)。在以上培養(yǎng)基上培養(yǎng)形態(tài)與大腸桿菌的形態(tài)相一致。革蘭氏染色鏡檢見陰性中等大小、兩端鈍圓桿狀紅色細(xì)菌。與大腸桿菌形態(tài)相符，可確診此病例主要病因之一為大腸桿菌感染。

圖C：肝臟腫大呈土黃色，并見淤血，膽囊擴(kuò)張

圖D：腺胃漿膜面有點(diǎn)狀出血點(diǎn)

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果 分離菌的生化鑒定結(jié)果如表1所示，符合大腸桿菌生化特征，能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇及蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。

表1 分離菌株的生化試驗(yàn)

2.4 致病性實(shí)驗(yàn) 禽大腸桿菌致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。結(jié)果所示該大腸桿菌屬于高致病毒株，嚴(yán)重影響雛雞的生長發(fā)育以及成活率，對禽類危害極大。

表2 致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計 (只、g)

2.5 雛雞臨床癥狀及剖檢結(jié)果

圖(E-F)：試驗(yàn)組病雛精神沉郁，羽毛凌亂，雙翅下垂，部分雛雞眼睛緊閉

圖(G-H)：試驗(yàn)組雛雞有典型的氣囊炎、肝周炎、心包炎。氣囊混濁，心臟被大量纖維素包裹，肝臟表面也覆蓋一層黃色纖維素薄膜，可剝離

2.6 雛雞病理切片

圖(I-J)：腎有壞死灶，高倍鏡下可見腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性、空泡變性

圖(K-L)：心外膜表面有一層纖維素膜包被，心肌細(xì)胞明顯變性壞死

圖(M-N)：肝臟出現(xiàn)很多壞死灶并出現(xiàn)大量異嗜性顆粒細(xì)胞

3 討論

目前，雞大腸桿菌病是近年來嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的主要疾病之一，大腸桿菌能感染各種年齡的家禽，但多發(fā)生于幼齡家禽，特別是雛雞的發(fā)病率和病死率均較高，本研究通過臨床診斷、細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗(yàn)等對濰坊市壽光市某雞場送檢的15只疑似大腸桿菌病感染的病死雞的病因進(jìn)行了系統(tǒng)地實(shí)驗(yàn)室檢測分析，初步判定為大腸桿菌感染致死，同時對分離純化的細(xì)菌進(jìn)行了雛雞接種攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明分離菌株具有高致病性，感染雛雞后很快表現(xiàn)出臨床癥狀，剖檢病變典型，病理組織學(xué)檢查表明各組織器官均有變性壞死、炎性細(xì)胞浸潤病變，該項(xiàng)研究不僅為禽大腸桿菌病進(jìn)一步提供了臨床病理學(xué)資料，而且為臨床上雛雞等多種動物的大腸桿菌病的診斷和防治提供理論依據(jù)，對雛雞的健康養(yǎng)殖具有重要的指導(dǎo)意義。

[1] 馬興樹, 范翠蝶, 夏玉龍. 禽致病性大腸桿菌研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2013, 02∶ 169-174.

[2] 賈雪波, 盛中偉, 肖芹等. 山東、安徽部分地區(qū)2016年禽致病性大腸桿菌的分子流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國家禽, 2016, 36(19)∶ 71-74.

[3] DOU X H,GONG J, HAN X G, et al. Characterization of avian pathogenic Escherichia coli isolated in eastern China[J]. Gene, 2015(10)∶ 12.

[4] 白灝, 冀輝, 韓先干等. 禽致病性大腸桿菌江蘇、安徽分離株的生物學(xué)特性分析[J]. 微生物學(xué)通報, 2013, 40(7)∶ 1315-1322.

[5] 胡林, 劉曉燕, 王顥錦等. 華東部分地區(qū)禽致病性大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分群及毒力相關(guān)基因的檢測[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2014, 46(1)∶ 9-14.

S853.61+2

A

1007-1733(2017)03-0008-02禽致病性大腸桿菌(Avain Pathogenic Escherichia. coli，APEC)是引起雞、火雞及其他禽類局部或全身性大腸桿菌病的病原，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要細(xì)菌性傳染病之一[1]。近年來，隨著養(yǎng)禽業(yè)向集約化、規(guī)?；较虬l(fā)展，禽大腸桿菌病經(jīng)常發(fā)生，對養(yǎng)禽業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。不同品種、不同日齡的雞一年四季均能感染此病，但以冬末春初和霉雨季節(jié)最為常見，20～45

2016-11-21）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(SDAIT-13-011-05)；山東省濰坊市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃(2015GX042)。

*通訊作者